Bewertung neuroprotektive Wirkung Glycyrrhizae Radix et Rhizoma extrahieren mit einer vorübergehenden mittlere zerebrale Arterie Okklusion Maus-Modell

In dieser Studie modifizieren wir eine vorhandene experimentellen Methode um mehr reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, durch die Schaffung einer mittleren zerebralen Arterie Okklusion (MCAO) Maus-Modell. Orale Verabreichung von Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GR)-Methanol-Extrakt (GRex) nach Schlaganfall Induktion deutlich zurückgegangen insgesamt Infarkt Volumen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppe.

Ischämie Reperfusion des zerebralen Blutflusses nach einem Schlaganfall gefolgt führt zu den Tod von Nervenzellen und Verlust von Gehirngewebe. Die am häufigsten verwendete Tiermodell zur Erforschung von Schlaganfall ist das mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) Modell. Frühere Studien haben verschiedene Infarkt Größen berichtet, auch wenn die gleichen experimentellen Tierarten unter ähnlichen Bedingungen der MCAO verwendet wurde. Daher entwickelten wir eine verbesserte experimentelle Methode um diese Diskrepanz zu beheben. Mäuse wurden MCAO mit einem Filament als Okklusion Material imitieren menschlichen Schlaganfall Bedingungen unterworfen und Filament Dicke wurde optimiert, um mehr reproduzierbare Infarkt Volumen zu schaffen. Mäuse mit einem Methanol behandelten Auszug aus Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GRex) nach Schlaganfall Induktion zeigte eine deutlich verminderte totale Infarkt Volumen und erhöhte Anzahl der Überlebenden Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppe. Das experimentelles Protokoll erfolgreich geändert und reproduzierbar demonstriert die wohltuende Wirkung von GRex auf ischämischen Schlaganfall.

Schädigung des Gehirns verursacht durch Ischämie und Reperfusion des zerebralen Blutflusses führt zu den Tod von Nervenzellen und Verlust von Gehirngewebe. Diese Art der Schädigung des Gehirns steigt mit der zunehmenden Verbreitung von zerebrovaskulären Erkrankungen, die durch die Verbreitung von Stoffwechselerkrankungen wie Adipositas, Bluthochdruck und Diabetes Mellitus^1,2. Die absolute Zahl der älteren Patienten mit Schlaganfall weltweit sprunghaft angestiegen, und die Kosten der medizinischen Versorgung für diese Patienten, die oft mit langfristigen Behinderungen zurückbleiben, ist eine große gesellschaftliche Belastung. Daher sollten sekundäre Behinderungen so weit wie möglich reduzieren die wirtschaftliche Belastung^1,2gemildert werden.

Das am häufigsten verwendete Nagetiere Modell der Hirninfarkt ist das mittlere zerebrale Arterie (MCA) Okklusion (MCAO) Modell, in dem die MCA mit einem Silikon-beschichtete chirurgische Box-Filament, Durchblutung, blockieren verschlossen ist verursacht ischämischen Schlaganfall^{3, 4}. mit einem Faden wie Okklusion Material die Kontrolle der Okklusion Zeit und Beständigkeit ermöglicht durch Manipulation der Dauer der Intra-luminalen Filament Einfügung.

Frühere Studien haben gezeigt, dass selbst wenn das gleiche Modell für Nager MCAO benutzt wird, das Gesamtvolumen der Hirninfarkt zwischen Experimente variiert, verursacht geringe Reproduzierbarkeit der Studien. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, haben wir die Dicke der Glühfaden Minze verwendet im Experiment optimiert. Die Ergebnisse einer Vorstudie zerebralen ischämischen und induzierte Infarkt hat gezeigt, dass eine ischämische länger als 60 min die volumetrische Region erlaubt beschädigt Hirngewebe beobachtet und quantifiziert werden.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), auch bekannt als Lakritze, bestehend aus den getrockneten Wurzeln und Wurzelstöcke von Glycyrrhiza Uralensis und G. Glabra. Es wird für verschiedene Zwecke, u.a. als Lebensmittelzusatzstoff und medizinisch^5,6,7in der chinesischen und koreanischen traditionellen Medizin eingesetzt.

