Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Bağırsak bariyer patojen mikroorganizma ve mikrobiyal toksin karşı savunur. İşlevi sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlük tarafından düzenlenir ve bağırsak bariyer fonksiyonu bozulma gastrointestinal ve sistemik hastalık ilerleme katkıda bulunur. Burada Bağırsak epitel geçirgenliği ölçmek için iki basit yöntem anlatılmaktadır. Vitro, Caco-2BBe hücreleri bir monolayer doku kültürü wells kaplama ve transepithelial elektrik direnci (TER) bir epitel (volt/ohm) metre ile ölçülür. Bu yöntem olan Kullanıcı dostu işlem ve tekrarlanabilirlik nedeniyle ikna edici. İçinde vivo fareler 4 kDa floresein isothiocyanate (FITC) ile gavaged-dextran ve FITC dextran konsantrasyonları epitel geçirgenliği belirlemek için fare üzerinden toplanan serum örneklerinde ölçülen. Oral gavaj doğru bir doz sağlar ve bu nedenle bağırsak geçirgenliği vivoölçmek için tercih edilen yöntemdir. Birlikte ele alındığında, bu iki yöntem bağırsak epitel içinde in vitro ve in vivogeçirgenliği ölçüm yapabilir ve bu nedenle hastalıklar ve bariyer fonksiyonu arasındaki bağlantıyı çalışmaya kullanılması.

Bağırsak epitel hücreleri sadece besin emilimi için sorumlu değildir, ama aynı zamanda patojen mikroorganizmaların ve mikrobiyal toksinler karşı savunmak için önemli bir bariyer oluşturmak. Bu bağırsak bariyer fonksiyonu sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlüğü^1,2,3tarafından düzenlenir ve epitel bariyer fonksiyonunun disfonksiyon iltihabi bağırsak ile ilişkilidir hastalığı (IBD). Perijunctional actomyosin yüzük (PAMR) sıkı kavşak yakından bitişik hücre içinde yatıyor. Myosin hafif zincir (MLC) tarafından düzenlenir, PAMR daralma sıkı kavşak geçirgenliği^{4,5,6,7,8düzenlenmesi için önemlidir, 9,10}. Tümör nekroz faktör (TNF) bağırsak bariyer kaybı etkinleşmiş Bağırsak epitel MLC kinaz (MICK) ifade ve occludin içselleştirilmesi^11,12,13inducing için merkezi bir noktada bulunuyor.

İyonlar Na⁺ ve Cl^- gibi gözenek veya sızıntı yolu¹⁴tarafından paracellular alan çapraz. "Sızan" bir epitel içinde TER değişiklikleri öncelikle değişmiş sıkı kavşak geçirgenliği yansıtmak. TER ölçüm hücre monolayers empedans göre sıkı Kavşağı geçirgenliği, Na⁺ ve^-, Cl için öncelikle ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir elektrofizyolojik yaklaşımdır. Farklı hücre tipleri, Bağırsak epitel hücreleri, pulmoner epitel hücreleri ve vasküler endotel hücreleri, gibi TER ölçülerini bildirilmiştir. Bu yöntemin avantajları, TER ölçümleri non-invaziv ve canlı hücreleri gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılan vardır. Buna ek olarak, TER ölçüm tekniği uyuşturucu toksisite çalışmaları¹⁵için yararlıdır.

Caco-2BBe hücreleri insan epitel kolorektal adenokarsinom hücre yapısı ve farklılaştırılmış küçük bağırsak epitel hücrelere benzer işlev vardır: Örneğin, microvilli ve küçük bağırsak fırça ile ilişkili enzimler bu hücreler var sınır. Bu nedenle, kültürlü Caco-2BBe monolayers bariyer fonksiyonu test etmek için bir vitro model olarak kullanılmaktadır.

Farelerde, kana lümen geçmeye FITC dextran yeteneği ölçerek bağırsak paracellular geçirgenliği çalışmaya yollarından biridir. Böylece, bağırsak geçirgenliği gavaging FITC dextran doğrudan içine fare ve kan içinde floresans ölçme tarafından tespit edilebilir. Aşağıdaki iletişim kuralı Bağırsak epitel geçirgenliği değerlendirmek için iki basit yöntem açıklanır vitro ve içinde vivo.

