Glycyrrhizae Radix nöroprotektif etkilerinin değerlendirilmesi et Rhizoma ekstresi kullanarak bir geçici orta serebral arter tıkanıklığı fare modeli

Bu çalışmada, bir orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) fare modeli kurarak daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için varolan deneysel yöntemini değiştirmek. Glycyrrhizae Radix, sözlü yönetimi et köksap (GR) metanol özü (GRex), kontur indüksiyon, takip toplam infarktüsü cilt tedavi edilmemiş kontrol grubuna göre önemli ölçüde azalmıştır.

İskemi kalp krizi sonra serebral kan akımı reperfüzyon takip sinir hücrelerinin ölüm ve beyin doku kaybına yol açar. Kontur çalışmak için en sık kullanılan hayvan modeli orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modelidir. Hatta aynı deneysel hayvan türleri benzer MCAO koşullar altında kullanıldığında önceki araştırma çalışmaları farklı enfarktüsü boyutları bildirdi. Bu nedenle, bu tutarsızlık yönelik olarak geliştirilmiş bir deneysel yöntem geliştirdik. Fareler bir filament tıkanıklığı malzemesi olarak insan kontur koşulları taklit kullanarak MCAO tabi tutuldu ve filament kalınlığı daha tekrarlanabilir infarktüsü birim kurmak için optimize edildi. Metanol ile tedavi fareler ayıklamak Glycyrrhizae sayı tabanı et kontur indüksiyon takip köksap (GRex) önemli ölçüde azalan toplam infarktüsü birim gösterdi ve hayatta kalma artan sayı hücreleri tedavi edilmemiş kontrol grubuna göre. Bu Deneysel protokol başarıyla değiştirildi ve tekrarlanarak iskemik inme faydalı GRex etkisini gösterdi.

Beyin hasar iskemi ve reperfüzyon serebral kan akımı neden sinir hücrelerinin ölüm ve beyin doku kaybına yol açar. Bu tür bir beyin hasarı serebrovasküler hastalıklar obezite, hipertansiyon ve diyabet^1,2gibi metabolik hastalıkların yayılması nedeniyle artan yaygınlığı ile artmaya devam ediyor. Yaşlı hastalarda inme ile kesin sayısı dünya çapında önemli ölçüde artmıştır ve uzun vadeli Engelli kez bırakan bu hastalar için tıbbi bakım maliyeti büyük bir toplumsal yüktür. Bu nedenle, ikincil Engelli ekonomik yük^1,2azaltmak mümkün olduğu kadar hafifletilmiş.

En sık kullanılan kemirgen beyin enfarktüsü içinde iskemik inme^3, neden olan kan akışını engellemek için bir silikon kaplı Cerrahi dikiş filaman ile MCA tıkandı orta serebral arter (MCA) tıkanıklığı (MCAO) modeli modeldir ⁴. tıkanıklığı malzeme içi luminal filaman ekleme süresi işleyerek tıkanıklığı zaman ve kalıcılığı kontrol sağlar gibi bir filament kullanarak.

Önceki çalışmalar, aynı kemirgen MCAO model kullanıldığında bile beyin enfarktüsü hacmi düşük tekrarlanabilirlik çalışmaların neden deneyler arasında değişir göstermiştir. Tekrarlanabilirlik artırmak için deneyde kullanılan filaman nane kalınlığı optimize. Serebral iskemik dönemi ve 60 dk uzun bir iskemik süre hacimsel bölgesinin izin gösterdi indüklenen infarktüsü ön bir çalışmanın sonuçlarını gözlenen ve sayısal beyin dokusuna zarar görmüş.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), olarak da bilinen meyan kökü kurutulmuş kök ve Glycyrrhiza uralensis köksaplar oluşur ve G. glabra. Bu Çin ve Kore geleneksel tıpta bir gıda katkı maddesi ve^5,6,7olarak medicinally dahil olmak üzere çeşitli amaçlarla kullanılmıştır.

