في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية

أسلوبي ترد هنا لتحديد وظيفة الحاجز المعوي. مقياس الظهارية (فولت/أوم) يستخدم لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال من ابيثيليا مثقف مباشرة في الآبار زراعة الأنسجة. في الفئران، يتم استخدام الأسلوب تزقيمية فيتك-ديكستران لتحديد نفاذية الأمعاء في الجسم الحي.

الحاجز المعوي يدافع ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض، والسمية الجرثومية. ينظم وظيفتها نفاذية مفرق ضيق وسلامة الخلايا الظهارية، وتعطيل وظيفة جدار الأمعاء يسهم في تطور الأمراض المعدية المعوية والجهازية. أسلوبي بسيط يرد هنا لقياس نفاذية ظهارة الأمعاء. في المختبر، يتم مطلي الخلايا 2BBe كربونات الكالسيوم في الآبار زراعة الأنسجة كأحادي الطبقة والمقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال (ثالثا) يمكن أن تقاس بمقياس الظهارية (فولت/أوم). هذا الأسلوب مقنع بسبب عملية سهلة الاستعمال والتكرار. الفئران الحية، جافاجيد مع 4 كاتشين fluorescein isothiocyanate (فيتك)-يتم قياس تركيزات فيتك-ديكستران ديكستران وفي عينات مصل الدم التي تم جمعها من الفئران لتحديد نفاذية الظهارية. تزقيمية شفوي يقدم جرعة دقيقة، وذلك هو الأسلوب المفضل لقياس النفاذية المعوية في فيفو. أخذت معا، هاتين الطريقتين يمكن قياس النفاذية ظهارة الأمعاء في المختبر و في فيفو، ومن ثم استخدامها لدراسة العلاقة بين الأمراض ووظيفة الحاجز.

الخلايا الظهارية المعوية ليست مسؤولة عن امتصاص المواد المغذية فحسب، ولكن أيضا تشكل عائقا هاما الدفاع عن نفسه ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض والسموم الميكروبية. وينظم هذه الدالة الحاجز المعوي نفاذية مفرق ضيق والخلايا الظهارية سلامة^1،،من²³، والخلل الوظيفي لوظيفة الحاجز الظهارية يرتبط مع التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين). خاتم أكتوميوسين بيريجونكشونال (PAMR) تقع داخل الخلية غير متجاورة عن كثب للوصلات ضيق. تقلص PAMR، الذي ينظمه في سلسلة الميوسين الخفيفة (حركة تحرير الكونغو)، أمر حاسم لتنظيم مفرق ضيق نفاذية^4،5،6،،من^{78، 9،10}. عامل نخر الورم (تنف) أمر أساسي لفقدان جدار الأمعاء بحركة تحرير الكونغو الظهارية المعوية أوبريجولاتينج كيناز (ملكك) التعبير وحمل أوككلودين استيعاب^11،،من¹²¹³.

يمكن عبور أيونات مثل Na⁺ و Cl^– الفضاء باراسيلولار ب مسار المسامية أو تسرب¹⁴. في ظهارة "راشح"، تعكس التغييرات في تير أساسا مفرق ضيق تغيير النفاذية. قياس مكررا ثانيا نهج الكهربية المستخدمة عادة لقياس النفاذية مفرق ضيق، أساسا إلى نا⁺ و Cl^-، استناداً إلى المقاومة مونولاييرس الخلية. وأبلغ أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك الخلايا الظهارية المعوية والرئوية الخلايا الظهارية، والخلايا البطانية الوعائية، للقياسات مكررا ثانيا. فوائد هذا الأسلوب هي أن القياسات ثالثا غير الغازية ويمكن استخدامها لرصد خلايا حية في الوقت الحقيقي. وباﻹضافة إلى ذلك، تقنية قياس تير مفيد ل الدراسات السمية المخدرات¹⁵.

كربونات الكالسيوم-2BBe الخلايا خلايا غدية القولون الظهارية البشرية مع هيكل ووظيفة مشابهة للخلايا الظهارية المعوية صغيرة متباينة: فعلى سبيل المثال، يكون هذه الخلايا زغيبات والأنزيمات المرتبطة بفرشاة صغيرة في الأمعاء الحدود. ولذلك، ومثقف 2BBe كربونات مونولاييرس تستخدم كنموذج في المختبر لاختبار وظيفة الحاجز.