Bu çalışmada hayvan bakım ve kullanım iletişim kuralı, Cambridge-Suda genomik Kaynak Merkezi (CAM-SU), Soochow Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. kaplama ve Caco-2bbe gözenekli Polikarbonat membranlar üzerinde bakım

1. Bir T75 şişesi ile kitle iletişim araçları içinde hücrelerin büyümesine (% 10 içeren DMEM FBS). Şişeler düzenli olarak, hücre yoğunluğu bağlı olarak beslenmeleri gerekir.
   Not: optimum kaplama için hücreleri hızla Böl ve hücre büyüme aşamasında olduğunu gösterir bir düz "kızarmış yumurtalı" şekil var.
2. Hücrelerin % 80 birleşmesi olduğunda, kuluçka makinesi dışında şişesi ve medya sökün. 1-2 mL steril PBS (olmadan Ca^{2 +}) ile kalan herhangi bir medya durulayın. Damlalıklı 1,5 mL tripsin-EDTA balonun içine ve yavaşça şişeye; kaya o zaman, şişeye 20 dk 37 ° C kuluçka sallanan olmadan yer.
3. Hücreleri trypsinizing iken, yer gözenekli Polikarbonat membranlar (gözenek boyutu, 0.4 µm; Malzemeler tablobkz: yüzey alanı, 0,33 cm²;) 24-şey kalıplara içeren ekler. Kültür medya 1.0 mL bazal odası (membran alt boşluk) ekleyin.
4. Medya şişesi ve şiddetle damlalıklı 5 mL damlalıklı şişeye tarafına hücreleri 5 - 10 kat gevşek, tek tek hücreler veya 2-3 hücre elde etmek için kümeler.
5. 0,166 mL (1:8 seyreltme oranı elde) hücrelerinin apikal odasına (membran üst boşluk) plaka. 37 ° C'de 3 haftaya kadar kuluçkaya.
   1. Hücreleri üç kez haftalık dikkatle her şey bir basınç pompa kullanarak bazal yuvası ortamdan aspirating tarafından beslenir. Yavaşça medya 1 mL her ekleme apikal odanın içine damla.

2. TER ölçme epitel metre (Volt/Ohm) kullanımı

Not: kültür Polikarbonat membranlar üzerinde yaklaşık 3 hafta sonra Caco-2BBe hücreler TER ölçüm için hazırsınız demektir.

1. Sitokin çalışmaları için bir gün önce ölçüm, IFNγ 10 ng/mL içeren medya ile bazal ortamı değiştirin. Deneme günü, ortamı 2.5 veya 7.5 ng/mL TNF içeren HBSS ile değiştirin.
   Not: IFNγ tedavi TNF reseptör 2 (TNFR2) ifade artırır¹⁶.
2. Belgili tanımlık ölçme aygıtı düzeltmek için düzeltme elektrot giriş portuna takın ve "Ohm" modunu seçin. 1000 Ω bir okuma metre görüntüleyinceye kadar R Adj vida bir tornavida ile ayarlayın.
3. % 70 etanol için 15-30 dakika yerleştirerek elektrotlar sterilize ve onları hava kuru 15 s. durulama için deneysel hücre kültür medya elektrot bekleyin.
4. Kapatın ve güç kablosunu ve "Ohm" modunu seçin. Dikkatle bazal odası ve apikal odasına kısa uç elektrot köprüler uzun sonuna yerleştirin. Uzun elektrotlar medya ama doku kültürü ekler yukarıda yüzeyden daha kısa elektrot tutarak çanak alt dokunmak emin olun. Elektrotlar dikey tutun.
5. Örnek ekler ve boş ekler (hücre olmadan ama HBSS ile kültür ekleryani ) dayanıklılığını ölçmek, 0, 1, 2, 3, 4 h sitokin tedaviden sonra. Direniş kaydedin.
6. Farklı plaka biçimleri arasında tutarlılık sağlamak için ürün direnci ve etkili membran alanı hesaplamak:
   
   24-şey ekler için 0,33 cm²etkili membran alandır.

