Proteína quinase C-delta inibidor do Peptide formulação utilizando nanopartículas de ouro

Anteriormente nós usamos um híbrido de peptídeo de nanopartículas de ouro para entregar por via intravenosa um peptídeo sintético, inibidor da proteína quinase C-delta, que reduziu a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia-reperfusão. Aqui nós mostramos o protocolo detalhado da formulação da droga. Outros peptídeos intracelulares podem ser formulados da mesma forma.

Inibidor de proteína quinase C-delta (PKCδi) é uma droga promissora para prevenir lesões de isquémia-reperfusão-induzida do órgão. Isso geralmente é conjugado a um célula-penetrante do peptide, TAT, para entrega intracelular. No entanto, TAT demonstrou atividades biológicas inespecíficas. Nanopartículas de ouro (PNB) podem ser usadas como portadores de entrega de droga sem toxicidade reconhecida. Portanto, usamos um híbrido de GNP/peptídeo para entregar PKCδi. Dois curtos peptídeos (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW), em uma relação de 95:5, foram utilizados para modificar as propriedades da superfície do PNB. PNB conjugados com PKCδi (GNP/PKCi) são estáveis em água destilada, 0,9% de NaCl e fosfato salino (PBS) contendo albumina de soro bovino ou soro fetal bovino. Injeção intravenosa de GNP-PKCi anteriormente foi mostrada para prevenir lesões de isquémia-reperfusão do pulmão. Este artigo descreve um protocolo para formular o GNP/PKCi e avaliar as propriedades físico-químicas do GNP/PKCi. Nós usamos métodos semelhantes para formular outras drogas baseado em peptídeo com PNB. Este artigo espero que vai chamar mais atenção para esta tecnologia de entrega de droga intracelular romance e suas aplicações em vivo.

Transplante de pulmão salva pacientes com estágio final de doença pulmonar¹. No entanto, sérias complicações após transplante de pulmão permanecem um obstáculo. Nas fases iniciais após transplante pulmonar, disfunção primária do enxerto é a complicação mais nocivos¹, e sua principal causa é isquemia-reperfusão (IR)-induzida de lesão pulmonar aguda².

Sob fria preservação, metabolismo em um pulmão de doador é restrito a um nível muito baixo. No entanto, espécies reativas de oxigênio e síntese de óxido nítrico são ativados devido a cessação do fluxo de sangue³. Após transplante, circulação de sangue é restaurada, e espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico gerado durante a isquemia fria aumentar a inflamação e célula morte, resultando em lesão tecidual.

Para evitar lesões IR, inibidor de proteína quinase Cδ (PKCδi) tem sido usado no coração, cérebro e pulmão^4,5,6,7,8. Estes estudos mostraram que PKCδi diminuição da inflamação e apoptose durante a reperfusão. Ele também impediu a lesão pulmonar de IR em ratos e em um modelo de transplante de pulmão⁶. PKCδi é geralmente conjugado com um célula-penetrante do peptide, TAT, para entrega intracelular. No entanto, ficou demonstrado que o peptídeo TAT sozinho tem efeitos biológicos não-específica, incluindo a promoção da angiogênese, apoptose e inibição de várias citocinas^9,10,11. Nanopartículas, pequenas partículas que variam de 1 a 100 nm de diâmetro¹², tem sido explorado como candidatos para facilitar a entrega de drogas¹³. Em particular, nanopartículas de ouro (PNB) são consideradas como não-invasivo e não tóxico. Portanto, nós desenvolvemos o PNB como portadores de entrega de droga para drogas baseado em peptídeo^14,15.