في الفئران، إحدى الطرق لدراسة نفاذية الأمعاء باراسيلولار بقياس قدرة فيتك-ديكستران على عبور الدم من التجويف. وهكذا، يمكن تقييم نفاذية الأمعاء قبل جافاجينج فيتك-ديكستران مباشرة في الفئران وقياس الأسفار داخل الدم. البروتوكول التالية توضح هذه المقالة طريقتين بسيطة لتقييم نفاذية ظهارة الأمعاء في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.

واعتمد هذه الدراسة برعاية الحيوان واستخدام بروتوكول من كامبردج-سودا الجينوم مركز الموارد (كام-سو)، جامعة سوشو.

1-طلاء وصيانة 2bbe كربونات الكالسيوم في أغشية البولي المسامية

1. تنمو الخلايا في قارورة T75 مع وسائل الإعلام (دميم التي تحتوي على 10% FBS). وينبغي تغذية قوارير بانتظام، اعتماداً على كثافة الخلية.
   ملاحظة: لطلاء الأمثل، الخلايا ينبغي تقسيم سرعة وشكل مسطح "قلي البيض"، التي تشير إلى أن الخلايا في مرحلة النمو.
2. عندما تكون الخلايا روافد 80%، تأخذ قارورة خارج الحاضنة وقم بإزالة الوسائط. شطف أي وسائط الإعلام المتبقية مع 1-2 مل PBS العقيمة (دون Ca^{2 +}). بيبيت 1.5 مل التربسين-يدتا قارورة ولطف روك قارورة؛ ثم، ضع قارورة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة دون هزاز.
3. في حين يتم تريبسينيزينج الخلايا، إدراج مكان تحتوي على أغشية البولي المسامية (حجم المسام، 0.4 ميكرومتر؛ المساحة السطحية، 0.33 سم²؛ انظر الجدول للمواد) في لوحات 24-جيدا. إضافة مل 1.0 من وسائط الثقافة في قاعة القاعدية (المسافة الدنيا للغشاء).
4. بيبيت 5 مل من وسائل الإعلام في قارورة وشدة بيبيت الخلايا ضد الجانب من قارورة 5-10 مرات لتحقيق الخلايا فضفاضة، فرادى أو الخلية 2-3 كتل.
5. لوحة 0.166 مل خلايا (تحقيق نسبة تخفيف 1:8) في قاعة قمي (الفضاء العلوي للغشاء). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
   1. تغذية الخلايا ثلاث مرات أسبوعيا بعناية يسفط وسائل الإعلام من حجرة القاعدية لكل جيدا باستخدام مضخة ضغط. بلطف بالتنقيط 1 مل من وسائل الإعلام في الدائرة قمي بكل إدراج.

2-استخدام عداد الظهارية (فولت/أوم) لقياس مكررا ثانيا

ملاحظة: بعد 3 أسابيع ثقافة في أغشية البولي، 2BBe كربونات الخلايا على استعداد لقياس مكررا ثانيا.

1. الدراسات سيتوكين، يوم واحد قبل القياس، استبدال الوسائط القاعدية مع الوسائط التي تحتوي على 10 نانوغرام/مل من IFNγ. في يوم التجربة، استبدال الوسائط مع حبس تحتوي على 2.5 أو 7.5 نانوغرام/مليلتر من تنف.
   ملاحظة: العلاج IFNγ يزيد من التعبير عن مستقبلات تنف 2 (TNFR2)¹⁶.
2. لتصحيح المقياس، أدخل مسرى التصويب في منفذ الإدخال، واختر الوضع "أوم". ضبط المسمار الصفة R مع مفك براغي حتى المتر بعرض قراءة من 1,000 Ω.
3. تعقيم أقطاب كهربائية بوضعها في الإيثانول 70% لمدة 15-30 دقيقة، ومن ثم السماح لهم بالهواء الجاف شطف س. 15 مسرى في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التجريبية.
4. تشغيل الطاقة، واختيار الوضع "أوم". بعناية وضع نهايات الجسور قطب الطويل في قاعة القاعدية ونهايات قصيرة في قاعة قمي. ضمان أن أقطاب أطول لمس الجزء السفلي من الطبق، مع الحفاظ على الأقطاب أقصر تحت السطح لوسائل الإعلام ولكن أعلاه إدراج زراعة الأنسجة. الاحتفاظ الأقطاب الرأسي.
5. قياس المقاومة لإدراج نموذج وإدراج فارغة (أي، إدراج الثقافة دون الخلايا ولكن مع حبس) في 0، 1، 2، 3، 4 ح بعد العلاج سيتوكين. سجل المقاومة.
6. ولتحقيق الاتساق عبر لوحة مختلفة الأشكال، حساب ناتج المقاومة ومنطقة الغشاء فعالة:
   
   لإدراج 24-جيدا، هي منطقة الغشاء فعالة 0.33 سم².

