הערכת אפקטים Neuroprotective של בסיס Glycyrrhizae et Rhizoma לחלץ באמצעות מודל העכבר חסימה של עורק המוח התיכון ארעית

במחקר זה, נוכל לשנות שיטה ניסיונית קיימת כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר, על-ידי יצירת מודל העכבר סגר (MCAO) של עורק המוח התיכון. אוראלי מינהל Glycyrrhizae בסיס et תמצית מתנול קנה שורש (גר) (GRex), בעקבות שבץ אינדוקציה, ירד באופן משמעותי אוטם סה כ נפח ביחס קבוצת הביקורת שלא טופלו.

איסכמיה ואחריו פגיעה reperfusion של זרימת דם מוחי לאחר שבץ מוביל למותו של תאי עצב ואובדן רקמת המוח. המודל הנפוץ ביותר בעלי חיים לימוד קו הוא הדגם סגר (MCAO) בעורק האמצעי. מחקרים קודמים דיווחו בגדלים שונים לאוטם גם כאשר בני אותו מין חיה ניסיוני שימש בתנאים MCAO דומה. לכן, פיתחנו שיטה ניסיונית משופרת כדי לטפל אי-התאמה זו. עכברים היו נתונים MCAO שימוש נימה של החומר סגר לחקות תנאי קו אנושי, עובי נימה אופטימלי להקים עוד נפח אוטם לשחזור. עכברים שטופלו מתנול תמצית של בסיס Glycyrrhizae et קנה שורש (GRex) בעקבות שבץ אינדוקציה הראה אמצעי אחסון אוטם הכולל ירד משמעותית של מספר רב יותר של הישרדות התאים ביחס קבוצת הביקורת שלא טופלו. זה שונה נסיוני בהצלחה והפגינו reproducibly על השפעה מיטיבה של GRex על שבץ איסכמי.

נזק מוחי שנגרם על ידי איסכמיה פגיעה reperfusion של זרימת הדם במוח מוביל למותו של תאי עצב ואובדן רקמת המוח. סוג זה של נזק מוחי ממשיך לגדול עם השכיחות הגוברת של מחלות כשאבדן עקב ההתפשטות של מחלות מטבוליות כגון השמנת יתר, לחץ דם גבוה, סוכרת^1,2. המספר המוחלט בחולים קשישים עם קו גדל באופן דרמטי ברחבי העולם, העלות של טיפול רפואי עבור חולים אלו, מי הם לעתים קרובות נותר עם מוגבלות לטווח ארוך, הוא נטל ציבורי גדול. לכן, לקויות משניות צריך אפשרות לפתור כמה שיותר להפחית את הנטל הכלכלי^1,2.

מכרסמים הדגם הנפוץ ביותר של אוטם מוחי הוא הדגם סגר (MCAO) בעורק האמצעי (MCA), שבו MCA הוא occluded עם מצופה סיליקון כירורגי הפתולוגיים פילמנט לחסום את זרימת הדם, גורם שבץ איסכמי^{3, 4}. שימוש נימה של החומר סגר מאפשר השליטה של קביעות וזמן סגר על-ידי מניפולציה משך ההוספה פילמנט אינטרה-luminal.

מחקרים קודמים הראו כי גם כאשר נעשה שימוש באותו דגם MCAO מכרסם, הנפח הכולל של אוטם מוחי משתנה בין ניסויים, גורם הפארמצבטית נמוכה של המחקרים. כדי לשפר את הפארמצבטית, אנחנו אופטימיזציה העובי של המטבעות פילמנט המשמשים את הניסוי. התוצאות של מחקר ראשוני של תקופת איסכמי מוחי, אוטם המושרה הראה כי תקופה איסכמי יותר מ 60 דקות מותר האזור הנפחי של נזק לרקמת המוח ניתן להקליט ולצפות במעשיהם לכמת.

בסיס Glycyrrhizae et Rhizoma (גר), הידוע גם בשם שוש מורכב של שורשים מיובשים, המלבלבים של שוש uralensis , קרח ג. זה שימש ברפואה המסורתית סינית וקוריאנית למטרות שונות, כולל תוסף מזון, מסיבות בריאותיות^5,6,7.

