Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Hücre içi pH (pHi) değişimler, metabolizma, yayılmasını önleme ve farklılaşma da dahil olmak üzere birçok hücresel fonksiyonların yönetmelikte önemli rol oynarlar. Genellikle, pHi dynamics ölçme ve deneysel olarak pHi değiştirmeye mükellef bulunmaktadır kültürlü hücrelerdeki belirlenir. Ancak, son gelişme metodolojileri ve yeni araçlar pHi dynamics bozulmamış, canlı doku içinde çalışmaya mümkün kıldı. Drosophila araştırma için bir önemli gelişme pHi Biyoalgılayıcı taşıyan bir transgenik satır nesil oldu mCherry::pHluorin. Burada, biz düzenli olarak görüntüleme canlı Drosophila ovarioles için epitel folikül kök hücre (FSC) soy mCherry::pHluorin transgenik vahşi türü satırlarındaki pHi ölçmek için kullandığımız bir protokol tanımlamak; Ancak, yöntem tanımlamak burada kanat diskler ve göz epitel de dahil olmak üzere diğer dokular için kolayca adapte edilebilir. Biz FSC soy mCherry::pHluorin ifade etmek için teknikleri yumurtalık dokusu canlı görüntüleme ve edinme ve pHi değerler elde etmek için görüntüleri analiz sırasında korumak açıklar.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir rol pHi değişimler için hücresel farklılaşma displazi vivo içinde^1,ve²sırasında ortaya koydu. Bu çalışmalar bir aşamasından geçiş hücreleri olarak değişir ama bu o pHi son derece tutarlı farklılaşma, aynı tür aynı aşamada hücrelerde bulunur. Bazı durumlarda, pHi değişimler kısmen engelleme farklılaşma, pHi değişikliği sadece bir hücre kader değişimler sonucu değil ama bunun yerine belki de pH duyarlı düzenleyici etkisi ile hücre kaderi değiştirmek tanıtmak için yardımcı olur düşündüren bozan proteinler veya kimyasal reaksiyonlar farklılaşması için gerekli. Gelecekteki çalışmalar pHi dynamics vivo içindebirçok farklı rolleri içine daha fazla fikir ortaya potansiyeline sahip. Ancak, doğru ölçümler Phi pHi sırasında farklılaşma vivo içinde eğitim zorluklardan biri almaktır. Diğer şekil-in hücresel morfoloji ve gen ekspresyonu, değişiklikler gibi farklılaşma pHi bir değişken kimyasal özelliği sabit ve standart yöntemlerle permeabilized hücrelere korunmaz hücre benzemez. Buna ek olarak, pHi istikrarlı streslisin hücrelerdeki veya deneysel manipülasyon sonucu ölen olmayabilir. Böylece, pHi ölçerken hücreleri canlı ve mümkün olduğu kadar sağlıklı tutmak önemlidir. Birkaç hayati boya iş hücre kültür³ama birçok pHi ölçme durumlarda için onlar iyi ki uygun değildir çünkü onların doku derin veya eşit nüfuz değil in vivo çalışmalar için kullanılabilir doğru ölçümler sağlamak yeterli .

Zavallı boya penetrasyon sorunu aşmak için biz ve diğerleri genetik olarak kodlanmış bir sonda, özellikle hücreye ifade mCherry::pHluorin^4,5,6,7, kullanmıştır faiz ve içinde görüntülü canlı doku türleri. pHluorin olduğunu GFP bir değişken ile daha yüksek bir pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) bu kıvrımlar daha kolay daha yüksek pH; Bu yüzden pHluorin moleküllerinin hücredeki bir popülasyondan yayılan toplam floresan yoğunluğu pHi⁸artan ile artar. Önemlisi, Floresans pHi değerleri normal sitozolik aralıkta doğrusal. Buna karşılık, mCherry floresan (pKa ~ 4.5) sitozolik aralığındaki pH değişimlerine duyarsız. Bu iki gazetecilere kovalent bir tek chimeric protein, böylece her zaman eşit miktarlarda mevcut tek açık okuma çerçevesi tarafından kodlanmış olarak birbirine bağlı. Bu nedenle, pHluorin için mCherry floresan yoğunluğu oranı her hücrede sonda konsantrasyon için normalleştirilmiş Phi bir ölçüm sağlar. Oranları tahminleri pHi değerleri bilinen pH değerine equilibrated dokulara gelen pHluorin mCherry oranları elde ederek oluşturulan standart bir eğri kullanarak dönüştürülebilir.