3-نموذج مورين ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS)-التي يسببها التهاب القولون

1. إضافة DSS يعقم الماء إلى تركيز نهائي من 3.5% (wt/المجلد).
2. إدارة 3.5 ٪ DSS لذكور الفئران C57BL/6 8 عاماً في الأسبوع لمدة 7 أيام. إعطاء مياه الشرب العادية دون مفاجآت صيف دبي لمكافحة الفئران.
   1. تبديل الماء DSS المحتوية على مياه الشرب العادية بعد يوم 7.
3. وزن الفئران وتقييم عشرات السريرية لكل الماوس كل يوم. تطبيع كل الماوس لوزن الجسم الأولية لها من وزن الجسم. عشرات تتحدد وفقا لشدة المرض بالمعلمات الأربعة: انسدال المستقيم (0-2)، واتساق البراز (0-2)، والنزيف (0-2)، والنشاط (0-2)⁵. مجموع العشرات من هذه المعلمات للنتيجة نهائية سريرية.
4. لتحليل حالة نسيجية أنسجة القولون، euthanize الفئران بالحقن داخل (القائمة) مع 1.2% (المجلد/المجلد) أفيرتين (0.6 مل/10 غرام وزن الجسم) 7 أيام DSS وظيفة العلاج. إعداد مخزون من 100% أفيرتين، خلط 10 غم من 2,2,2-تريبروموثانول مع 10 مل الكحول ثالثي-الأميل.  تخزين في الظلام في 4 درجات مئوية. لاستخدام، تضعف الأسهم 100 في المائة إلى 2 في المائة في المياه.
5. عزل في القولون والاعور، وقياس طول القولون⁵.
6. قطع شرائح 0.5 سم من القولون القاصي والإصلاح في أنبوب صقر 15 مل تحتوي على 10 مل فورمالين 10% بين عشية وضحاها. تغسل الأنسجة الثابتة مع الإيثانول متدرج (75 و 95 و 100 في المائة) وزيلين نفط. قم بتضمين الأنسجة في البارافين وقطع المقاطع 6 مم الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ⁸.

4-قياس نفاذية الحاجز الظهارية في الفئران المستحثة بمفاجآت التهاب القولون

1. قياس النفاذية حاجز 7 أيام بعد بدء الإدارة إدارة السلامة والأمن.
2. في يوم المقايسة، بسرعة الفئران ح 3.
3. اﻷوتوكﻻف تزقيمية مدتها إبرة للتأكد من العقم، ثم تزقيمية الفئران مع 150 ميليلتر 80 ملغ/مل 4 كاتشين فيتك-ديكستران في المياه المعقمة، وإبقاء فيتك-ديكستران غير المستخدمة لقياس المنحنى القياسي بعد جمع المصل. وزن الفئران لحساب النفاذية.
   ملاحظة: ينبغي حل فيتك-ديكستران في المياه.
4. باستخدام مقص، مقطع قطعة 1 سم للذيل، وجمع 100 ميليلتر من الدم من الذيل إلى أنابيب جمع المصل. زيادة ونقصان الدم التي تم جمعها في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. تمييع 1:4 المصل في المياه. جعل معيار المنحنى، وتمييع ديكستران فيتك غير المستخدمة مع الماء في رافعة، 1:1، 000، 1:3، 000، 01:10، 000، 01:30، 000، 1: 100، 000، 1: 300، 000، 1:1، 000، 000، و 1:3، 000، 000. إضافة 100 ميليلتر/جيدا من المصل والعينات المنحنى المعياري في لوحات 96-جيدا.
6. قراءة الأسفار في قارئ لوحة مع 485 الإثارة/528 الانبعاثات. حساب قيم النفاذية استناداً إلى المنحنى المعياري، وضرب 4 لتصحيح للتخفيف.
7. تقسيم تركيز فيتك-ديكستران من الوزن لتطبيع القيم (وهذا يساعد على تطبيع الفرق في إيصال فيتك-ديكستران إذا الفئران المريضة وقد فقدت الوزن).