In einer früheren Studie⁸, Vorbehandlung mit GR-Methanol-Extrakt (GRex) zeigte eine Anti-apoptotische Wirkung bei MCAO Mäusen einschließlich bedeutende Prävention aus dem Rückgang der Proteinexpression von B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) und Bcl extragroßen (Bcl-xL). Diese Studie wurde durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der herkömmlichen MCAO-Maus-Modell wird gesteigert, Bewertung ihrer Effizienz zu ermitteln, ob Post-Infarkt-Behandlung mit GRex effektiv das Infarkt-Volumen in MCAO-induzierten zerebralen Schäden reduziert.

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Ethikkommission der Pusan National University (Zulassungsnummer, PNU-2016-1087) genehmigt. Eine grafische Übersicht über diese Studie ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Erstellung und Verwaltung von GRex

Hinweis: Die in dieser Studie verwendeten GR wurde aus einem kommerziellen Pharmaunternehmen gekauft.

1. 200 g GR in 2.000 mL Methanol und 5 Tage bei Raumtemperatur (25 ° C) inkubieren.
2. Filtern Sie das Gemisch mit Filterpapier mit 0,26 mm Dicke und 5 µm Porengröße, und entfernen Sie dann den überstand. Der GR-Rückstand 1.000 mL Methanol hinzufügen und erneut filtern.
3. Kombinieren der zwei Überstände, durch Filterpapier Filtern unter Vakuum zu konzentrieren und dann Installationsprogrammen des Rückstands um GRex zu produzieren.
4. Lösen Sie der GRex in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), mit physiologischer Kochsalzlösung 0,9 % verdünnen auf und durch einen 0,45 µm-Spritze-Filter filtern. Passen Sie dann die Endkonzentration von DMSO auf < 5 %.
5. Verwalten Sie GRex (300 mg/kg Körpergewicht) 1 h nach der Reperfusion des MCAO über orale Magensonde. DMSO verdünnt in physiologischer Kochsalzlösung (10 mL/kg Körpergewicht) nur für die normale Gruppe und Kontrollgruppen, bzw. zu verwalten.
   Hinweis: Die Konzentration von GRex verwendet in diesem Experiment wurde entsprechend der Konzentration bestimmt, die durch unsere vorherigen Studie⁸aktiv war.

(2) Maus-Modell der MCAO

1. Verwendung männliche C57BL/6 Mäusen im Alter von 6 Wochen und mit einem Gewicht von 22-25 g. alle Tiere mit freiem Zugang zu standard Chow, Wasser und Haus bieten, sie in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur (22 ± 1 ° C) und ein 12 h hell/dunkel-Zyklus.
   1. Teilen Sie die Mäuse in Gruppen von jeweils sechs Mäuse, die Schein-betrieben Normal, Kontrolle und GRex Behandlungsgruppen bestehen soll.
   2. Operieren Sie MCAO (Modifikation der Methode von Koizumi Et al. ⁹) über die Kontrolle und GRex Behandlungsgruppen mit einem Stereo-Mikroskop.
2. Inhalation Anästhesie in den Mäusen mit 2 % Isofluran 70 % N₂O und 30 % O₂zu induzieren. Anästhesie ist als ausreichend angesehen, wenn die Maus reagiert nicht auf mechanischen Reiz auf seinen Schweif angewendet wird. Pflegen Sie die Körpertemperatur der Mäuse auf 36,5 ± 0,5 ° C mit einem Körper Temperatur-Holding Decke mit einem Thermometer verbunden.
3. Entfernen Sie die Haare auf der Brust und Hals der Mäuse durch das Rasieren gefolgt von Verwendung von Haarentfernungs-Creme, desinfizieren der Operationsstelle Haut mit Betadine Scrub abwechselnd mit Alkohol für zwei Mal und dann machen Sie einen Schnitt von ca. 2 cm lang mit chirurgischen Klinge in der Mitte des Halses. Isolieren Sie sorgfältig die linke gemeinsame Halsschlagader (LCCA), äußere Halsschlagader und der Zweig der inneren Halsschlagader aus den umliegenden Bindegewebe.
4. Verbinden Sie die äußere Halsschlagader und die gemeinsame Halsschlagader mit einer chirurgischen Naht (4: 0 Seide Naht, Hälfte Haken Knoten), um die Durchblutung vorübergehend zu blockieren in der inneren Halsschlagader, während des Betriebs.
5. Legen Sie eine Silikon beschichteten Nylon-Naht (8: 0 Monofile, 11 mm lang) durch der inneren Halsschlagader auf den Ursprung des linken MCA. Die Zähflüssigkeit des Silikon-beschichteten Teils des Fadens auf einen Bereich von 0,10-0,12 mm.
6. Messen Sie den Rückgang der relative zerebralen Blutflusses (rCBF) in der MCA mit einem Laser-Doppler-Durchflussmesser. MCAO wird bestätigt, wenn der rCBF auf < 20 % der ruhenden Zustand Werte während des gesamten ischämischen gehalten wird.
7. Die eingefügte Filament, das Blutgefäß für 2 h zu beheben, während die zerebrale Arterie verschlossen ist, und dann vorsichtig zurückziehen des Fadens um die Durchblutung für 22 h der Reperfusion wiederherzustellen. Naht der Haut durch Nähen an 5 Orten (3: 0 Seide Naht, zwei halbe Anhängevorrichtungen Knoten) und lassen jede Maus aus der Narkose erwachen.
8. Führen Sie im Bereich "normal" einen Schein-Vorgang nach dem gleichen Verfahren über (bis 2,4), mit folgender Ausnahme. Verbinden Sie die gemeinsame Halsschlagader und Naht die eingeschnittenen Muskel und Haut.