ב הקודם לימוד⁸, טיפול קדם עם תמצית מתנול גרם (GRex) הראה אפקט אנטי-מוות בעכברים MCAO, לרבות מניעה משמעותי של הירידה בביטוי חלבונים של B-cell לימפומה 2 (Bcl-2) Bcl גדולים במיוחד (Bcl-xL). מחקר זה נערך כדי לשפר את הפארמצבטית של דגם העכבר MCAO המקובלת על-ידי הערכת היעילות שלה בקביעת אם לאוטם שלאחר הטיפול עם GRex ביעילות מופחת לאוטם האחסון ב- MCAO-induced נזק מוחי.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הלאומית פוסאן (מספר אישור, PNU-2016-1087). סקירה גרפית של מחקר זה מוצג באיור1.

1. הכנה וניהול של GRex

הערה: כדי לבחור השתמשו במחקר זה נרכש מחברת התרופות מסחרי.

1. במקום 200 גר' GR ב- 2,000 מ של מתנול, דגירה בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 5 ימים.
2. לסנן את התערובת בעזרת נייר סינון 0.26 מ מ עובי וגודל 5 מיקרומטר נקבובית ולאחר מכן הסר את תגובת שיקוע. להוסיף 1000 מ של מתנול השאריות GR ולסנן שוב.
3. לשלב את שני supernatants, לסנן דרך נייר סינון, לרכז תחת ואקום, ולהקפיא ואז השאריות כדי לייצר GRex.
4. להמיס את GRex ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), שתדללו עם תמיסת מלח פיזיולוגית של 0.9%, לסנן דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. לאחר מכן, התאם את הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד < 5%.
5. לנהל GRex (300 מ"ג/ק"ג משקל גוף) 1 h לאחר פגיעה reperfusion של MCAO דרך gavage דרך הפה. לנהל דימתיל סולפוקסיד מעורבבת עם תמיסת מלח פיזיולוגית (10 מ"ל/ק"ג משקל גוף) רק על קבוצה נורמלית של קבוצות שליטה, בהתאמה.
   הערה: ריכוז GRex השתמשו בניסוי זה נקבע על-פי הריכוז היתה פעילה עד המחקר הקודם שלנו⁸.

2. העכבר בדגם MCAO

1. בשימוש הגברי C57BL/6 עכברים בגיל 6 שבועות, במשקל של 22-25 g... לספק כל החיות עם גישה חופשית תקן האוכל ומים הבית אותם בסביבה עם טמפרטורה מבוקרת (22 ± 1 ° C) ואת מחזור/כהה 12 שעות.
   1. לחלק העכברים קבוצות של עכברים 6 כל אחד, אשר צריכה להיות מורכבת המופעלים באמצעות העמדת פנים רגיל, שליטה וקבוצות טיפול GRex.
   2. לבצע ניתוח MCAO (שינוי של השיטה של קואיזומי. et al. ⁹) על שליטה ועל קבוצות טיפול GRex באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
2. לגרום הרדמה שאיפת בעכברים באמצעות איזופלוריין 2%-70% N₂O ו- 30% O₂. הרדמה נחשב מספיק כאשר העכבר מפסיק להגיב לגירוי מכני חלה על זנבו. לשמור על טמפרטורת הגוף של העכברים-36.5 ± 0.5 ° C באמצעות גוף השמיכה טמפרטורה החזקת מחובר מד חום.
3. להסיר את כל השיער על החזה ואת הצוואר של העכברים מאת גילוח ואחריו השימוש קרם להסרת שיער, לחטא באתר כירורגית של העור עם betadine סקראב לסירוגין עם אלכוהול עבור שתי פעמים, ולאחר מכן בצע חתך של 2 ס מ ארוך עם כירורגית להב במרכז הצוואר. בזהירות לבודד את השמאלי עורק תרדמני (LCCA), העורק החיצוני ואת הסניף של העורק שבסביבה רקמות החיבור.
4. מאתרים ומפסיקים את עורק חיצוני, את עורק תרדמני בתפר כירורגי (4-0 בתפר משי, תקלות חצי קשר) באופן זמני לחסום את זרימת הדם לתוך העורק במהלך המבצע.
5. הוסף התפר ניילון מצופה סיליקון (8-0 monofilament, 11 מ"מ) דרך העורק על מוצאם של MCA השמאלי. להתאים את העובי של החלק מצופה סיליקון של חוט הלהט לטווח של 0.10-0.12 מ"מ.
6. למדוד את הירידה בזרימת הדם המוחית היחסי (rCBF) ב- MCA באמצעות זרימה דופלר של לייזר. MCAO תאושר כאשר rCBF נשמרת ב- < 20% מהערכים בתנאי מנוחה במהלך תקופת איסכמי כולה.
7. לתקן את הסיב שנוסף על כלי הדם כבר שעתיים בזמן עורק המוח הוא occluded, ואז מסירים בזהירות את הסיב כדי לשחזר את זרימת הדם עבור h 22 של פגיעה reperfusion. תפר את העור על ידי תפירה 5 מקומות (3-0 בתפר משי, שני מכשולים חצי קשר) ולאפשר לכל בעכבר כדי להתעורר מההרדמה.
8. בקבוצה רגילה, לבצע פעולת המזויפים בעקבות ההליך אותו מעל (עד 2.4), עם החריגה הבאה. מאתרים ומפסיקים את עורק תרדמני, תפר את חרות שריר ועור.