3. fare modeli Dextran sülfat sodyum (DSS)-kolit indüklenen

1. DSS %3.5 (wt/vol) son bir konsantrasyon autoclaved su ekleyin.
2. % 3,5 yönetmek DSS 7 gün olmak üzere toplam 8-hafta-yaşlı erkek C57BL/6 fareler için. Normal içme suyu DSS olmadan kontrol fareler için vermek.
   1. DSS içeren su normal içme suyu için 7 gün sonra geçin.
3. Fareler tartmak ve klinik puanları her fare her gün değerlendirmek. Vücut ağırlığı, ilk vücut ağırlığının her fare ile normalleştirmek. Puanları tarafından dört parametre hastalık şiddeti göre tanımlanır: Rektal prolapsus (0-2), dışkı tutarlılık (0-2), kanama (0-2) ve aktivite (0-2)⁵. Bu parametreler için bir final klinik skoru gelen puanları toplamak.
4. İki nokta üst üste doku histopatolojik durumunu analiz etmek için %1,2 (vol/vol) Avertin (0.6 mL/10 g vücut ağırlığı) 7 gün sonrası-DSS tedavi ile mayi (IP) enjeksiyonla fareler ötenazi. % 100 avertin bir hisse senedi hazırlamak için 2,2,2-tribromoethanol 10 g tert-amil alkol 10 ml ile karıştırın.  Karanlıkta 4 ° C'de depolayın Kullanmak için % 100 hisse senedi suda % 2 oranında seyreltin.
5. Çekum ve iki nokta üst üste ayırma ve iki nokta üst üste⁵uzunluğunu ölçmek.
6. 0.5 cm kesimleri distal kolon ve düzeltme 15 mL şahin tüp 10 mL % 10 formalin gecede içeren kesti. Kademeli etanol sabit kurcalayarak yıkayın (75, 95 ve % 100) ve Ksilen. Parafin içinde belgili tanımlık doku katıştırmak ve 6 mm bölümleri Hematoksilen ve eozin⁸boyama için kesti.

4. DSS kaynaklı kolit farelerde epitel bariyer geçirgenliği ölçüm

1. Bariyer geçirgenliği DSS yönetim başladıktan sonra 7 gün ölçmek.
2. Tahlil günü, fareler 3 h için hızlı.
3. Otoklav bir sonda ile besleme kısırlık, sonra sonda ile besleme fareler 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran steril su ile emin olmak için iğne ve serum toplandıktan sonra standart eğri ölçmek için kullanılmayan FITC dextran tutmak. Fareler geçirgenliği hesaplama için tartmak.
   Not: Suda FITC dextran çözüm yapılmalıdır.
4. Makas kullanarak, kuyruk 1 cm parçası küçük ve 100 µL kan serum koleksiyonu tüpler içine kuyruk toplamak. 10.000 x g oda sıcaklığında 10 dakika için toplanan kana spin.
5. Serum 1:4 su oranında seyreltin. Eğri, 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, su ile kullanılmayan FITC dextran seyreltik bir standart hale getirmek için 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 ve 1:3, 000, 000. 100 µL/iyi serum ve standart eğri örnekler 96-şey kalıplara ekleyin.
6. Bir plaka okuyucu 485 uyarma/528 emisyon ile floresan okuyun. Standart eğri dayalı geçirgenlik değerleri hesaplamak ve seyreltme için düzeltmek için 4 tarafından çarpın.
7. FITC dextran konsantrasyonu (Bu fareler hasta iseniz ve kilo kaybettim FITC dextran teslim farklılığı normale yardımcı olur) değerleri normalize etmek ağırlık tarafından bölün.

Kültür, Caco-2BBe hücreleri bir monolayer büyümek ve yavaşça fırça kenarlıklara sahip olgun dinsel enterositler ayırt etmek. Bu iletişim kuralı, Caco-2BBe hücreleri yüksek yoğunluklu Polikarbonat membranlar üzerinde kaplama ve hücrelerin % 100 confluency bir gün tohum sonra ulaştı. Ancak, bu aşamada farklılaşmamış hücreleri olan: tam hücreleri ayırt etmek için medya her 2-3 gün 3 hafta için değiştirilir. Hücre çekirdeği ile lekeli ve farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreler arasındaki farkları göstermek için F-aktin lekeleri. Stres lifleri farklılaşmamış hücreleri açıkça görülmektedir. Farklılaşmamış hücreleri ile karşılaştırıldığında, farklılaştırılmış hücrelerin küçük bir hacim, daha büyük çekirdekler ve daha az stres lifleri (Şekil 1) var.

