Çevresel İpuçlarının Eklem Davranışı Üzerine Etkisini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Drosophila melanogaster meyve sinekinde çiftleşme davranışını etkileyen çevresel ve genetik ipuçlarını analiz etmeye yönelik bir analiz yapacağız.

Bir kişinin cinsel gücü, genotip, deneyim ve çevresel koşullardan etkilenir. Bu faktörlerin cinsel davranışları modüle etmek için nasıl etkileşim kurdukları çok iyi anlaşılmamıştır. Drosophila melanogasterında , besin mevcudiyeti gibi çevresel ipuçları, cinsel davranışları modüle eden mekanizmaları araştırmak için uyumlu bir sistem sunan çiftleşme aktivitesini etkiler. D. melanogaster'da çevresel ipuçları genellikle kemoterapi tatlısı ve koku sistemleriyle algılanır. Burada, çevresel kimyasal ipuçlarının çiftleşme davranışı üzerindeki etkisini test etmek için bir yöntem sunuyoruz. Tahlil, besin ortamı ve çift çift içeren küçük bir çiftleşme arenasından oluşur. Çiftler için çiftleşme frekansı 24 saat süreyle sürekli olarak izlenir. Burada, bu tahlilin çevresel bileşenleri basınçlı bir hava sistemi vasıtasıyla harici bir kaynaktan denemek için uygulanabilirliğini ve çevresel bileşenlerin doğrudan çiftleşme arenasında manipüle edilmesini sunuyoruz. SenBasınçlı bir hava sisteminin bileşimi, çok uçucu bileşiklerin etkisini test etmek için özellikle faydalıdır, oysa doğrudan eşleşme arenasındaki bileşenlerin manipüle edilmesi, bir bileşiğin varlığını saptamak için değerli olabilir. Bu tahlil, diğer erkek ve dişi üreme davranışlarının yanı sıra, çiftleşme davranışına ve doğurganlığa genetik ve çevresel ipuçlarının etkisi hakkında sorulara cevap verecek şekilde uyarlanabilir.

Üreme davranışları, özellikle erkeklerinkinden daha büyük gametler üreten ve gelişmekte olan yavrularını yükseltmek için koşulları özenle seçmek zorunda kalan dişiler için, genellikle yüksek enerji maliyetlerine sahiptir. Enerji maliyeti nedeniyle, üremenin beslenme koşullarıyla bağlantılı olması şaşırtıcı değildir. Yetişkin beslenme nedeniyle ergenliği ertelenebilen memeliler de dahil olmak üzere hayvanlara rağmen hepsi olmasa da çoğu geçerlidir ve cinsel yönelimleri gıda kısıtlamasından olumsuz yönde etkilenebilir ¹ .

Genetik model organizmanın çoğalması Drosophila melanogaster de beslenme koşullarından etkilenir. Gıda uçucuların ² varlığında yüksek düzeyde Erkekler kortu ve dişiler daha cinsel maya, yumurta üretimi ve yavru hayatta kalma ^{3, 4, 5} için önemli bir besin varlığında kabul vardır. BuEvrimsel olarak korunan gıda üreme tepkisi, çevresel gıda bulunabilirliğini cinsel üremeye bağlayan mekanizmaları genetik bakımdan ve zamandan tasarruf sağlayan bir organizmada inceleme fırsatı sunar. Gerçekten de, D. melanogaster'taki çalışma insülin yolağını gıda ile çiftleşme ilişkisi arasındaki bağlantının önemli bir regülatörü olarak ortaya koymuştur ⁶ . Aynı zamanda, çiftleşme hareketi, kadınların gıda tercihlerini ve ayrıca ilişkili kemorensör nöronları ^{7 , 8 , 9'u değiştirdiğini göstermiştir} .