Bir önceki çalışmada⁸GR metanol özü (GRex) MCAO farelerde bir anti-apoptotik etki gösterdi ile ön arıtma önemli önlenmesi B hücreli lenfoma 2 protein ifadesi azalma (Bcl-2) ve Bcl ekstra büyük (Bcl-xL) dahil olmak üzere. Bu çalışma sonrası enfarktüsü tedavi GRex ile etkili bir şekilde MCAO bağlı serebral hasar enfarktüsü hacmindeki azaltılmış Eğer belirlemede verimlilik değerlendirerek tekrarlanabilirlik geleneksel MCAO fare modeli geliştirmek için yapılmıştır.

Hayvanları içeren tüm yordamları Pusan Milli Üniversitesi (onay numarası, PNU-2016-1087) Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Bir grafik genel bakış bu çalışmanın Şekil 1' de gösterilen.

1. hazırlık ve GRex İdaresi

Not: Bu çalışmada kullanılan GR ticari ilaç şirketinden satın alınmıştır.

1. 200 gr. GR 2000 mL metanol yerleştirin ve oda sıcaklığında (25 ° C) için 5 gün kuluçkaya.
2. 0,26 mm kalınlık ve 5 µm gözenek boyutu ile filtre kağıdı kullanarak karışımı filtre ve süpernatant kaldır. 1000 mL metanol GR kalıntı ekleyin ve tekrar filtre.
3. İki supernatants birleştirmek, filtre kağıdı ile filtre, vakum altında konsantre ve GRex üretmek için kalıntı şeytanibir.
4. Dimetil sülfoksit (DMSO), % 0,9 fizyolojik serum seyreltik GRex dağıtılması ve 0,45 µm şırınga filtre ile filtre. Sonra DMSO son konsantrasyonu < %5 için ayarlayın.
5. GRex (300 mg/kg vücut ağırlığı) 1 h MCAO oral gavaj yolu ile reperfüzyon sonra yönetmek. Fizyolojik serum (10 mL/kg vücut ağırlığı) sadece için normal grubu ve kontrol grubu, sırasıyla seyreltilmiş DMSO yönetmek.
   Not: Bu deneyde kullanılan GRex konsantrasyon bizim önceki çalışma⁸ile etkin konsantrasyon göre belirlendi.

2. fare modeli MCAO

1. Kullanım erkek C57BL/6 fareler 6 hafta yaşlı ve 22-25 g ağırlığında standart chow ve su ile ev ücretsiz giriş imkanı ile tüm hayvanlar onları ısı kontrollü (22 ± 1 ° C) olan bir ortamda ve bir 12 h ışık/karanlık döngü sağlar.
   1. Sham işletilen normal, denetim ve GRex tedavi gruplarından oluşmalıdır fareler her, altı farelerin gruplara bölün.
   2. MCAO ameliyatı (modifikasyon yöntemi Koizumi vd. ⁹) denetim ve GRex tedavi gruplar stereo mikroskop kullanarak.
2. İnhalasyon anestezi % 70 N₂O %2 isoflurane ve % 30 O₂kullanarak farelerde neden. Fare kuyruğunu için uygulanan mekanik uyarana yanıt vermemeye başlar zaman anestezi yeterli kabul edilir. 36,5 ± 0,5 ° C sıcaklık-holding battaniye bir termometre için bağlı bir vücut kullanarak, farelerin vücut ısısını korumak.
3. Sandıklar tüm saç kaldırmak ve farelerin tıraş tarafından boyunları saç dökücü krem, kullanımı ile takip betadin fırçalayın için iki kez alkol ile alternatif ile cilt cerrahi sitenin dezenfekte, sonra bir kesi yaklaşık 2 cm uzun ile cerrahi bıçak boyun ortasına. Dikkatli bir şekilde sol ortak karotid arter (LCCA), dış karotid arter ve bağ dokuları çevreleyen gelen şahdamarını dalı izole et.
4. Dış karotid arter ve ortak karotid arter ile cerrahi dikiş (4-0 ipek sütür, yarım aksaklık düğüm) geçici olarak kan akışını bloke etme işlemi sırasında iç karotis arter ligate.
5. Sol MCA kökenine şahdamarını aracılığıyla silikon kaplı naylon dikiş (8-0 monofilament, 11 mm uzun) yerleştirin. Filaman 0.10-0.12 aralığına silikon kaplı parçası kalınlığını ayarla mm.
6. Lazer Doppler akış ölçer kullanarak MCA içinde (rCBF) göreli beyin kan akımında azalma ölçmek. Ne zaman rCBF < % 20'si istirahat koşulu değerleri tüm iskemik döneminde yapılmaktadır MCAO teyit edilecektir.
7. Serebral arter tıkandı ise damar için 2 h için eklenen filaman düzeltin ve sonra dikkatle filaman reperfüzyon 22 h için kan akışı geri çekilme. Cilt tarafından 5 yerlerde (3-0 ipek sütür, iki yarım aksama düğüm) dikiş dikiş ve anesteziden uyandırmak her fare izin.
8. Normal grubunda aşağıdaki yukarıda aynı yordamı (2.4 kadar), bir sahte işlemi aşağıdaki özel durum ile gerçekleştirin. Ortak karotid arter ligate ve kazıma kas ve deri dikiş.