في الثقافة، وتنمو كأحادي الطبقة خلايا 2BBe كربونات الكالسيوم وتفرق ببطء في النضج انتيروسيتيس الاستيعابية التي لها حدود الفرشاة. في هذا البروتوكول، كانت مطلية 2BBe كربونات الخلايا ذات كثافة عالية في أغشية البولي وخلايا بلغت 100% كونفلوينسي يوم واحد بعد البذر. ومع ذلك، خلايا غير متمايزة في هذه المرحلة: تم تغيير الوسائط تماما التفريق بين الخلايا، كل 2-3 أيام لمدة 3 أسابيع. الخلايا كانت ملطخة بنوي والبقع واكتين لإظهار الاختلافات بين خلايا غير متمايزة ومتباينة. وتعتبر ألياف الإجهاد الواضح في خلايا غير متمايزة. بالمقارنة مع خلايا غير متمايزة، تحتوي الخلايا المتمايزة حجم أصغر ونوى أكبر وأقل إجهاد الألياف (الشكل 1).

تنف أمر محوري لفقدان جدار الأمعاء عن طريق التنظيم مفرق ضيقة تعتمد على ملكك. وقد تم تحليل مكررا ثانيا خلايا دون أو مع العلاج تنف في نقاط زمنية مختلفة. كما هو مبين في الشكل 2، تنف يقلل بشكل ملحوظ ثالثا من أحادي الطبقة 2BBe كربونات الكالسيوم بطريقة تعتمد على الجرعة، مما يوحي بأن تنف يزيد من نفاذية الظهارية.

إدارة مفاجآت الحث على التهاب القولون الحاد في الفئران. الوزن الفئران تعامل مع إدارة السلامة والأمن إلى حد كبير مقارنة بوزن الجسم الأولية (الشكل 3A). وسجل خطورة التهاب القولون هو انسدال المستقيم واتساق البراز، والنزيف، والنشاط (الشكل 3B). إظهار المقاطع العرضية للأنسجة colonic ملطخة الهيماتوكسيلين & ويوزين colonic تلف الأغشية المخاطية في مفاجآت صيف دبي معاملة الفئران (الشكل 3). انخفض طول سرداب القولون في الفئران DSS تعامل (الشكل 3D). هو تقصير طول القولون في الفئران DSS تعامل (الرقم 3E). كما يتضح في الشكل 3F، هناك زيادة إضعاف تقريبا في مستويات فيتك-ديكستران في الفئران DSS معاملة مقارنة بالسيطرة على الفئران.

رقم 1: 2BBe كربونات الخلايا المزروعة في أغشية البولي. الخلايا المستزرعة يوم 1 (متمايز) و 3 أسابيع (الكامل-متباينة) بعد الطلاء ملطخة مع هويشت 33342 (أزرق) لنواة واليكسا فلور فالويدين 594 لواو-أكتين (أحمر). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تنف يقلل ثالثا من أحادي الطبقة كربونات الكالسيوم-2BBe- الخلايا معبي مع 10 نانوغرام/مل من IFNγ بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، يتم استبدال المتوسطة الثقافة بحبس تحتوي على 2.5 أو 7.5 نانوغرام/مليلتر من تنف. ثالثا يقاس مقياس الظهارية (فولت/أوم) في النقاط الزمنية المشار إليها. يعني ± ووزارة شؤون المرأة، تكون قيم n = 4. يتم الإشارة إلى اختلافات كبيرة من * (ف < 0.05) و * * (ف < 0.01)، بالمقارنة مع قيم الخلايا دون علاج تنف، مكررا ثانيا من الذيل اثنين تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: DSS الناجمة عن التهاب القولون في الفئران. C57BL/6 ذكور الفئران تعطي 3.5% مفاجآت في مياه الشرب لمدة 7 أيام. الجسم الوزن (A) وعشرات السريرية (ب) يتم تقييمها يوميا لكل مجموعة (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 4 لكل فريق). تلقت الفئران مراقبة المياه دون مفاجآت. (ج) التحليل النسيجي لأقسام الأنسجة colonic المجمعة على العلاج 7 وظيفة – إدارة السلامة والأمن اليوم. القولون (د) يتم قياس أطوال سرداب على العلاج 7 وظيفة – إدارة السلامة والأمن اليوم. القولون (ه) يتم قياس أطوال على العلاج 7 وظيفة – إدارة السلامة والأمن اليوم. نفاذية (F) من القولون ظهارة يقاس على العلاج بعد 7-مفاجآت صيف دبي يوم تزقيمية فيتك-ديكستران. يعني ± ووزارة شؤون المرأة، تكون قيم n = 4. يتم الإشارة إلى اختلافات كبيرة من * (ف < الذيل 0.05 قبل يومين t-اختبار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1. الأمراض السريرية نقاط

وهناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. كربونات الكالسيوم-2BBe (فرشاة الحدود-وإذ يعرب عن) خلايا تستخدم دائماً لقياس تير، مختارة من خط خلية كربونات الكالسيوم-2 للتعبير عن البروتينات الفرشاة للحدود. تحتوي الخلايا 2BBe كربونات الكالسيوم من النمط الظاهري الاستيعابية الزوائد عند متباينة تماما (بعد حوالي 3 أسابيع من ثقافة ما بعد التقاء)¹⁷. من الضروري تجنب التلوث أثناء القياس، وتعقيم مسرى. لأن هذا الإجراء غير معقمة، يمكن إجراء القياسات فقط لمدة تصل إلى 8 ساعات في معظم الحالات. أثناء القياس، عقدنا العزم على قيمة مقاومة النقطتين داخل وخارج الإدراج. يمكن أن تختلف قياسات المقاومة في مواقع مختلفة في بعض الأحيان إلى حد كبير بسبب الاختلافات في حالة الخلية؛ وهذا يشكل قيداً رئيسيا للأسلوب. ومع ذلك، يمكن تخفيض هذا التباين إلى حد كبير بالأساليب الإحصائية وأساليب أخرى. يمكن تطبيق الأسلوب مكررا ثانيا إلى خلايا أخرى، مثل تحديد سلامة الحاجز الخلايا الظهارية الرئوية والخلايا البطانية الوعائية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام قياسات تير في دراسات السمية المخدرات.

إدارة جزيئات الهضم، الذي أدخل ظهارة الأمعاء من خلال نشرها، يمكن استخدامها لتقييم نفاذية الأمعاء. وميزة هذا الأسلوب أن الدالة جدار الأمعاء يمكن النظر في فيفو. وهناك عدة أنواع من العلامات التي يمكن استخدامها، بما في ذلك النظائر المشعة، والبولي إيثيلين الجليكول، والسكريات¹⁸. ومع ذلك، ينبغي النظر في عدة عوامل لدقة قياس النفاذية: (1) دائماً لا يمكن التحديد تحديد موقف شذوذ جدار الأمعاء؛ و (2) تدفق الدم المخاطي والحركة المعوية قد تؤثر على الامتصاص وإفراز الجزيئات.

في هذه الدراسة، كانت تدار 4 كاتشين فيتك-ديكستران إينتراجاستريكالي في الفئران وتم قياس مقدار فيتك-ديكستران في المصل الماوس. هذا الأسلوب له مزايا عديدة. تزقيمية الفم يقلل من المخاطر المحتملة المرتبطة باستخدام الحقن الشرجية. على سبيل المثال، قد يكون سبب الضرر غير المقصود ظهارة colonic تقطير المستقيم، يؤدي إلى نتيجة إيجابية كاذبة. وينبغي أيضا إزالة الآثار الإضافية الناجمة عن الإجهاد. ومن المعروف نفاذية زيادة عندما يتم التشديد على الفئران. من المستحسن إجراء تجربة أولية على الأقل أسبوع واحد قبل التجربة الفعلية. القيام بتجربة ممارسة ستساعد على تقليل الضوضاء تجريبية للتجربة الحقيقية. عنصر تحكم البرية من نوع (أي علاج) ينبغي إدراج دائماً.

فيتك-ديكستران ينتقل عن طريق الأمعاء وتبدأ في إدخال النقطتين ح 3 بعد جافاجينج. وهكذا، ح 3 نقطة وقت مثالي لقياس نفاذية الأمعاء الصغيرة. لقياس النفاذية colonic، يمكن تمديدها، لكن هذا الوقت ثم يصبح توازن بين تسرب فيتك-ديكستران في التجويف وإزالة هذه الجزيئات من مجرى الدم. ح 4 المقبول عموما كنقطة في وقت المناسب للقياسات colonic.

وفي الختام، وصفت طريقتين منفصلة لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. بينما القياس تير وأساليب تزقيمية فيتك-ديكستران قياس النفاذية باراسيلولار، كل منهما توفير خصائص النفاذية باراسيلولار مستقلة ومتميزة.

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

ونحن نشكر الدكتور جيرولد R. تيرنر، من مستشفى بريغهام والنساء، مدرسة هارفارد الطبية، لمساعدته السخية في إتمام هذه الدراسة. هذا العمل معتمد من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81470804 و 31401229 و 81200620)، ومؤسسة العلوم الطبيعية من جيانغسو (المنحة رقم BK20180838 و BK20140319)، "البحوث الابتكار برنامج" ل خريجي كلية من مقاطعة جيانغسو (رقم المنحة KYLX16-0116)، متقدمة البحث المشاريع من سوشو جامعة (المنحة رقم SDY2015_06)، وكرون والتهاب القولون مؤسسة بحوث جائزة الزمالة (منح رقم 310801).