Yemek ipuçlarının D. melanogasterin üreme davranışlarını etkilediği açıktır. Bu etkiler ağırlıklı olarak kadınları, özellikle de ^5'i çiftleşmiş olanları etkilemektedir. Bununla birlikte, çevresel koşulların bu akut etkilerini test etmek için, kadın çiftleşme davranışına klasik olarak kullanılan tahlilEşleşen bölümler arasındaki uzun kesintiler nedeniyle çok uygun olmazlar. Klasik iyileştirme tahlilinde bakire bir kadın ilk önce bir erkekle çiftleşir ve hemen izole edilir ve 24 ila 48 saat sonra yeni bir erkekle birlikte sunulur. Bu klasik tahlil, erkek ejakülatının bayan davranışını ve bayan tepkisini değiştiren bileşenleri tanımlamak için büyük başarı elde etti ^{12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} . Bu nedenle, burada gösterilen sürekli çiftleşme deneyi, üreme davranışları üzerindeki çevresel koşulların akut etkisini incelemek için kullanılabilen klasik çiftleşme deneylerine ektir.

Burada açıklanan çiftleşme davranışı için sürekli tahlil kullanarak, daha önce mayaya maruz kalan bir çift sinekin s24 saatlik bir gözlem süresi ^{5, 19, 20, 21} üzerinde everal kez, sinekler sadece olacak Remate kez yemek ⁵ maruz değil ise. Bu bulgu, D. melanogaster literatürünün büyük bir bölümünün ışığında şaşkın olabilir ki, dişilerin ilk çiftleşmeden birkaç gün sonra telafi edilmediğini gösterir (referanslar ^{10 , 11'de gözden geçirilmiştir} ). Bununla birlikte, bu tutarsızlık, yeni bir çiftleşme fırsatı sağlanmadan önce bir ila birkaç gün arasında bir kadının izole edildiği tahlil koşulları ile kolaylıkla açıklanabilir. Eğer bu saatlik gözlem döneminde çift eşleşmezse, kadın kabul edilemez olarak nitelendirilir. Dahası, yüksek çiftleşme sıklığı, yabani yakalanan sineklerin verdikleri verilerin, depolama organlarında 4-6 erkek arasında sperm bulunduğuna göre şaşırtıcı olmamalıdır; Böylece içindeBu dişilerin doğal olarak birkaç kez telafi edildiğini söyleyerek ^{22 , 23} .

Burada, çiftleşmenin frekansını modüle etmek için sineklerin çevresel koşullar hakkında nasıl bilgi toplayıp bir araya getirdiklerini ortaya çıkarmak için bu sürekli çiftleşme denemesinin kullanımını kanıtlıyoruz. Bu test, genetik çalışmalar için nispeten çok çift çiftin test edilmesini ve uçucu ve uçucu olmayan çevresel ipuçlarının etkisini sınamanızı sağlar. Deney, tipik olarak 24 saat sürer ancak açık-koyu (LD) döngü gibi bisiklet ortamı ipuçlarının test edilmesine olanak tanıyan 48 saate kadar uzatılabilir. Bu tahlil, bir gıda sanayiinde uçucu olmayan maya besin maddesinin mevcudiyeti ile birlikte bir basınçlı hava sistemi içindeki bir maya kültürünün uçucu ipuçlarının etkisini test ederek göstermektedir.

Basınçlı hava sistemi sürekli olarak uçucu ipuçlarını birbirine giren bir arenaya pompalarBir gıda substratı ve bir test çifti (çiftleşme davranışı izlenir). Mayaların etkileşime giren özelliklerini daha ayrıntılı olarak belirlemek için, gıda substratındaki mayaya tekabül eden bir amino asit içeriği ile bir arada, önemli bir uçucu maya bileşikini, yani asetik asit ^24'ü , pepton (amino Hayvansal proteinlerin enzimatik sindiriminden elde edilen asitler). Bu deneyler birlikte, D. melanogaster'ın çiftleşme davranışı üzerindeki çevresel ipuçlarının etkisinin bu tahlil ile nasıl test edilebileceğini gösterir.