3. ölçü biriminin bozuk beyin dokusunun

1. Sonra ötenazi CO₂ inhalasyon ile beyin hasarı ölçüm için farelerin, tüketim fare Iris cerrahi makas ve açılı forseps kullanarak MCAO başlangıçlı sonra 24 h beyin.
   1. Makas kullanırken başını kaldırdıktan sonra kafatası derisini üzerine çevirmek için baş orta hat derideki kesik olun.
   2. Çeper açılı forseps ile kır, dura soyulması aynı zamanda önemli ve kafatası dikkatle beyninden izole etmek.
2. Kesim bölümler (1 mm kalınlığında) eksize dokusuna bir fare beyin matrisi kullanarak ve bölümler için % 2 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) 17 dk bir çözümde leke.
3. En az 2 h için % 10 formalin bölümlerde düzeltin ve sonra onları bir dijital kamera ile fotoğraf. TTC nekrotik alanlar beyaz olacak iken uygun doku kırmızı leke tespit edilecektir.
4. Analiz ve beyin enfarktüsü alanının ImageJ kullanarak her bölümün ölçmek.

4. Hematoksilen ve eozin (H & E) ve kresil menekşe histolojik bölümlerini boyama

1. CO₂ inhalasyon tarafından fareler histolojik çalışma için ötenazi ve onları 10 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) tarafından takip transcardially fosfat tamponlu tuz (PBS), 10 mL ile sıvı. Yukarıda (3.1) olarak aynı yordam kullanılarak beyin izole ve beyin 10 mL % 30 sukroz ve gece bırakın.
2. Beyin dokusu en uygun kesme sıcaklığında (OCT) bileşik katıştırmak ve coronally bir cryostat kullanarak 15 µm kalınlığında bölümlere dilim. Hematoksilen ve eozin (H & E) veya kresil mor ile boyama tarafından takip cam slaytlardaki bölümler bağlayın.
3. % 80 etanol 1dk hematoksilen solüsyona 5 min için boyama tarafından takip için cam slaytları bırakın.
   1. İki kez % 1 asit alkol slaytları batır, doymuş Lityum Karbonat çözüm için 30 bırakın s, 30 s ve sonra counterstain 30 eozin çözüm için musluk suyu ile yıkayın s.
   2. Slaytları dokunun suyla durulayın, % 95 ve mutlak etanol içinde arka arkaya emmek.
   3. Slaytları kuruması, ksilen en az 10 dk için temizleyin ve montaj orta kullanarak coverslips bağlayabilirsiniz.
4. Cam slaytları bir slayt üzerinde sıcak daldırma gecede kloroform ile seyreltilmiş % 50 Etanol ve ardından en az 1 h için yerleştirin.
   1. % 0.1 kresil violet 40 ° C kuru fırında 10 dakika ile slaytlar leke.
   2. % 95 etanol 30 dk için bırakın, sonra mutlak etanol için 2 kez kurutmak.
   3. Ksilen 5 min için 2 kez temizleyin, sonra hava kuruduktan sonra montaj orta ile monte.
5. Bir mikroskop kullanarak, sonra MCAO kaynaklı beyin hasarı oluştu histolojik değişiklikler gözlemlemek.