A superfície do PNB pode ser manipulada para aplicações específicas, tais como reconhecimento molecular^16,17, sensoriamento químico¹⁸, imagem¹⁹e entrega da droga. Foi desenvolvido um sistema híbrido de GNP/peptídeo, contendo 20 nm PNB e dois peptídeos curtos (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW) na proporção de 95:5, para modificar as propriedades da superfície do PNB. O peptídeo de P2, com o ácido glutâmico carregado negativamente (E) no final, estabiliza o PNB em solução aquosa, e o peptídeo P4, com o triptofano hidrofóbico (W), no final, ajuda dos PNB entrada em células¹⁴. O resíduo de cisteína (C) no terminal N destes peptídeos contém um grupo tiol que pode conjugar para as superfícies de ouro¹⁴. Este híbrido de peptídeo/PIB era mais usado para entregar PKCδi (CSFNSYELGSL). A relação molar otimizada de P2:P4 para PKCδi é 47.5:2.5:50. PNB conjugados com PKCδi (GNP/PKCi) são estáveis em água destilada, 0,9% NaCl e PBS contendo Albumina bovina ou soro fetal bovino¹⁴. Injeção intravenosa de GNP/PKCi foi mostrada para prevenir lesões de isquémia-reperfusão do pulmão¹⁵. Este artigo descreve um método para a formulação de GNP/PKCi e descreve como avaliar as propriedades físico-químicas do GNP/PKCi. Nós usamos métodos semelhantes para formular outras drogas baseado em peptídeo conjugadas a GNP^20,21,22. Esperamos que este artigo vai chamar mais atenção para esta formulação romance para entrega de drogas intracelular.

1. preparação de soluções de peptídeo

1. Recuperar os peptídeos (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) do congelador-20 ° C e descongelar à temperatura ambiente (RT).
   Nota: Mantenha o frasco fechado para evitar umidade de condensação sobre os peptídeos.
2. Pesa 0,01 g de cada peptídeo em uma microescala. Colocar cada peptídeo em um tubo cônico separado de 50 mL.
3. Adicione 18,74 mL de água desionizada (DI) para o tubo de P2.
4. Adicione 16,93 mL de água Desionizada ao tubo de P4.
5. Adicione 8,21 mL de acetonitrilo 50% diluído em água para o tubo de PKCδi.
6. Vórtice brevemente as soluções de peptídeos. Colocar os tubos cónico de 50 mL em um sonicador (40MHz) por 5 min.
7. Traga as soluções de peptídeos para uma armário de biossegurança. Todas as soluções de peptídeo preparadas devem ser de 1 mM.
8. Transferi 1 mL de cada solução de peptídeos para um novo tubo cónico de 50 mL. Adicionar 19 mL de água Desionizada para os tubos de P2 e P4 e adicionar 19 mL de acetonitrilo de 50% para o tubo de PKCδi, tal que cada solução é diluída a 50 µM e armazenada no próprio tubo.

2. formulação de GNP/PKCi

1. Peptídeos devem ser adicionados à solução GNP enquanto ainda no BSC
2. Adicione 475 μL de P2, 25μL de P4 e 500 μL de solução de δPKCi em um tubo de 15 mL. Adicione 9 mL de solução de GNP 20 nm (7.0x10¹¹ partículas/mL) para o mesmo tubo de 15 mL.
3. Saída do gabinete de segurança biológica. Enrole o tubo de 15ml com folha de alumínio. Deixá-lo em um shaker em RT durante a noite.
4. Devolver as amostras para a biossegurança do armário. Alíquotas de 1ml de GNP/PKCi em cada microtubos de 1,5 mL.
5. Centrifugar os tubos em uma microcentrífuga por 30 min a 15.294 x g a 4 ° C.
6. Remova o sobrenadante de cada tubo em um armário de biossegurança.
   Nota: Tenha cuidado ao remover o sobrenadante, garantindo simultaneamente que a pelota GNP permanece intacta e não é aspirada.
7. Ressuspender o sedimento no solvente desejado de acordo com a concentração necessária. Solventes aplicáveis podem ser DI água, PBS e 0,9% NaCl.
   Nota: A partir de 1 mL de GNP/PKCi, a pelota GNP contém 6,3 x 10¹¹ partículas, com base na concentração GNP fornecida pelo fabricante. Para administrar a 1,3 x 10¹² partículas em 500 µ l de 0,9% NaCl, acrescentamos µ l 232 de 0,9% NaCl para cada um dos três pelotas. Após a partilha-los juntos, então você pode acumular 500 µ l de solução de GNP/PKCi.
   Nota: Misture o desejado solvente bem antes de diluir a pelota GNP/PKCi, caso contrário o GNP/PKCi agregará.

3. avaliação da solubilidade de híbrido de GNP/PKCi

1. Despeje uma cubeta do acryl, 0,5 mL de solução de GNP/PKCi. Colocar a cubeta do acryl em um espectrofotômetro UV-Vis e testar o pico de absorção¹⁵.