1. Çevresel Kontrollü Eşleştirme Kutusu

1. Kontrollü ve kolay temizlenebilen bir test alanı sağlamak için, Şekil 1A'da gösterildiği gibi 120 cm x 64 cm x 85 cm paslanmaz çelik mutfak dolabını kurun.
   1. Tavanın hemen altındaki dolabın arkasına bir delik açın ve her biri 2 cm çapında dört yuva dört delik açın. Kutunun altından 7 cm, delikler arasında 12.5 cm yükseklikte kutunun her iki tarafındaki dört delikten oluşan ilk iki kümeyi delin. Kutunun her iki yanındaki diğer iki seti tabandan 35 cm yükseklikte delin.
      NOT: Dört delik dört set kamera güç kabloları ve hava pompası boruları kabin içine girip çıkmak için kullanılır. Arkadaki delik, bir ışık kartının güç kabloları için kullanılır.
   2. Her bir ışık arasında 2.5 cm'lik boşluk bırakarak, 40 sıra beyaz ve kırmızı ışık yayan diyot (LED) 18 sıra ile bir ışık tahtası oluşturun. Beyaz ve kırmızı LED'lerin bir sirkülasyona monte edinT güç kaynağı ile. Her bir LED'i 560 Ω, 0.25W ve% 5 toleransa sahip bir dirençle seri bağlayın.
      NOT: Kırmızı ışığın emisyon dalga boyları 590-661 nm arasında değişir ve 627 nm'de keskin bir zirve bulunur. Deney alanında elde edilen ışık yoğunluğu, yalnızca kırmızı ışıklar açıkken her iki ışık da açık ve 90 lüks olduğunda yaklaşık 900 lux'tir; Bu akıllı telefon ışık ölçer uygulaması kullanılarak ölçülmüştür.
   3. Işık kartonunu paslanmaz çelik kabinin üstüne takın ve güç kablolarını arkadaki delikten geçirin.
   4. Deneyin karanlık fazı sırasında beyaz LED'in kapatılmasına izin vermek için, beyaz LED'lerin adaptörünü bir güç kontrol zamanlayıcıya bağlayın. Kör olan ^{25 adet} kırmızı ışığın adaptörünü deneyin tamamı boyunca tutmak için normal bir gç kaynağına bağlayın.
   5. Kutunun iç taraflarına 50 cm yükseklikte 110 cm ve iki adet 54 cm uzunluğunda metal parantez yerleştirinCm'dir. Bu dirseklerin üzerine buzlu cam difüzyon plakası (119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm ölçülerinde) yerleştirin.
   6. Işık yaymak ve eşleşme alanlarının yüzeyindeki parlamayı sınırlandırmak için ışık tahtası ile cam plaka arasına üç kat filtre kağıdı (120 cm x 50 cm) ekleyin (bölüm 4'te açıklanmıştır). 120 cm uzunluğundaki ahşap çubukların üzerindeki iki kenar filtre kağıdını mıknatısları (yan tarafta) kullanarak metal dolabın iç kısımlarına yapıştırın. Bu işlemi 3 kez yapın.
   7. Eşleşme kutusunu sürekli olarak havalandıran bir hava akışı oluşturmak için kutunun kenarlarına dört fan ekleyin. Işık panosu tarafından üretilen ısınmayı en aza indirgemek için, ışık tahtası ile cam plaka arasına, 8 cm'lik fanın ilk setini hava girişini sola, egzozu kutunun sağ tarafına takın.
   8. 12 cm'lik fanın ikinci setini, kabinin altından 25 cm yukarıda tutturarak dışarıya hava akışı yaratarak iKabinenin kenarında ve 26 ° C'ye kadar kararlı bir şekilde soğutuyor. Egzoz tarafındaki fanları emme hortumuna takın ve kabin içindeki havanın tekrar dönmesini önlemek için hava akışını odanın dışına çıkarın.
2. Standın tabanından 30 cm ve birinde 28 cm olmak üzere iki kelepçe ile monte edilmiş iki raf (yaklaşık 48 cm uzunluğunda) ayarlayın. Kelepçelerin her birine bir web kamerası takın. 4 kamerayı izleme yazılımını çalıştıran bir bilgisayara bağlayın.
3. Her web kamerasının altına A4 yaprak yerleştirin. Çiftleşme arenalarını barındıracak şekilde, 4 numaralı eksenlerle 7'den 5'e kadar karelerle önceden numaralandırılmış beyaz levhalar veya sayfalar kullanın (bölüm 4'te açıklanmıştır).
   NOT: 78 ° geniş açı görünümü ve 5 milyon piksel çözünürlüğe sahip bir HD web kamerası kamera, bir A4 sayfaya karşılık gelen 21 cm x 30 cm'lik bir alanı ve 20 ile 35 aralıklı arenayı izleyebilen bir alanı kaplayabilir.