TNF bağırsak bariyer kaybı MICK bağımlı sıkı kavşak düzenleme ile merkezi bir noktada bulunuyor. TER hücre olmadan veya farklı zaman noktalarda TNF tedavisi ile analiz edildi. Şekil 2' de gösterildiği gibi TNF önemli ölçüde Caco-2BBe monolayer TER doz bağımlı bir şekilde TNF epitel geçirgenliği artar düşündüren azalır.

Yönetim DSS farelerde akut kolit neden olmaktadır. DSS ile tedavi fareler önemli ölçüde kendi ilk vücut ağırlığı (Şekil 3A) göre kilo. Kolit şiddeti Rektal prolapsus, dışkı tutarlılık, kanama ve etkinliği (Şekil 3B) tarafından attı. Kesit Hematoksilen ve eozin ile lekeli kolon dokuların kolon mukozal hasar tedavi DSS fareler (Şekil 3 c) göster. İki nokta üst üste crypt uzunluğu tedavi DSS fareler (3D şekil) azalır. İki nokta üst üste uzunluğu tedavi DSS fareler (3E rakam) kısaltılır. Şekil 3Fgörüldüğü gibi yaklaşık FITC dextran düzeylerinde fareler denetlemek için karşılaştırıldığında tedavi DSS farelerde logosuna 2 kat artış vardır.

Şekil 1: Polikarbonat membranlar kültürlü Caco-2BBe hücreleri. Kaplama lekeli sonra Höchst çekirdeği ve Alexa Fluor 594 Phalloidin için 33342 (mavi) ile F-aktin (kırmızı) 1 (farklılaşmamış) gün ve 3 hafta (tam Ayrıştırılan) kültürlü hücreleri. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: TNF Caco-2BBe monolayer TER azaltır. Gecede 10 ng/mL ile IFNγ astarlanmalıdır hücrelerdir. Ertesi gün, kültür orta 2.5 veya 7.5 ng/mL TNF içeren HBSS ile değiştirilir. TER bir epitel metre (Volt/Ohm) tarafından belirtilen süre noktalarda ölçülür. Değerler şunlardır: ortalama ± SEM, n = 4. Önemli farklılıklar simgesiyle * (p < 0,05) ve ** (p < 0,01), TNF tedavisi, olmayan hücreler TER değerlerine kıyasla tarafından iki kuyruklu t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: DSS kaynaklı kolit farelerde. C57BL/6 erkek fareler % 3,5 verilen 7 günlük içme suyundaki DSS. Vücut ağırlığı(a)ve klinik puanları (B) her gün her grup için değerlendirilir (± SEM, yani n = 4 her grup için). Denetim fare DSS susuz aldı. (C) kolon doku bölümleri histolojik analizini gün 7 mesaj-DSS tedavi üzerinde toplanan. (D) iki nokta üstüste Crypt uzunlukları gün 7 mesaj-DSS tedavi üzerinde ölçülen. (E) iki nokta üstüste uzunlukları gün 7 mesaj-DSS tedavisine ölçülür. Kolon epiteli geçirgenliği (F) gün 7 mesaj-DSS tedavisine FITC Dextran sonda ile besleme tarafından ölçülür. Değerler şunlardır: ortalama ± SEM, n = 4. Önemli farklılıklar simgesiyle * (p < 0,05 iki kuyruklu t-test). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1. Hastalık klinik skoru

Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Caco-2BBe (fırça sınır-ifade) hücreler her zaman TER ölçüm, Caco-2 hücre kültürünü ifade sınır ötesi fırça proteinlerin için seçildiği için kullanılır. Caco-2BBe hücreleri villus dinsel fenotip var ne zaman tam-Ayrıştırılan (kültür sonrası izdiham yaklaşık 3 hafta sonra)¹⁷. Ölçüm sırasında kontaminasyon ve elektrot sterilize etmek için gereklidir. Yordamı non-steril olduğundan, ölçümleri yalnızca en fazla 8 saat çoğu durumda için gerçekleştirilebilir. Ölçüm sırasında iki nokta iç ve dış INSERT direnç değerinin belirlenmesi. Direnç ölçümler çeşitli sitelerde bazen büyük ölçüde hücre devlet farklılıklar nedeniyle farklı olabilir; Bu yöntemin önemli bir kısıtlamadır. Ancak, bu değişim istatistiksel yöntemler ve diğer yöntemleri tarafından önemli ölçüde azaltılabilir. TER Yöntem pulmoner epitel hücreleri ve vasküler endotel hücreleri bariyer bütünlüğünü belirleme gibi diğer hücrelere uygulayabilirsiniz. Buna ek olarak, TER ölçümleri ilaç toksisitesi çalışmalarda kullanılabilir.

Difüzyon yoluyla bağırsak epitel girin, hazmı oluştururlar, yönetimi bağırsak geçirgenliği değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajı bağırsak bariyer fonksiyonu muayene vivo içindeolabilir olduğunu. Radioisotopes, polietilen glikoller ve şekerler¹⁸de dahil olmak üzere kullanılabilir işaretleri çeşitli türleri vardır. Ancak, çeşitli faktörler geçirgenliği hassas ölçüm için düşünülmelidir: (1) bağırsak bariyer anormallik konumunu her zaman tam olarak tespit edilemez; ve (2) Mukozal kan akımı ve gastrointestinal hareketliliği emme ve oluştururlar atılımı etkileyebilir.

Bu çalışmada 4 kDa FITC dextran intragastrically farelerde verildi ve FITC dextran tutar fare serumda ölçüldü. Bu yöntem çok sayıda avantajı vardır. Oral gavaj lavman kullanarak ile ilişkili olası riskleri azaltır. Örneğin, kolon epiteli için kasıtsız bozukluğu rektal korumak, bir yanlış pozitif sonuç için önde gelen neden olabilir. Stresin neden ek etkileri de bertaraf edilmelidir. Geçirgenliği fareler stresli olduğunda artırmak için bilinmektedir. Bu bir ön deneme en az bir hafta önce gerçek deney yapmak için tavsiye edilir. Uygulama deneme gerçekleştirme gerçek deneme için deneysel gürültü en aza indirmek yardımcı olacaktır. Vahşi-tipi kumanda (tedavi) her zaman dahil edilmelidir.

FITC dextran ve ince bağırsak seyahat gavaging sonra iki nokta üst üste 3 h girmeye başlar. Böylece, 3 h küçük bağırsak geçirgenliği ölçüm için bir ideal zaman noktasıdır. Kolon geçirgenliği ölçümü, zaman, ama bu uzatılabilir sonra FITC-dextran lümen içine kaçağı ve gümrükleme kan akışından moleküllerin arasında bir denge haline gelir. 4 h genellikle kolon ölçümleri için iyi zaman noktası olarak kabul edilir.

Sonuç olarak, Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için iki ayrı Yöntem tarif edildi vitro ve içinde vivo. TER ölçüm ve FITC dextran sonda ile besleme yöntemleri paracellular geçirgenliği ölçümü ise, onlar her paracellular geçirgenliği bağımsız ve farklı özelliklerini sağlar.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Bu çalışmada tamamlanmasında cömert yardım için Dr Jerrold R. Turner, Brigham ve kadın Hastanesi, Harvard Tıp Okulu, teşekkür ederim. Bu eser desteklenen (grant numarası 81470804, 31401229 ve 81200620) Çin'in ulusal doğal Bilim Vakfı, Doğa Bilimleri Vakfı, Jiangsu Province (grant numarası BK20180838 ve BK20140319), araştırma Innovation programı için Jiangsu Province, üniversite mezunları (grant numarası KYLX16-0116), ileri araştırma projeleri Soochow Üniversitesi (grant sayı SDY2015_06) ve Crohn ve kolit Vakfı Araştırma Bursu Ödülü (sayı 310801 vermek).