5. istatistiksel analiz

1. Deneysel sonuçlar anlamına gelir ± standart sapma hızlı ve bir tek yönlü veri analiz yazılımı kullanarak Tukey'nın post hoc Analizi-tarafından takip varyans analizi (ANOVA) kullanarak gruplar arasında istatistiksel anlamlılık belirlemek.
2. İstatistiksel anlamlılık pbir ayarla-< 0,05 değer.

Kontrol grubunda nispeten geniş hasarlı bölgeleri görülmektedir, ancak sahte işletilen normal grubunda hiçbir beyin enfarktüsü görülmektedir. Fareler (Şekil 2) yönetilen 300 mg/kg GRex MCAO model grubunda, hasarlı bölgeyi istatistiksel olarak anlamlı bir azalma görülmektedir.

Histolojik değişiklikler iskemik beyin bölümleri H & E veya kresil mor ile boyama tarafından incelenmiştir. Kresil menekşe boyama hipokampal nöronlar¹¹toplam sayısını tahmin etmek için kullanılan, ancak H & E boyama yapısal bilgi ve işlevsel hücre¹⁰hakkında bilgi sağlar. Böylece, H & E veya kresil mor yoğunluğu, ImageJ yazılım (Şekil 3A), kullanarak ölçülen sağlar hücre hayatta kalma bir dizin. Normal Grup (Şekil 3B, 3 C) göre kontrol grubunda H & E ve kresil mor yoğunluklarda önemli ölçüde boyama azaltın. GRex tedavi grubu büyük histolojik bütünlüğü, kontrol grubu (Şekil 3C) daha az nöronal hücre ölümü ima gösterir. Bu sonuçlar GRex iskemi/reperfüzyon-indüklenen beyin hasarı karşı güçlü nöroprotektif etkileri olduğunu gösterir.

Resim 1 . Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli ve tedavi şeması Glycyrrhizae Radix metanol özü ile et köksap (GRex). Fareler 300 mg/kg GRex 1 devam edildi MCAO reperfüzyon sonra s ile tedavi için 2 h. fareler euthanized 24 MCAO başladı ve daha sonra hasat Beyin dilimleri bir derin dondurucu protein tahlil için depolanan veya enfarktüsü için TTC çözüm ile lekeli sonra h vardı. ölçüm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Glycyrrhizae Radix özü metanol efektleri gösterme (A) beyin bölümlerinin temsilcisi görüntüleri et köksap (GRex) tedavi sonrası Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO)-indüklenen beyin enfarktüsü birimleri ve 300 mg/kg GRex 1 h ile (B) tek tedavi MCAO reperfüzyon önemli ölçüde enfarktüsü birimleri bastırılmış sonra. Sonuç anlamına gelir ± SDs. ## #p sunulmaktadır < 0,001 vs normal Grup, ** p < 0,01 vs kontrol grubu; n = 6 grup başına. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . (A) Hematoksilen ve eozin (H & E) temsilcisi görüntüleri- ve kresil mor lekeli beyin bölümleri ve (B, C) renk Glycyrrhizae Radix metanol özü etkilerini değerlendirmek için kullanılan yoğunluklarda et köksap (GRex) üzerinde orta beyin serebral arter tıkanıklığı (MCAO)-yaralı fareler. Histolojik bütünlüğü ve doku hasarı fare beynindeki biçilen kullanarak (B) H & E veya (C) kresil 1 h boyama Menekşe post-MCAO reperfüzyon vardı. H & E lekeli bölümleri boyama kırmızı nükleer hasar gösterir. Kresil mor ile boyalı nöronlar mor lekeli. Kontrol grubuna nazaran daha az nöronal hücre ölümü gösteren GRex tedavi grup daha iyi histolojik bütünlük gösterdi. bir, H & E-lekeli; b, kresil mor lekeli; c ve d, büyütme ve b, anılan sıraya göre. -Den sonuçlanmak are anlamına gelir ± SDs. ## #p < 0,001, ve * p < 0,05 vs normal ve kontrol grubu; n = 6 grup başına. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Metabolik hastalıklar gibi kronik hipertansiyon, şeker hastalığı ve hiperlipidemi, kontur için büyük risk faktörleri olan artan yaygınlığı ile inme önleme ve tedavi tıbbi araştırma^12, önemli bir alan haline gelmiştir ¹³. dil ve hareketi kalp krizi sonrası açıkları şiddetle doku¹⁴ beyin kalmasına ve yoksul bir yaşam kalitesi hastalar ve onların aileleri¹⁵için hasar derecesi ile ilişkili. İlaç tedavileri etkinliğini incelemek için insan hastalığında oluşan alanındakiyle aynı patolojik değişiklikleri içerir inme uygun bir hayvan modeli kullanmak önemlidir. MCAO modeli trombotik vuruş serebral atardamar damarları tıkayan tarafından taklit eder. Nispeten tekrarlanabilir ve minimal invaziv^16,17,18,19olduğu için yaygın olarak kullanılır.