Burada, Drosophila yumurtalık içinde epitel FSC soyundan pHi ölçmek için mCherry::pHluorin kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. Bu iyi karakterize doku epitel biyoloji, kök hücre kendini yenileme ve farklılaşma^9,10,11, toplu hücre göç^{12 gibi birçok farklı yönleri model oluşturmak için kullanılan} , geliştirme ve bakım hücre polarite^13,14. Folikül epitel doku ön kenarında germarium^15,16adı verilen bir yapısında bulunan iki FSCs tarafından üretilmektedir. Sırasında düzenli olarak yetişkinlik kendini yenilemek ve döl, niş yeniden girebilir ve bir FSC olmak veya üç farklı folikül hücre türden birine ayırt prefollicle hücreleri (PFC) denilen üretmek için bu hücreleri Böl: kutup hücreleri, SAP hücreler, veya Ana gövde folikül hücreleri. Biz daha önce wildtype dokusunda pHi farklılaşma yaklaşık FSCs yılında 6,8 PFC, 7.0 pHi üzerinden 7,3 folikül hücreleri²için erken aşamalarında giderek artar gösterdi ki. Bu artış bir ubiquitously ifade sodyum/proton değiştirici, DNhe2, RNAi nakavt tarafından engelleme ciddi pFC farklılaşma bozar, pHi DNhe2 overexpression tarafından artan ise hafif bir aşırı farklılaşma neden olur fenotip. Bu bulgular pHi stabil erken FSC lineage korunur ve deneysel olarak olabilir artırılması veya azaltılması vivo içindegöstermektedir. Yöntem tanımlamak burada pHi wildtype doku ya da mutant dokular, RNAi nakavt veya faiz ve Mitotik klonları bir Gal4 kullanarak overexpression da dahil olmak üzere çeşitli formları ölçmek için kullanılabilir.

Not: pHi FSC Silsilesi içinde ölçmek için Floresans yoğunluklarını, pHluorin mCherry FSCs, PFC ve folikül hücreleri fizyolojik koşullar için oranını hesaplamak ve pHi değerleri standart oranları dönüştürmek her hücre için kalibrasyon eğrileri ⁷ yazın. İlk, canlı görüntüleme deneyler Floresans yoğunluklarını pHluorin ve mCherry germaria NaHCO ₃ fizyolojik şartlarda ^{1 ,} taklit eden, içeren bir arabelleğe disseke ölçmek için gerçekleştirilir ⁷. sonraki, standart eğrileri na ⁺ pHluorin ve mCherry floresan yoğunluklarını ölçerek oluşturulur-ücretsiz, K ⁺ arabellek ionophore nigericin içeren iki farklı pH değerine ayarlanmış 6.5 ve 7,5. Nigericin huzurunda, pHi pHi ekstrasellüler pH eşleştirilecek neden plazma zarı arasında tampon pH ile Sakinleştiği. Son olarak, standart eğrileri pHluorin mCherry oranları tahmini pHi değerlere dönüştürmek için kullanılır.

1. duruşma öncesi: önce hazırlık ölçme pHi In Vivo

Not: pHi vivo ölçmek için mCherry::pHluorin transgene faiz hücre türü ifade edilebilir. Aşağıda transgenik pHluorin üretmek için ortak bazı yollar FSC lineage sinekler vardır. MCherry::pHluorin klonlar üretiliyor FSC klon ön kenarında bulunan FSCs tanımlamak için özellikle yararlıdır. Doku belirli mCherry::pHluorin ifade tüm doku pHi ölçmek için yararlıdır ve aynı zamanda bir RNAi veya transgene ifade ile birleştirirken daha uygundur.

1. MCherry::pHluorin etiketli-FSC transgenik pHluorin nesil uçar
   1. mCherry::pHluorin FSC klonlar, yapmak klonlar
      1. çapraz UAS-mCherry::pHluorin ¹ bir Act-Gal4 fiske vurmak için hisse senedi veya diğer hisse senedi ile Flp/FRT indüklenebilir Gal4.
      2. Heatshock indüklenebilir klonlar, heatshock yapmak eclosion bir 37 ° C su banyosunda dört kez yaklaşık 12 her h. 1 h için boş şişeleri içinde yetişkin F1s 2 gün sonrası
      3. Uçar normal büyüme ve oogenesis en büyük oranda bu dönemde emin olmak için taze ıslak Maya sağlayarak korumak (yaklaşık eşit parçaya kuru baker ' s Maya ve su) günlük için en az 6 gün sonra klon indüksiyon.
   2. Doku belirli mCherry::pHluorin ifade
   3. çapraz UAS-mCherry::pHluorin ¹ folikül hücre belirli bir sürücü için y ¹ w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington kimliği: 7023).
   4. 3 gün sonra eclosing, sinekler başlatmak toplamak ve en az 24 saat önce diseksiyon için ıslak Maya içeren şişeleri yerleştirebilirsiniz.
2. Çözümleri yapma
   Not: tampon pH ve çözünen konsantrasyonlarda zamanla değişebilir çünkü aşağıdaki arabellekleri deneme günü hazırlamak önemlidir.
   1. Hazırla bikarbonat, nigericin ve diseksiyon arabellekleri. Bileşenleri sırada listelenen precipitates (Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3 bakın) oluşumunu önlemek için eklemek.