3. Messung des Volumens von beschädigten Hirngewebe

1. Nach der Euthanasie der Mäuse für Hirnschäden Messung mit CO₂ Einatmen Gehirne Verbrauchsteuern die Maus 24 h nach Beginn der MCAO mit Iris chirurgische Schere und abgewinkelte Zange.
   1. Nach dem Entfernen der Kopf mit einer Schere, machen Sie einen Einschnitt in der Mittellinie Haut des Kopfes, über die Haut aus dem Schädel zu kippen.
   2. Brechen Sie das Scheitelbein mit abgewinkelten Pinzette, Dura abziehen egal, zur gleichen Zeit, und dann das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel zu isolieren.
2. Schnitt die ausgeschnittenen Gewebe in Abschnitte (1 mm dick) mit einer Maus Gehirn Matrix und dann färben die Abschnitten 17 min in einer Lösung von 2 % 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid (TTC).
3. In den Abschnitten 10 % Formalin für mindestens 2 h zu beheben und dann sie mit einer Digitalkamera fotografieren. TTC werden beobachtet, um tragfähige Gewebe rot zu färben, während die nekrotischen Bereiche weiß werden.
4. Analyse und Quantifizierung der Hirninfarkt Bereich jedes Abschnitts mit ImageJ.

4. Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Cresyl violette Färbung der histologischen Abschnitte

1. Einschläfern Sie die Mäuse für die histologische Untersuchung von CO₂ Inhalation und Durchspülen sie Transcardially mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 10 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA). Das Gehirn mit dem gleichen Verfahren wie oben (3.1) zu isolieren und das Gehirn in 10 mL 30 % Saccharose über Nacht Tauchen.
2. Das Hirngewebe in optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte einbetten und koronal in 15 µm dicke Abschnitte mit einem Kryostat schneiden. Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern, gefolgt von Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) oder Cresyl violett.
3. Tauchen Sie den Objektträger in 80 % Ethanol für 1 min, gefolgt von Färbung Hämatoxylin Lösung für 5 min.
   1. Folien in 1 % Säure Alkohol zweimal tauchen, Tauchen in gesättigten Lithiumcarbonat Lösung für 30 s, waschen mit Wasser aus dem Wasserhahn für 30 s, und dann Gegenfärbung in Eosin-Lösung für 30 s.
   2. Die Folien in Leitungswasser abspülen, Einweichen in 95 % und absoluten Ethanol nacheinander.
   3. An der Luft trocknen der Folien, in Xylol mindestens 10 min lang klar und befestigen Sie dann die Eindeckmittel mit Deckgläsern.
4. Legen Sie den Objektträger auf einer Folie wärmer für mindestens 1 h, gefolgt von Eintauchen in 50 % igem Ethanol über Nacht mit Chloroform verdünnt.
   1. Färben Sie die Folien mit 0,1 % Cresyl violett für 10 min im Ofen 40 ° C trocken.
   2. Tauchen in 95 % igem Ethanol für 30 min, dann entwässern in absoluten Ethanol für 2 Mal.
   3. Deaktivieren Sie 2 Mal in Xylol für 5 min, dann montieren Sie mit Eindeckmedium nach Lufttrocknung.
5. Beobachten Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die histologischen Veränderungen, die nach MCAO-induzierten Hirnverletzung.