Ancak, bir karşılaştırma aynı dinlenme için indüklenen beyin enfarktüsü alanının çeşitli araştırmacılar tarafından bildirilen süresi toplam infarktüsü birim çalışmaları arasında değişir ortaya koymaktadır. Bu tıkanıklığı malzeme kullanılan ve cerrahi işlem farklılıklar nedeniyle olduğu sonucuna vardı. MCAO kemirgen modeli son derece tekrarlanabilir kabul rağmen bu nedenle, bu her zaman böyle tekrarlanabilirlik elde etmek mümkün değildir. Bu nedenle, fare MCAO modeli bizim ön çalışma ve önceki rapor⁸aracılığıyla kullanılan filamentler kalınlığı optimize.

Diğer çalışmalar ne zaman 60 dk (veri gösterilmez) iskemi indüklenen TTC boyama herhangi bir beyin enfarktüsü olmadığını göstermiştir ki bu bizim ön çalışma en belirgin sonucu kıyasla. Düz MCAO farelerde, 90 ve 120 dk bizim sonucu olan diğer araştırmalarda daha düşük bir enfarktüs ses gösterdi tabi. Bu çalışmanın bir sınırlama biz henüz kadar bu sonuçlar kesin nedeni tespit değil mi; Ancak, biz daha fazla çalışmalar bu fenomen keşfetmek planlıyoruz.

Çok sayıda çalışma GR veya bileşenlerinden antitümör, antimikrobiyal ve anti-inflamatuar etkileri^20,21,22gibi farmakolojik etkinlikler var son zamanlarda bildirdi. Bir önceki çalışma GRex ön arıtma etkinleşmiş Bcl-2 ve Bcl-xL⁸protein ifade tarafından etkili bir şekilde caspase-9 aktivasyonu inhibe bildirdi. Ancak, önleyici tedaviler için inme inme sonrası tedavi daha az klinik olarak ilgilidir.

Bu çalışmada, hangi dayalı bir önceki çalışma⁸ MCAO fare modelinde GRex sonrası tedavinin etkinliği değerlendirilir. Temsilcisi sonuçları bölümünde gösterildiği gibi GRex tedavi sonrası yararlı etkileri toplam infarktüsü ses düzeyini azaltmayı ve MCAO kaynaklı beyin hasarı farelerde hücresel yapılar için hasar ameliorating gösterdi. GRex belirli bir eylemi mekanizmaları üzerinde sonrası iskemik beyin hasarı bulunmayan bu çalışmada, ancak bu çalışmada başarıyla kullanılan deneysel protokoller insan kalp krizi etkilerini taklit ederek bu bitkisel ilaç etkileri gösterdi.

Her ne kadar deneysel sonuçlar bu çalışmada, nöronal açığı puanı gözlenen değil (NDS) ön deneyimimizi ölçülen ve anlamlı bir fark denetimi ve GRex tedavi grupları arasında hangi nedeniyle olmuştur olduğu tahmin edilmektedir belirtilmişti kısa gözlem zaman göre inme şiddeti. Biz orta hasara neden sonra uzun süre NDS GRex tedavisinin etkileri gözlemlemek planlıyoruz.

Sonuç olarak, bir fare MCAO modelinde GRex tedavisinin nöroprotektif etkisi ile iyi tekrarlanabilirlik Bu çalışmada gösterilmiştir. Altta yatan mekanizma içinde yer alan proteinler gelecek çalışmalarda incelenmesi gerekir.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geçerli değildir.