2. Deneme: FSC Lineage pHi ölçme

Not: diseksiyon, montaj ve canlı görüntüleme bikarbonat tampon ve iki nigericin tampon koşulları için adımları iki kez yapılması gerekebilir: mikroskop belirlemek için bir kez ayarları ve ikinci kez deneysel veri toplamak için. 2.2 aşağıda daha fazla bilgi için bkz:.

1. Diseksiyon ve montaj
   Not: Bu adımı gerçekleştirmek için gereken malzemeler için bakınız şekil 1 ve Tablo malzemeler için. 3D yazdırılan montaj salonları için 3D yazıcı dosyaları ek dosya 1 ve ek dosya 2 sağlanır.
   1. Diseksiyonu:
      1. hazırla montaj Odaları ince bir kaplama vakum yağ 3D düz tarafına uygulayarak yazdırılan montaj odası. Coverslip montaj odasına imzalamaya 22 x 40 mM coverslip o tarafa yerleştirin.
   2. Yumurtalık kadın yetişkin sinekler 500 µL diseksiyon arabelleği (bikarbonat veya nigericin tampon, Tablo 3) üzerinden incelemek
      1. 3-4 sinekler CO ₂ gaz kullanarak anestezi ve transfer uçar CO ile derin bir sinek yastık üzerine ₂ gaz.
      2. İmzalat bir sinek kadar forseps ve yer diseksiyon medya içine almak.
      3. Bir forcep, sinek göğüs, yumurtalık maruz kadar onun karın ucunda çekiştirmeye süre çimdik.
      4. Yumurtalıklar diğer organlara üzerinden ayırma sonra ayrı 22 ^1/2 şırınga iğneleri kullanarak ovarioles tease. Dikkatle ayrı kas kılıf yumurtalık ve ovarioles kümesinden ayrı tek tek ovarioles. Kas kılıf yalıtmak için etkili bir teknik ovarioles küme ön tarafında yerde tutun ve aşağı doğru tek ovarioles uzunluğu boyunca inme bir şırınga iğnesi kullanmaktır.
      5. Böylece tam nigericin diseksiyon ortam pH ile equilibrate hücrelerinin pHi için yeterli zaman montaj adıma geçmeden önce tam olarak 10 dk diseksiyon medyada disseke yumurtalık kuluçkaya.
         Not: kas kılıf ovarioles kaldırıldığından emin olmak. Kas kılıf kullanarak tek tek hücreleri tanımlamak zordur Floresans sinyal azaltmak Concanavilin-A ve canlı görüntüleme sırasında kendiliğinden taşımak ovarioles neden olabilir.
   3. Montaj
      1. diseksiyon medya cam coverslip üzerine küçük bir damla içinde montaj odası yerleştirin.
      2. Transfer ayrılmış forseps kullanarak ovarioles.
      3. Önceki sahne yumurta chambers ile ilişkili germaria dan sonraki sahne yumurta odaları ayrı ve disseke germaria diseksiyon medya bırakma Merkezi'nde yerleştirilir emin olmak deneyin.
      4. Yuvarlak bir 12 mm coverslip ters tarafı için tırnak cilası iki küçük damla ekleyin ve yaklaşık 10 için kurutma s.
      Öyle ki tırnak cilası ile o tarafı aşağı bakıyor olmalıdır ve diseksiyon medya rehber
      5. yer yuvarlak coverslip üstünde belgili tanımlık damla diseksiyon medya içeren germaria ayrılmış. Oje dümdüz ve germaria pozisyonda güvenli kenarlı parçalarda bastırın. Çünkü o yerde güvenli olarak daha az coverslip yüzey üzerinde smear büyük tırnak cilası kullanmanızı öneririz.
      6. Montaj odası ek diseksiyon medya ile doldurun. Concanavalin-A boya içeren belirli bir arabellek durum-ebilmek var olmak kullanılmış-odası doldurmak için.
         Not: Harcanan toplam zaman anatomi ve montaj 15dk aşmaması gerekir. Bu doku hasarı etkilerini en aza indirmek önemlidir ve hücre ölüm.
2. Canlı görüntüleme:
   Not: Bu adımda, önce bikarbonat durumu ve uygun mikroskop ayarları belirlemek için iki nigericin koşul görüntüleri toplamak; mikroskop ayarları gerektiği gibi ayarlayın ve görüntüler için deneysel veri toplamak. Confocal mikroskop görüntüleme yeteneğine sahip 3 kanallarında kullanın: GFP (475 uyarma/509 emisyon), mCherry (575 uyarma/610 emisyon) ve far-red (633 uyarma/647 emisyon).
   Not: Kümesi mikroskop ayarları: toplanan görüntülerin piksel yoğunluklarda yoğunluk değerleri her resim kümesindeki sinyalinin ne çok düşük ne de doymuş olduğunu önemlidir bu yüzden Phi, tahminleri belirlemek için sayılabilir. Bir görüntü yakalanan yoğunluklarını dizi görüntü bit derinliği tarafından tanımlanır. Birçok durumda, 8 bitlik görüntüler varsayılan olarak oluşturulur, ancak daha geniş bir dinamik alan var 16-bit görüntüleri veri alma öneririz. Crosstalk floresan kanallar arasında en aza indirilir, böylece emisyon spektrum toplanan ayarları ayarlanması gereken bu yüzden her fluorophore değil üst üste emin olmak önemlidir. Bu ayarları sınamak için GFP için uyarma spektrumu kullanılarak bir örnek görüntü almak ve mCherry ve tersi için emisyon spektrumda toplamak. Eğer ayarları düzgün ayarlanabilir olması, her iki durumda da hiçbir sinyal olmalı. Böylece tüm üç görüntü kümeleri içinde sinyal piksel yoğunluklarda resim dosyasının dinamik aralığı içinde mikroskop (Yani, bir lazer tarama voltaj ayarları confocal, lazer güç ve iğne deliği boyutu) ayarlarını. Bizim deneyler için gerektiği gibi gerilim kazancı her deneme için optimize ederken 1.024 × 1024 biçimdeki 16-bit görüntüleri elde etmek için 40 x amacı ile confocal mikroskobu tarama beyaz bir ışık lazer kullanılır. Örneğin, bir deneyde, GFP, mCherry, gerilim kazancını ayarlayın ve %37.8, %72.9 ve %260, far-red anılan sıraya göre.
   1. Görüntü ovarioles nigericin diseksiyon tampon pH 6,5 ve öyle ki pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda düşüktür ama kameranın algılama sınırları aşağıda ayarlarını.
   2. Ovarioles içinde nigericin diseksiyon tampon pH 7.5 başka bir set görüntü ve yüksek, ama değil doymuş pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda vardır öyle ki ayarlarını.
   3. Görüntü yumurtalık bikarbonat diseksiyon tampon ve pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda seçtiğiniz ayarlarla doymuş değil emin olun. Piksel doymuş, ayarları gerektiği gibi ayarlayın.
      Not: ayar parametreleri farklı olabilir mikroskop kullanılan tam mikroskop kurulumu temel alınarak ve her deneme için optimize edilmiş olması gerekir. Mikroskop ayarlarını ayarladıktan sonra bunları deneme geri kalanı için değiştirmeyin. Ayarları kontrol ve deneysel koşullar arasında tutarlı olması gerekir. Bizim ilk pHi deneylerde, 2 ve 3 nokta nigericin kalibrasyon eğrileri oluşturulan ve iki yöntemden herhangi birini kullanarak hesaplanan pHi arasında anlamlı bir fark bulunamadı. Ancak, genel olarak, daha fazla puan kalibrasyon eğrisi içinde ek doğruluğunu geliştirmek için beklenir. Bu nedenle, eğrileri ile puan kaç deneysel koşullar belirli bir kümesi için gerektiğini belirlemek için farklı sayı üreten önerilir.
3. Veri toplama:
   1. montaj ve bikarbonat ve nigericin arabellek koşullarda örneklerinin Imaging diseksiyon, gerçekleştirmek. Bir el örnekleri Imaging diseksiyon ve montaj, en uzun süreyi geçirdikten sonra Floresans yoğunluk ölçümleri canlı, sağlıklı doku yapılır emin olmak için 45 dk geçmemelidir.
   2. Her koşul için en az 5 germaria için görüntüleri elde.