2. Arıcılık ve Toplama Fly

1. Yerdeki 20 erkek ve 20 dişi vahşi tip Canton-SÜç ila dört gün boyunca 45 mL zengin uçucu gıda maddesi içeren sinek yetiştirme şişelerine uçar (bkz. Bölüm 3). Aynı yetişkinleri önce üç kez dokunarak ve ardından yeni şişelere üç kez aktarın.
   1. Şişeleri, 25 ° C'de ve 12 saatlik bir kuluçka makinesine yerleştirin: 12 saat aydınlık karanlık döngüsü, saat 09: 00'da ışıklar açıktır (Zeitgeber süresi (ZT) 0). Yaklaşık 10 gün sonra yeni bir nesil ortaya çıkacak.
2. Ortaya çıkan yeni kaplanmış sinekleri karbon dioksit pedleri üzerinde en fazla 5 dakika boyunca anestezi edin ve bir fırça kullanarak sinekli gıda şişelerine toplayın.
   1. Yabani tip Canton-S stok şişelerinden bakire (yeni kaplanmış) dişiler ve bakire erkekler 6.5 mL'lik zengin sineklik besin ortamı ile 2.5 cm x 9.5 cm'lik sineği yetiştirme şişelerine toplayın.
3. Aynı seks gruplarındaki sinekler 20 sinekte sinekler, her biri 25 ° C ve 12 saatte 5-8 gün süreyle flakon tüpleri hazırlanırlar: 12 saat ışık-karanlık döngüsü ve saat 09: 00'da ışıklar (ZT 0).
4. NakliDeneyden bir önceki gün taze sinek kuşu yetiştirme şişelerine uçar.

3. Gıda Ortamı Hazırlama

1. Aşağıdaki gibi 1 L zengin sineği hazırlayın.
   1. 1 L'lik musluk suyu 2 L'lik cam bir behere manyetik bir karıştırma çubuğu ile boşaltıp, beheri manyetik bir sıcak plaka üzerine koyun. Çalkalamaya devam edin ve kaynama sıcaklığına ulaşana kadar ısıtmayı 300 ° C'ye getirin.
      NOT: Aşağıdaki aşamalardaki uzun kaynama süresi boyunca suyun bir kısmı buharlaşacaktır ancak eklenen bileşenlerle birlikte bu protokol yaklaşık 22 ° C'lik oda sıcaklığında hazırlandığında 1 L zengin sineğe dönüşür.
   2. 10 g agar, 30 g glikoz, 15 g sükroz, 15 g mısır unu, 10 g buğday tohumu, 10 g soya unu, 30 g (1 litre) soya unu, 30 g Pekmez, 35 g aktif kuru maya. Mayanın kuvvetli bir şekilde köpürmesini bekleyin, daha sonra sıcak plaka sıcaklığını aşağı doğru çevirin120 ° C'ye kadar eritilir.
   3. 10 dakika sonra sıcak tablayı 30 ° C'ye çevirin ve karışım 48 ° C'ye soğutulana kadar karıştırın. Yiyeceğe doğrudan bir termometre takarak sıcaklığı izleyin.
   4. 2 g p-hidroksi-benzoik asit metil esteri (tegosept,% 100) 10 mL% 96 etanol içine çözün. Buna karışıma 5 mL 1 M propiyonik asit ilave edilir. 3 dakika karıştırın.
   5. Arenanın altına 0,3 cm kalınlığında bir tabaka oluşturmak için sinek besin maddesini arenalara boşaltın (bölüm 4'te açıklanmıştır).
      1. Dökmek için 200 mL cam beher kullanın. Tam miktarlar önemliyse, 10 mL serolojik pipet kullanın.
2. Uçan orta eksi mayayı, adım 3.1.1 ile 3.1.5'e kadar tam olarak tarif edildiği gibi hazırlayın, ancak mayayı adım 3.1.2'de bırakın.
3. Ortamı, 1 litre kaynar suda 10 g agar ve 35 g peptonu karıştırarak peptonlı veya peptonsuz agar ile hazırlayın ve 3.1.4 ila 3.1.5 arasındaki adımları uygulayın.