3. מדידה של נפח של רקמת המוח הפגוע

1. לאחר המתת חסד של העכברים למדידה נזק מוחי עם שאיפת₂ CO, בלו העכבר מוח 24 שעות לאחר תחילתה של MCAO באמצעות מספריים כירורגיים איריס ומלקחיים בזווית.
   1. לאחר הסרת את הראש באמצעות מספריים, לעשות חתך בעור קו האמצע של הראש להטיל על העור מהגולגולת.
   2. לשבור עצמות הקודקוד עם מלקחיים זוויתי, פילינג ביטול דורא משנה באותו זמן, אז לבודד את המוח בקפידה מתוך הגולגולת.
2. גזור רקמת נכרת למקטעים (1 מ מ עבה) שימוש במטריצה מוח העכבר ולאחר מכן כתם הסעיפים במשך 17 דקות בפתרון של 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC).
3. לתקן את הסעיפים בפורמלין 10% כבר לפחות שעתיים, ואז לצלם אותם באמצעות מצלמה דיגיטלית. TTC יתקיימו כתם רקמות קיימא אדום, בעוד אזורי נמק יהיה לבן.
4. לנתח ולכמת את האזור לאוטם מוחי של כל מקטע באמצעות ImageJ.

4. hematoxylin ואת אאוזין (H & E) Cresyl מכתים סגול סעיפים היסטולוגית

1. המתת חסד העכברים למחקר היסטולוגית באמצעות אינהלציה₂ CO, perfuse אותם transcardially עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), ואחריו 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). לבודד את המוח באמצעות שתוארו לעיל (3.1), לטבול את המוח ב- 10 מ"ל של 30% סוכרוז למשך הלילה.
2. להטביע על רקמת המוח טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם ולחתוך אותו coronally למקטעים 15-מיקרומטר-עבה באמצעות של cryostat. הר הסעיפים בשקופיות זכוכית, ואחריו מכתים עם hematoxylin אאוזין (H & E) או סגול cresyl.
3. לטבול את השקופיות זכוכית 80% אתנול עבור 1 דקות ולאחריו מכתים בפתרון hematoxylin במשך 5 דקות.
   1. טובלים את השקופיות ב- 1% אלכוהול חומצה פעמיים, לטבול בתמיסה רוויה ליתיום קרבונט ב-30 s, תשטוף עם מים מהברז של 30 s ולאחר מכן counterstain ב eosin פתרון עבור 30 s.
   2. לשטוף את השקופיות במי ברז, לטבול 95% ואתנול מוחלטת ברצף.
   3. מילה נהדרת השקופיות, לנקות אותם ב קסילן לפחות 10 דקות ולאחר מכן לטעון על coverslips באמצעות הרכבה בינונית.
4. במקום שקופיות זכוכית על שקופית חמים במשך לפחות שעה, ואחריה טבילה באתנול 50% מדולל עם הכלורופורם בן לילה.
   1. מכתים את השקופיות בויולט cresyl 0.1% 10 דקות בתנור יבש 40 ° C.
   2. לטבול אתנול 95% במשך 30 דקות ולאחר מכן מייבשים באתנול מוחלטת על פי 2.
   3. נקה 2 פעמים ב קסילן למשך 5 דקות ולאחר מכן לטעון עם הרכבה בינונית לאחר ייבוש האויר.
5. באמצעות מיקרוסקופ, שים לב היסטולוגית השינויים שהתרחשו לאחר פגיעה מוחית הנגרמת MCAO.