3. Sonrası deneme: Görüntü analizi

1. ölçü Floresans yoğunluklarını FSCs, PFC, ve folikül hücre
   1. arka plan çıkarma:
      1. Açık işlenmemiş FIJI Albümdeki her kanalda bir ayrı pencere (ile şekil 4 c).
      2. Sinyal olmadan görüntünün bir parçasını pHluorin kanal penceresinde bir bölge (ROI) ilgi çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın.
      3. İsteğe bağlı adım: eşik alt sınırı ayarlayabilir, böylece arka plan aşağıda yoğunluk değerlerine sahip pikseller hariç ve eşik üst sınırını maksimuma ayarlayın. Eşik bu şekilde ayarladığınızda, sinyal olmadan görüntünün alanlarını çoğunlukla mavi ve açıkça görülebilir ( şekil 4A) sinyaldir.
      4. Ortalama Floresans şiddeti ROI ölçmek. Eşik adım 3'te ayarlarsanız, kontrol ettiğinizden emin olun " Eşik sınırı " ölçümleri ayarla iletişim kutusundaki.
      5. Ölçülen arka plan yoğunluğu her kanal ve süreç içinde bulunan çıkarma işlevini kullanarak görüntü dilim çıkarma → matematik menü.
      6. Yinele adımları 3.1.1.2-6 adım 3.1.1.2, mCherry kanal penceresinde, hariç için yeni bir dikdörtgen Dikdörtgen aracıyla çizim yerine, geri yükleme seçimi işlevini kullanın, Düzenle buldum → aynı olan bir dikdörtgen eklemek için seçim menüsü boyutları ve konumu görüntüde.
   2. FSCs tanımlamak, PFC ve folikül hücreleri:
      1. FSCs, PFC ve folikül hücre morfolojisi ve hücre sınırları ( Şekil 2) bulmak için kullanarak Concanavalin-A boyama konumuna göre tanımlama.
      2. FSCs bölge 2a/2b sınır germarium kenarında bulunan ince üçgen hücrelerdir. Eğer mCherry::pHluorin bir FSC klon ifade, FSC klon ön çoğu hücre da belirlenebilir.
      3. PFC hücreler düzensiz şekilli bölge 2B, hemen bitişiğinde ve aşağı FSCs.
      4. Folikül hücrelerdir germ hücreli kist bölge 3 çevreleyen kare veya sütunlar halinde hücre.
   3. Floresan yoğunluğu oranları elde etmek
      1. , faiz hücrenin bulunduğu yüksek floresan yoğunluğu mCherry kanalda bir veya birden çok dilim seçin ve Concanavalin-A, far-red kanalda gördüm bir boyama foc olduğundan emin olun Seçili dilim içimizde.
      2. Her FSC ve pHluorin ve mCherry tüm ortalama Floresans yoğunluğunu dilimler ölçümleri için seçilen ölçü ROI çizmek.
      3. PHluorin kanal ortalama Floresans yoğunluğunu pHluorin mCherry floresan için oranını hesaplamak için mCherry kanal ortalama Floresans yoğunluğunu tarafından bölmek.
2. Özellik türet pHi değer verir ve pseudocolored görüntüler oluşturmak
   1. özellik türet pHi değerleri
      1. her durumda, yumurtalık aynı genotip sinekler üzerinden kullanarak doğrusal regresyon eğrisi oluşturulmalıdır deneysel her ikisi için ve kontrol koşulları. İki nigericin tampon koşulları ( şekil 3) verilerini kullanarak her hücre türü için bir doğrusal regresyon eğrisi oluşturur. Excel'de, bu grafikte veri çizme ve doğrusal bir eğilim çizgisi ekleme yapılabilir. Alternatif olarak, bakın:
      2. eğim ve y kesme noktası doğrusal regresyon eğrisi hesaplanan nigericin koşulları ve doğrunun denklemi kullanım (y = mx + b) pHluorin mCherry oranı değerlere dönüştürmek için hesaplanan bikarbonat örneklerinden pH değerleri durumuna. Bu denklemdeki b için eğim formu (y-kesişim noktası) yerine, içinde oranı değeri x için koymak ve y. için çözmek
   2. FIJI oranı değerleri yansıtan bir pseudocolored görüntü oluşturmak.
      1. Takip yukarıdaki yordamı için arka plan çıkarma (Adım 3.1.1 ve şekil 4).
      2. İşlem menüsünden bulunan görüntü hesaplama işlevini kullanarak mCherry kanal pHluorin kanaldan bölün. Emin olun " Oluştur yeni pencere " ve " 32-bit (float) sonucu " onay kutuları işaretli. Arama tablosu (LUT) değiştirmek, termal veya LUT seçtiğiniz görüntü menüsü altında bulundu. şekil 4 uygun diğer seçenekler için bkz:.
      3. Ayarlayın parlaklık ve kontrast iletişim kutusunda (görüntü → ayarla → Parlaklık/Kontrast),'ı tıklatın " ayarla " düğmesi. Küme asgari görüntülenen değeri 0 olarak ve en fazla değer esir alma en iyi bir oranı için görüntülenen veri, genellikle 1.0-2.0 ( şekil 5).