5. statistische Analyse

1. Die experimentellen Ergebnisse als Mittel ± Standardabweichung Express und bestimmen die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen mit einem One-Way Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukey post Hoc Analyse anhand einer Datenanalyse-Software.
2. Legen Sie die statistische Signifikanz bei einem p-Wert < 0,05.

Im Bereich Schein betrieben "normal" ist kein Hirninfarkt beobachtet, während in der Kontrollgruppe eine relativ breite Palette von Schadstellen beobachtet wird. Bei den Mäusen wird verabreicht 300 mg/kg GRex in der MCAO-Model-Gruppe, eine statistisch signifikante Reduktion im beschädigten Bereich (Abbildung 2) beobachtet.

Die histologischen Veränderungen sind durch ischämische Gehirn Abschnitte mit H & E oder Cresyl Violett Färbung untersucht. H & E Färbung bietet strukturelle Informationen und spezifische funktionelle Informationen über Zellen¹⁰, während Cresyl violette Färbung verwendet wird, um die Gesamtzahl der hippocampal Neuronen¹¹zu schätzen. So, H & E oder Cresyl violett Intensität, gemessen mit ImageJ-Software (Bild 3A), enthält ein Verzeichnis der Zelle überleben. H & E und Cresyl violette Färbung Intensitäten deutlich verringern in der Kontrollgruppe im Vergleich zu den normalen Gruppe (Abbildung 3B, 3 C). GRex-behandelten Gruppe zeigt größere histologische Integrität, was bedeutet weniger neuronaler Zelltod, als die Kontrollgruppe (Abb. 3C). Diese Ergebnisse zeigen, dass GRex potente neuroprotektive Wirkung gegen Ischämie/Reperfusion-induzierten-Hirn-Trauma hat.

Abbildung 1 . Schema der mittleren zerebralen Arterie Okklusion (MCAO) Modell und Behandlung mit dem Methanol-Extrakt von Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GRex). Mäuse wurden behandelt mit 300 mg/kg von GRex 1 h nach MCAO Reperfusion, die beibehalten wurde für 2 h wurden Mäuse euthanasierten 24 h nach der MCAO begann, und dann wurden die geernteten Gehirnscheiben gespeichert in einer Tiefkühltruhe für Protein Assay oder gebeizt mit TTC Lösung für Infarkt Messung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Repräsentative Bilder (A) Gehirn Abschnitte zeigen die Auswirkungen von Methanol Extrakt von Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GRex) Behandlung auf Post-mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO)-induzierte Hirninfarkt Bände und (B) Einzelbehandlung mit 300 mg/kg GRex 1 h nach Reperfusion MCAO Infarkt Volumen deutlich unterdrückt. Ergebnisse werden als Mittel ± SDs. ## #p < 0,001 Vs normale Gruppe, ** p < 0,01 Vs Steuern Gruppe; n = 6 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . Repräsentative Bilder (A) Hämatoxylin und Eosin (H & E)- und Cresyl violett gefärbten Gehirn Abschnitte und (B, C) Farbe Intensitäten, die verwendet wurden, um die Bewertung der Auswirkungen der Methanol-Extrakt von Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GRex) auf die Gehirne von Mitte zerebralen Arterie Okklusion (MCAO)-verletzte Mäuse. Histologischen Integrität und Gewebe Schaden in Mäusegehirnen wurden bewertet mit (B) H & E) oder (C) Cresyl violette Färbung 1 h Post-MCAO Reperfusion. Rote Färbung in H & E-gefärbten Abschnitte zeigt nuklearen Schaden. Neuronen mit Cresyl violett gefärbt wurden lila gefärbt. GRex-behandelten Gruppe zeigte besser histologischen Integrität als die Kontrollgruppe weniger neuronaler Zelltod angibt haben. ein, H & E gefärbt; b, Cresyl violett gefärbt; c und d, Erweiterungen von a und b, beziehungsweise. Ergebnisse sind Mittel ± SDs. ## #p < 0,001 und * p < 0,05 Vs normal und Kontrollgruppen; n = 6 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Mit der zunehmenden Verbreitung von Stoffwechselerkrankungen wie chronischem Bluthochdruck, Diabetes und Hyperlipidämie, die wichtigsten Risikofaktoren für einen Schlaganfall sind geworden Schlaganfall-Prävention und Behandlung ein wichtiger Bereich der medizinischen Forschung^{12, 13}. Defizite in Sprache und Bewegung nach einem Schlaganfall sind stark korreliert mit dem Grad der Beschädigung des Gehirns Gewebe¹⁴ und führen zu einer schlechten Lebensqualität für Patienten und ihre Familien¹⁵. Es ist wichtig, einem geeigneten Tiermodell der Schlaganfall zu verwenden, die die gleichen pathologischen Veränderungen wie diejenigen, die in der menschlichen Krankheit umfasst untersuchen die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlungen auftreten. Das MCAO Modell ahmt thrombotischen Striche von arteriellen Hirngefäße zu behindern. Es ist allgemein verwendet, weil es relativ reproduzierbar und minimal-invasive^16,17,18,19.