5. ניתוח סטטיסטי

1. לבטא את תוצאות הניסוי בתור אמצעי ± סטיית התקן וקבע את מובהקות סטטיסטית בין הקבוצות באמצעות בכיוון אחד ניתוח של שונות (ANOVA) ואחריו ניתוח פוסט הוק של Tukey באמצעות תוכנת ניתוח נתונים.
2. להגדיר את מובהקות סטטיסטית p-הערך < 0.05.

בקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים רגיל, אין לאוטם מוחי הוא ציין ואילו בקבוצת הביקורת, נצפית מגוון רחב יחסית של אזורים פגועים. בעכברים מנוהל 300 מ"ג/ק"ג GRex בקבוצה מודל MCAO, ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית באזור הפגוע הוא ציין (איור 2).

השינויים היסטולוגית נחקרות על ידי צביעת מוח איסכמי מקטעים בויולט H & E או cresyl. צביעת המטוקסילין מספק מידע מבניים ומידע פונקציונלי מסוים על תאים¹⁰, ואילו cresyl, ויולט מכתים משמש כדי להעריך את המספר הכולל של נוירונים בהיפוקמפוס¹¹. לפיכך, ויולט H & E או cresyl בעוצמה, כפי שהיא נמדדת באמצעות תוכנת ImageJ (איור 3א), מספק אינדקס של הישרדות cell. H & E ו- cresyl ויולט מכתים עוצמות באופן משמעותי ירידה קבוצת הביקורת ביחס לקבוצה רגילה (איור 3ב, 3 ג). הקבוצה שטופלו GRex מראה יותר שלמות היסטולוגית, רומז מות תאים עצביים פחות, מאשר קבוצת הביקורת (איור 3ג'). תוצאות אלו מצביעות על כי GRex יש אפקטים neuroprotective חזק נגד פגיעה מוחית איסכמיה/פגיעה reperfusion-induced.

איור 1 . ערכה של עורק המוח התיכון סגר (MCAO) המודל לבין טיפול עם תמצית מתנול של בסיס Glycyrrhizae et קנה שורש (GRex). עכברים שטופלו 300 מ"ג/ק"ג של GRex 1 h לאחר פגיעה reperfusion MCAO, אשר נשמר עבור ה 2 היו עכברים לאללה 24 שעות אחרי MCAO החלה, ולאחר מכן פרוסות המוח שנקטפו היו מאוחסנים הקפאה עמוקה עבור שיטת או מוכתם TTC לפתרון לאוטם מדידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 . להחליפן בתמונות סעיפים (א) המוח מציג ההשפעות של מתנול תמצית של בסיס Glycyrrhizae et קנה שורש (GRex) טיפול על עורק המוח התיכון שלאחר סגר (MCAO)-induced כרכים לאוטם מוחי וטיפול (ב) יחיד עם 300 מ"ג/ק"ג GRex 1 h לאחר פגיעה reperfusion MCAO דיכא באופן משמעותי לאוטם כרכים. התוצאות מוצגות כחלק ± באמצעים מרחביות. # # #p < קבוצה רגילה לעומת 0.001, * * p < לעומת 0.01 לשלוט קבוצה; n = 6 לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 . תמונות נציג של (א) hematoxylin אאוזין (H & E)- ומקטעים המוח שהוכתמו ויולט cresyl (B, C) צבע בעוצמות, אשר שימשו כדי להעריך את ההשפעה של תמצית מתנול Glycyrrhizae בסיס et קנה שורש (GRex) על מוחותיהם של התיכון חסימה בעורק (MCAO)-נפגע עכברים. היסטולוגית שלמות ברקמות נזק במוח העכבר היו המוערך באמצעות (B) H & E או (ג) cresyl, ויולט צביעת 1 h post-MCAO פגיעה reperfusion. אדום מכתים ב H & E שהוכתמו מקטעים מציינת נזק גרעיני. נוירונים ונצבע בויולט cresyl היו מוכתמים סגול. הקבוצה שטופלו GRex הראה היסטולוגית שלמות יותר מאשר קבוצת הביקורת, המציין את מות תאים עצביים פחות. , H & E שהוכתמו; b, cresyl, ויולט שהוכתמו; c ו- d, הגדלות של ו- b, בהתאמה. התוצאות הן אמצעי ± מרחביות. # # #p < 0.001, ו * p < נורמלי 0.05 vs וקבוצות שליטה; n = 6 לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