4. MatinArena Arena Hazırlığı

1. Isıtılmış bir hazırlama iğnesi (bir Bunsen brülöründe kızarıklık için ısıtılan) kullanarak 3.5 cm x 1.0 cm plastik Petri kabının üst tarafında yaklaşık 0,3 cm çapında bir delik açın. Alternatif olarak, lehimleme ütüleri kullanın.
2. Kokulu bileşiklerle besin ortamı hazırlarken, deneysel tabakların yarısı için istenilen bileşiği 30 μL (son gıda maddesinin% 1'i, örn., Acetic Acid glacial% 100) pipetle çerez haline getirin. Karşılaştırmak için bulaşıkların diğer yarısını boş bırakın.
   NOT: Burada açıklanan kurulum ile bir defada maksimum 140 arena test edilebilir.
3. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, istenen bileşiğin üzerine tabağın altına 3 mL gıda maddesi dökün. Kirlenmeyi önlemek için peynir bezi ile örtün ve ortamı oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat boyunca katılaşmaya bırakın.
4. Bulaşıkların üzerine bir kap yerleştirin ve her iki tarafı da kapatın. Delikleri örtmek için küçük parafin film fişleri hazırlayın.Yemekleri 0,2 cm'lik rulolar halinde parafin filmi yuvarlayarak ve daha sonra bunları 0,5 cm'lik kesimler halinde keserek hazırlayın.

5. Koku Maya Kültürü

1. 14.0 cm x 2.06 cm'lik bir Petri kabı içinde maya özü peptone dekstrozu (YPD) agarında kuru aktif maya yetiştirin. Bu adımda kontaminasyonu önlemek için eldiven kullanın.
   1. 10 g maya ekstraktı, 20 g pepton, 22 g glikoz (0 (+) - glikoz monohidrat) ve 15 g ağar (saf) kaynar ultra saf su 1 L ekleyerek YPD agar plakaları hazırlayın. Her şey çözüldükten sonra Petri kabının altını tabaka haline getirin ve buzdolabında 4 ° C'de baş aşağı yerleştirerek 2 aya kadar saklayın.
   2. Kurutulmuş maya birkaç tanesini bir YPD orta tabakına serpiştirin, çözünmesine izin verin. Daha sonra steril bir halka kullanarak orta tabakayı çizin. Plakayı gece boyunca 30 ° C inkübatörde saklayın. Daha sonra, kültürü buzdolabında en fazla 1 hafta saklayın.
2. YPD sıvı ortam hazırlayın i10 g maya ekstraktı, 20 g pepton, 22 g glikoz (0 (+) - glikoz monohidrat) ve 1 L ultra saf suya bir karıştırma çubuğu ekleyerek 1 L'lik şişelere ilave edin.
   1. 120 ° C'de ve 1 bar basınçta 25 dakika süreyle otoklavlanır. Ardından, şişeleri 4 ° C'de kullanana kadar 2 aya kadar saklayın.
3. Açık şişe kapaklarını (4,5 cm) 0.32 cm kalınlığında silikon septum ile takın.
   1. Dikenli perde bağlantılarına rahatlıkla oturmak için septumdaki iki küçük deliği kesin. Şişeden çıkan iki çıkışa ve şişeye giren girişlerden yalnızca birine küçük polivinil Klorid (PVC) boruları (çaplar: dış 0,8 cm ve iç 0,5 cm) takın. Resim için bkz. Şekil 1B.
   2. Takılan kapakları ve tüpü alüminyum folyo ve otoklav içinde 120 ° C ve 1 bar basınçta 25 dakika boyunca sarın.
4. Bu adımda kontaminasyona karşı koruma sağlamak için eldiven kullanın. YPD agar plakasından maya kolonilerinden birine steril bir 100 uL pipet ucu koyun (d5.1'de anlatıldığı gibi) ve otoklavlanmış YPD sıvı ortam şişesine bırakın.
   1. Bu maya ile aşılanmış YPD sıvı ortam şişesinin yanı sıra iç ve çıkış ile monte edilmiş otoklava kapaklı (adım 5.3'te açıklanan) bir YPD orta kontrol şişesine (maya eklenmemiştir) ekleyin. Her iki şişeyi ayrı manyetik plakalara koyun ve maya kültürünün büyümesine izin vermek için deney başlamadan önce 24 saat oda sıcaklığında 100 devir / dakika karıştırın.
   2. Maya kültürüne hava sağlamak için iki şişe girişini akvaryum pompalarına bağlayın. Deneysel etkiyi önlemek için deneysel maya şişesinin çıkışını deney odasından maya kokusunu havalandıran bir tüpe bağladığınızdan emin olun.