Deve ter cuidado para avaliar as propriedades biofísicas do GNP/PKCi híbrido, como GNP tende a agregação em solvente. Quando GNP é agregado, a cor da solução muda de rosa para roxo (Figura 1a). Espectrofotômetro UV-Vis é capaz de detectar as alterações mais sensìvel. Se o GNP/PKCi não é agregado o pico de absorção deve ser em 525 nm (Figura 1b). Se o PIB é agregado, o pico de absorção vai ser deslocado para a direita. Como um método alternativo de análise, quando agregados formaram a densidade de ΔOptical (ΔOD = OD em 525 nm - OD a 440 nm) diminui.

Figura 1 : Qualidade de GNP/PKCi. (A) devidamente preparados GNP/PKCi (à esquerda) de coloração rosa. GNP/PKCi agregado aparece luz roxa (à direita). (B) preparação de GNP/PKCi bom é estável em água, PBS, ou em solução de NaCl 0,9%. Leituras sobre um espectrómetro de UV-Vis indicaram que o pico de absorção em 525 nm em todas as soluções. (C) um exemplo de preparações de GNP/PKCi bons e ruins. Quando o PIB foi agregado, o pico de absorção foi deslocado para a direita. Além disso, ΔOD diminuído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para garantir a formulação adequada, é fundamental que a solução de δPKCi sofre a etapa sonication descrita no 1.6. ΔPKCi sequência de peptídeo contém partes hidrofóbicas, então um sonicador auxilia na dissolução de PKCi na solução 50% acetonitrila. Além disso, é muito importante misturar o solvente meticulosamente, conforme descrito na etapa 2.7.  O híbrido de GNP/PKCi não vai ser formulado bem se estas etapas não forem feitas corretamente, devido a agregação da δPKCi peptídeo²³.
 
Formulação de drogas PNB oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, dos PNB podem ser facilmente sintetizados em tamanhos bem controlados, que variam de alguns nanómetros a ~ 100 nm. Geralmente, os PNB menor porte podem entregar drogas em células mais eficientemente do que os maiores como os mais pequenos podem facilmente se espalham seu destino região²⁴.  Em segundo lugar, o PNB são tóxicos in vitro e in vivo a²⁵, tornando-os portadores de droga segura.  Terceiros, hidrofóbicas drogas podem ser carregadas para o PNB modificado²⁶.  Adiante, a química de superfície do PNB é facilmente modificada para aplicações específicas. Em nossos estudos, dois peptídeos curtos são usados para modificar a superfície do GNP, para estabilizá-los, em condições fisiológicas e transmitir novas bioactivities. Os peptídeos foram cuidadosamente concebidos com três regiões, incluindo a ligação de ouro, espaçamento e regiões funcionais.  Especificamente, o N-terminal do peptide tem resíduo de cisteína (C) que contém o grupo tiol que pode vincular com ouro. A parte do meio tem quatro resíduos hidrofóbicos alanina para promover o assembly de peptídeo em um monolayer densamente sobre os PNB. O aminoácido no terminal C é um ácido aminado funcional apontando para fora, que pode ser usado para manipular as propriedades da superfície dos PNB. A relação 95:5 entre estes dois peptídeos sistemicamente foi selecionada em um anterior estudo¹⁴. A relação entre PKCi e P2/P4 peptídeos também sistemicamente foi testada e selecionado¹⁵.

Por outro lado, o sistema de entrega de droga GNP tem limitações. PNB não são o tipo de células ou tecidos específicos. PNB são acumulados principalmente no pulmão, fígado e baço após administração intravenosa de^28,de^27,29. Até agora, esta fórmula só foi testada em cultura de células e animais pequenos modelos. Para traduzi-lo para a aplicação clínica, estudos em modelos animais grandes e sua farmacocinética, toxicidade potencial e distribuição de tecido necessita de ser determinado.

Os autores não têm nada para divulgar este projeto.

Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação do canadense institutos de pesquisa em saúde (PJT-148847), Ministério de pesquisa e inovação de Ontário (RE-08-029) e Canadá primeira pesquisa do programa de excelência, medicina de Design na Universidade de Toronto. Dr. Mingyao Liu é James e Mary Davie cadeira em lesão pulmonar, reparação e regeneração.