Jedoch Zeit berichtet von einigen Forschern, zeigt ein Vergleich der Bereich der Hirninfarkt induzierte für die gleichen ruht, dass das gesamte Infarkt Volumen zwischen Studien variiert. Wir festgestellt, dass dies aufgrund von Unterschieden in der Okklusion Materialien verwendet und den chirurgischen Eingriff war. Daher, obwohl das MCAO Nagetiere Modell hoch reproduzierbare angesehen wird, ist es nicht immer möglich, solche Reproduzierbarkeit zu erhalten. Daher haben wir die Dicke der Filamente verwendet in MCAO Mausmodell durch unsere Vorstudie und vorherigen Bericht⁸optimiert.

Das auffälligste Ergebnis unserer Vorstudie im Vergleich zu anderen Studien ist, dass TTC Färbung keine Hirninfarkt offenbart hat bei die Ischämie für 60 min (Daten nicht gezeigt) induziert wurde. Auch nach 90 und 120 min. von MCAO in den Mäusen, unser Ergebnis zeigte ein Infarkt leiser als die der anderen Studien. Eine Einschränkung dieser Studie ist, dass wir die genaue Ursache für diese Ergebnisse noch nicht festgelegt haben. Allerdings planen wir dieses Phänomen in weiteren Studien zu erkunden.

Zahlreiche Studien haben vor kurzem berichtet, dass GR oder seiner Komponenten pharmakologische Aktivitäten einschließlich antitumor, antimikrobielle und entzündungshemmende Effekte^20,21,22. Eine frühere Studie berichtet, dass GRex Vorbehandlung effektiv die Aktivierung von Caspase-9 durch heraufregulierende der Proteinexpression von Bcl-2 und Bcl-xL⁸gehemmt. Vorbeugende Behandlungen für Schlaganfall sind jedoch weniger klinisch relevant als nach Schlaganfall-Behandlung.

In dieser Studie war die basiert auf einer früheren Studie⁸ bewertet die Wirksamkeit der GRex Nachbehandlung in einem Mausmodell MCAO. Wie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse dargestellt, zeigte GRex Nachbehandlung wohltuende Wirkung in totale Infarkt Abfallbeseitigungssystem und bessernde Schäden an Zellstrukturen in MCAO-induzierten-Hirn-Trauma bei Mäusen. Die spezifische Wirkungsmechanismen von GRex auf Post-ischämische Hirnschädigung fehlt in dieser Studie, aber erfolgreich in dieser Studie verwendeten experimentelle Protokolle belegen, dass die Auswirkungen dieses pflanzliche Heilmittel imitiert menschliche Auswirkungen eines Schlaganfalls.

Obwohl die experimentellen Ergebnisse in dieser Studie, der neuronalen Defizit Score nicht eingehalten werden (NDS) wurde in unserem Vorversuch gemessen und kein signifikanter Unterschied festgestellt zwischen dem Steuerelement und dem GRex-behandelten Gruppen, die angenommen wird, dass fällig gewesen im Vergleich zu der kurzen Beobachtungszeit auf die Schwere des Schlaganfalls. Wir planen, beachten Sie die Auswirkungen der GRex Behandlung auf den NDS über einen langen Zeitraum nach mäßigen Schaden verursacht.

Abschließend zeigte sich die neuroprotektive Wirkung von GRex Behandlung in einem Mausmodell MCAO in dieser Studie mit gute Reproduzierbarkeit. Die Proteine, die in den zugrunde liegenden Mechanismus sollte in künftigen Studien untersucht werden.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Nicht anwendbar.