Burada birkaç adımdan oluşur folikül epitel pHi ölçme işlemi anlatmıştık. İlk olarak, yumurtalık anatomi ve montaj için araçlarını kullanarak uygun genotip (şekil 1) sinekler disseke. Ovarioles sonra kantitatif floresan mikroskopi kullanarak yansıma ve görüntüleri Phi ölçümler elde etmek için analiz edilir. Her görüntü için faiz hücre türde bölüm 3.1 (Şekil 2) açıklandığı gibi tanımlanır. Floresans yoğunluklarını GFP ve mCherry kanalları oranı Bölüm 3.2 açıklandığı gibi standart eğri (şekil 3A) kullanarak pHi değerlere dönüştürülür. Bu yöntemi kullanarak, bulduğumuz o pHi erken FSC soyundan, FSCs, 6,8 7.0 7,3 folikül hücrelerinde (şekil 3B) için prefollicle hücrelere farklılaşma ile artar. Her hücre türü pHi değerleri şekil 3Bolduğu gibi grafiksel olarak temsil edilebilir veya pseudocolored bir test pHluorin farklılıkları mCherry oranları gösteren (şekil 4 ve şekil 5). Bu Albümdeki pHluorin farklılıkları mCherry oranlarına bir LUT tarafından tanımlandığı gibi renk, farklılıkları görüntülenir. Verilerin çoğu temsilcisi bir görüntü üretmek için bir LUT ve renk aralığı için maksimum ve minimum değerleri seçmek önemlidir. Her ne kadar genel olarak, LUT ve aralığı ayarlarını seçimi görüntünün içinde mevcut olmayan farklılıklar görünümünü vermek değil, AÜSS daha az uygun bir seçim pHi farklılıklar test (şekil 5) mevcut belirsiz.