עם השכיחות הגוברת של מחלות מטבוליות כגון יתר לחץ דם כרוני, סוכרת, היפרליפידמיה, המהווים גורמי סיכון עיקריים עבור קו, קו מניעה וטיפול הפכו אזור חשוב של המחקר הרפואי^{12, 13}. לגירעונות שפה ותנועה לאחר שבץ חזק נמצאים בקורלציה עם מידת הנזק במוח רקמות¹⁴ , לגרום שאיכות החיים עבור חולים ואת המשפחות שלהם¹⁵. חשוב להשתמש במודל חיה המתאימה של שבץ המערבת את אותם שינויים פתולוגיים לאלה המתרחשים מחלות אנושיות כדי לחקור את היעילות של טיפולים תרופות. המודל MCAO מחקה קדחת משיחות על ידי הפרעה מוחית כלי עורקי. זה נפוץ כי זה הדירים פולשנית יחסית^16,17,18,19.

עם זאת, השוואה של האזור של אוטם מוחי המושרה עבור המנוחה באותו הזמן שדווחו על ידי מספר חוקרים, מגלה האחסון הכולל אוטם משתנה בין מחקרים. הגענו למסקנה שזה היה בגלל ההבדלים בין החומרים סגר בהם הליך כירורגי. אף על פי המודל מכרסמים MCAO נחשב מאוד לשחזור, לכן לא תמיד ניתן להשיג הפארמצבטית כזה. לכן, אנחנו אופטימיזציה עובי חוטים בשימוש במודל MCAO העכבר באמצעות מחקר ראשוני ואת הדוח הקודם⁸שלנו.

התוצאה הבולט ביותר של מחקר ראשוני שלנו לעומת זה של מחקרים אחרים היא כי TTC מכתים לא גילתה כל אוטם מוחי כאשר איסכמיה הושרה במשך 60 דקות (נתונים לא מוצג). גם לאחר 90 ל-120 דקות של MCAO בעכברים, תוצאה שלנו הראה נפח שריר הלב נמוך יותר מזה של מחקרים אחרים. מגבלה אחת של מחקר זה היא כי יש לנו לא עדיין נחוש את הגורם המדויק של תוצאות אלו; עם זאת, אנו מתכננים לחקור תופעה זו במחקרים נוספים.

מחקרים רבים דיווחו לאחרונה כי גרם או מרכיביו יש פעילויות תרופתי כולל אפקטים antitumor מיקרוביאלית, אנטי דלקתיות^20,21,22. מחקר קודם דיווחו כי טיפול קדם GRex והשרירי ביעילות את ההפעלה של קספאז-9 על-ידי upregulating קולטני ביטוי חלבון של Bcl-2 ו- Bcl-xL⁸. עם זאת, טיפולים מונע שבץ רלוונטיים פחות קלינית מאשר קו שלאחר הטיפול.

במחקר זה, אשר היה מבוסס על מחקר קודם⁸ להעריך את היעילות של GRex שלאחר הטיפול במודל עכבר MCAO. כמו שתוארו בסעיף התוצאות נציג, GRex שלאחר הטיפול הראו השפעות מועילות צמצום נפח הכולל אוטם, ameliorating נזקים למבנים הסלולר בפגיעה מוחית הנגרמת MCAO בעכברים. מנגנוני פעולה ספציפית של GRex על פגיעה מוחית פוסט-איסכמי חסר במחקר זה, אך ניסיוני בפרוטוקולים המשמשים במחקר זה בהצלחה שמגלה את ההשפעות של זה בצמחי מחקה תופעות אנושיות של שבץ.

למרות תוצאות הניסוי לא שנצפו במחקר זה, התוצאה קשב עצביים (NDS) נמדדה בניסוי ראשוני שלנו, אין הבדל משמעותי צוין בין הפקד ובין קבוצות שטופלו GRex, אשר יש להניח שהייתי אמור לזמן תצפית קצרה לעומת חומרת הקו. אנו מתכננים לבחון את ההשפעות של טיפול GRex על NDS על פני תקופה ארוכה לאחר גרימת נזק בינוני.

לסיכום, השפעת הטיפול GRex במודל MCAO של עכברים neuroprotective הודגם במחקר זה עם הפארמצבטית טוב. החלבונים המעורבים המנגנון הבסיסי צריך להיבדק במחקרים עתידיים.

המחברים אין לחשוף.

לא ישים.