Resim 1: Malzemeler için diseksiyon ve montaj Drosophila ovarioles. (A) bir görüntü gösteren: (1) tırnak cilası; (2) yağ ve gres uygulamak için kullanılan ölçek kabı ve damlalıklı ipucu vakum; (3) 23'lik şırınga iğneleri; (4) Dumont Inox forseps, Boyut 5; (5) 3D yazdırılan montaj odası; (6) 22 x 40 mM cam coverslips; (7) yuvarlak cam Coverslips, 12 mm çapında, 0.13-0,16 mm kalınlığı; ve (8) 9-şey cam tabak anatomi. (B) A 3D yazdırılan montaj odası yakın çekim resmin. (C) wildtype yumurtalık disseke çifti gösterilen bir görüntü. (D) bir görüntü gösteren iyi ayrılmış ovarioles. (E) A resim disseke yumurtalık ile 3D odasının altında yuvarlak cam coverslip monte. Siyah noktalar oje yuvarlak coverslip tutmak için kullanılan damlaları. (F) altında yuvarlak bir disseke ovarioles görüntüsünü cam coverslip montaj sonra. Kara kutu ile tek bir disseke ovariole resmin bir bölgesini gösterir. Ölçek çubuklar gösterir yaklaşık 500 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: FSCs, PFC ve folikül hücreleri tanımlayan. İki örnek UAS-mCherry::pHluorin ve 10930-Gal4 ile germaria Concanavilin-A. ile lekeli Bir FSC, bir er ve bir folikül hücre özetleyen bir yatırım Getirisi her resimde gösterilir. Ortalama Floresans yoğunluklarını pHluorin ve mCherry kanalları pHluorin mCherry oranları hesaplamak için kullanılır. Ölçek çubuklar gösterir yaklaşık 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: pHi artar sırasında farklılaşma FSC Silsilesi içinde. Ulmschneider ve ark. alınan temsilcisi sonuçları ² gösteren: mCherry oranlarına; pHluorin pH değerleri hesaplamak için kullanılan (A) tipik bir doğrusal regresyon eğrisi ve (B) hesaplanan pHi değerleri % 95 güven aralıkları FSCs, PFC ve folikül hücreleri ile. Bu rakam Ulmschneider vd izninden sonra adapte edilmiş ². Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: FIJI pseudocolored ratiometric görüntü oluşturmak için kullanarak. Arka plan çıkarma işleminin her adımı sonuçlar(a)görüntüler. İşlenmemiş bir resim (sol kapı aynası) ile başlayarak, ilk arka plan aşağıda yoğunluk değerlerine sahip pikseller dışlanır eşik sınırları ayarlamak için adımdır. Eşik üst sınırı için maksimum ayarlanır. FIJI dışlanan mavi, mavi bir arka plan ve açıkça görülebilir germarium (orta panelleri) görüntüyle sonuçlanan renkli piksel. Not, bu adım isteğe bağlıdır. Görüntü sinyali (orta panelleri kırmızı kareler), tedbir ortalama Floresans yoğunluğu yatırım Getirisi olmadan bir parçası bir yatırım Getirisini çekmek ve bir arka planda kaynaklanan görüntünün tamamının bu tutarını çıkarmak için görüntü (sağ panelleri) düşülen ikinci adımıdır. Üçüncü adım pHluorin kanal görüntüde mCherry kanal görüntüde tarafından bölmek için fotoğraf hesaplama işlevini kullanmaktır. Sonuç Greys arama tablosu ile görüntülenen bir resim olacak ve görüntünün bit derinliğini tarafından sağlanan tüm dinamik aralığı span için görüntü görüntü değerlerini ayarlayın. Son adım daha uygun bir dizi görüntü görüntü ayarlarını ve bir arama tablosu seçin olduğunu. (B) en az bir görüntü hesaplamanın sonucu gösterilen örnek resimleri görüntüleme değeri 0 ve dört farklı arama tabloları kullanarak 2.5 için ekran değere ayarlayın. Her görüntünün yanında dikdörtgen dinamik aralığında her arama tablosu için kullanılan renkleri gösterir. HiLo, 16 renk ve termal için farklı renk için piksel bir yoğunluk değeri 0 veya en fazla (örneğin, mavi ve kırmızı, sırasıyla, HiLo) ile kullanılır dikkat edin. Bu dinamik Aralık, sinyal dinamik aralığı içinde olduğunu görmek için Görüntüleyicisi sınırlarını kolay bir görsel referans sağlar. (C) ekran görüntüsü bir dosyayı ImageJ alırken belirtilen seçeneklere gösterilen biyo-formatları içe aktarma eklentisi kullanarak. ölçek çubukları temsil 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Burada, biz FSC Silsilesi içinde wildtype doku hücrelerinin pHi ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı geliştirilmiştir ve ilk pHi Drosophila yumurtalık dokusu içinde çalışmaya başlamasından bu yana son beş yılda rafine. Bu süre içinde protokol başarıyla birden fazla müfettişler laboratuarımızın içinde ve en az dört farklı iplik disk ve mikroskoplar tarama lazer tarafından kullanılmıştır. PHi artar FSC lineage hücrelerinde folikül hücre durumuna pFC için kök hücreden ayırt gibi birden çok bu davalar gösterir ki her ikisi de bizim orijinal gözlem tekrarlanabilirlik bu biyolojik olay sağlamdır ve bu metodoloji güvenilirdir. Ancak, deneyim, bu zorlu bir yordam Master olduğunu. Detay her adımda ve montaj ve adımları görüntüleme diseksiyon, hızlı, son derece yetkin yürütülmesini yakın ilgi gerektirir. İletişim kuralında belirtildiği gibi diseksiyon ve montaj yordam bir 10 min kuluçka içerir ancak 15dk toplam aşmaması gerekir ve görüntüleme yordamı 45 dakika içinde tamamlanması gerekir. İdeal koşullarda Drosophila ovarioles kültür için 14 s¹⁷kadar saklanır ama bulduk doku nigericin arabellekleri standart eğriler oluşturmak için kullanılan çok daha hızlı ölmeye başlar. Kurallarımıza doku yine de sağlıklı ve morfolojik normal görünür zaman penceresi içinde iken toplanan tüm verileri sağlamak. Her şey için ileri bir adım ilerlemeye hazır olduğundan emin olmak önceden planlamak önemlidir bu kadar zaman her adımı için olsa da, bırakmaz. Aslında, bu iki kişi birlikte yayı ayrılması, montaj, çalışıyorsanız ve yordamlar, bir kişi kişi ise bir adım yürütme ile görüntüleme için bir sonraki adım hazırlar çok daha etkilidir.

PHi doku ex vivo, kompozisyon, sıcaklık ve tampon gibi görüntü için gereken deneysel manipülasyonlar duyarlı olabilir beri pHi göreli değişiklikleri tanımlamak en iyi yöntemdir. Sonda iki farklı floresan proteinler oluşur göz önüne alındığında, Floresans özellikleri kuantum verimi gibi ömür boyu ve katlanabilir özellikleri farklı farklı hücre tiplerinde etkilenip etkilenmedikleri sınanmamıştır. Bu nedenle, nigericin tampon koşulları ile tedavi örnekleri dahil etmek ve her hücre türü için yeni bir kalibrasyon eğrisi her deneme oluşturmak için onları kullanmak esastır. Ek kaynaklar değişkenliği için en aza indirmek için tüm koşulları görüntüleme boyunca tutarlı tutmak olduğunu vurguladı. Örnekleri nigericin arabellek koşullarda hazırlanan ve bikarbonat arabellek durumuna ve tüm örneklerini hazırlık ve görüntü edinimi olarak tutarlı tutulmalıdır gibi aynı gün görüntüsü. Çünkü pHi ölçümleri görüntü setleri, mCherry tespiti etkiler çok deneysel farklılıklar arasında bir karşılaştırma temel alır ve bir veya daha fazla görüntü kümeleri içinde pHluorin pHi tahminleri doğruluğunu azaltabilir önemlidir. (Confocal tarama bir lazer kullanıyorsanız) photomultiplier tüp veya pozlama süreleri (confocal bir iplik disk kullanıyorsanız) veya kamera ulaşan ışık miktarını azaltır kirli bir lens gerilim ayarlarında değişiklikler gibi etkenler açıkça sonuçları etkiler . Ama üzerinden günlük olarak değişebilir ve da sonuçları etkiler daha ince diğer faktörler sayısız if gibi sinekler sinekler, ve ne kadar lazerler görüntüleme önce beri yaş iyi beslenmiş. Hazırlama ve aynı gün tüm üç koşul Imaging bu farklılıkların en aza indirir ve böylece en tutarlı sonuçlar üretecektir. Özellikle, her zaman biz yeni mikroskop için açık ya da mikroskop bileşenlerinin yükseltildi, yeni ekipman ayarları reoptimize gerekiyordu. Bu kez bireysel ölçümlerin ortalama değerleri bir değişikliğe yol açmıştır ama yeni kalibrasyon eğrileri ile her deneme oluşturulan sürece, donanımındaki değişiklikleri pHi tahminleri üzerinde en az etki vardı. Ayrıca, ilgili karşılaştırma kez aynı doku (örneğin, FSCs, PFC ve folikül hücreleri) içinde bulunur ve dahili olarak olan farklı hücre tipleri arasında deneysel varyasyonları için kontrol edilir.

Her ne kadar bu iletişim kuralı pHi wildtype doku ölçme üzerinde odaklanmıştır, metodoloji RNAi veya bir transgene UAS/Gal4 ve mozaik çözümlemesi kullanarak ifade gibi gen ifade değiştirmek için standart Drosophila yöntemleri ile uyumludur. MCherry::pHluorin UAS düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir beri her zaman RNAi veya transgene ile birlikte ifade olacak ve MARCM¹⁸ homozigoz mutant klonlar klonal marker olarak mCherry::pHluorin ile oluşturmak için kullanılabilir. Yukarıda açıklanan nedenlerle, wildtype doku bir mutant genotip ile her deneme yanında kontrol olarak analiz edilmelidir. Son olarak, burada açıklanan genel ilkeleri de diğer dokularda pHi ölçmek için mCherry::pHluorin kullanımı için uygulanabilir. Gerçekten de, bu iletişim kuralını kullanarak mCherry::pHluorin pHi Drosophila göz⁷ölçmek için bir iletişim kuralı üzerinden uyarlanmıştır ve larva beyinde mCherry::pHluorin görüntüye benzer metodoloji kullandık. Genel olarak, araç ve yöntem tanımlamak burada pHi vivo içinde yaşayan, sağlam doku içinde çok çeşitli fonksiyonları araştırmak için yeni fırsatlar sağlar.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bryne Ulmschneider Protokolü ve Diane Barber telkin üstünde el yazması için katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser sağlık grant GM116384 T.G. Nystul ve D.L. Kuaför için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.