6. Hava Pompası Kurulumu

1. Büyük PVC hortumunu (çapları: dış 1.2 cm ve içteki 0.9 cm) basınçlı bir hava kaynağına tutturun ve 800 mL'ye kadar aktif kömür ile doldurulmuş iki 1 L'lik cam Erlenmeyer şişeleri boyunca götürünHattını arındırmak için. Laboratuarda yaygın olarak verilen basınçlı havayı hava kaynağı olarak kullanın veya tüpleri bir hava pompasına bağlayın (burada basınçlı hava kullanıldı).
   NOT: Boru malzemesi uçucu maddenin kimyasal özelliklerine göre seçilmeli ve uçucu maddenin boru hattına yapışmasını önlemek için test edilmelidir (örn. Politetrafloroetilen, naylon veya paslanmaz çelik).
2. 15 mL'lik tüplerden üç tane 1.000 mcL'lik pipet uçlarından iki tane hava ayırıcı yapın.
   1. ~ 1 cm çapında üç delik açın. İlk önce, 15 mL'lik tüpün hemen altında birbirine bitişik ısıtılmış bir hazırlama iğnesi (bir Bunsen fırınında ısıtılmış kırmızı) kullanarak iki delik açın. Ardından tüpün altını çıkararak üçüncü deliği yapın.
   2. Dışa doğru işaret eden dar uçlu deliklere 1.000 μL'lik pipet ipucu yapıştırın. Daha fazla hava akışı sağlamak için pipet uçlarının ucunu kesin.
3. Büyük PVC boruları c çıkışından bağlayınHarcoal dolu Erlenmeyer şişesi, 15 mL'lik tüpün altındaki pipet ucuna. İki yatay pipet ucuna küçük PVC boru çıkışları ekleyin ve onları bir kontrol ve deney şişesine doğru yönlendirin.
4. YPD maddesinin mikroorganizmalarla kirlenmesini önlemek için, küçük boruyu, filtreye doğru giden bir plastik itme ve filtreyi terk eden bir plastik yuva konektörü ile birlikte steril bir şırınga filtresine (0.45 μm gözenek boyutu) takın. Ardından, hortumu YPD kültür şişesinin girişine tutturun (bakınız Şekil 1B ).
5. Havadaki mayanın kültür şişesinden deney alanına girmesini önlemek için, küçük boruları kullanarak her YPD kültür şişesinin çıkışına bir cam tüp (6.5 cm uzunluğunda, dış çap = 0.5 cm ve iç çap = 0.3 cm) takın. PVC boruyu cam tüpün diğer tarafına takın ve bunu deney kutusunun alt deliklerine (her iki taraftan delinmiş) yönlendirin.
   1. Tüpü cam elyaf ile doldurun ve kullanmadan önce otoklavlayın.
6. Deney kutusunun her iki tarafındaki küçük PVC boru tesisatına (deney bölümünde kutunun içine doğru iki fan borusu akışı elde etmek için 15 mL'lik bir boru bölücüsü (bkz. Bölüm 6.2) Ve kontrol tarafı (sol fan havası akışının girişine en yakın).
7. Aynı anda 80 eşleşmiş çiftin, yani her hava durumu için 40 tanesinin test edilmesi için her biri 10 çıkışlı 8x25 mL serolojik pipet hazırlayın.
   1. Pipet içine ~ 0,8 cm çapında, 10 cm 2 cm aralıklarla 10 delik açın.
   2. 1 mL şırınganın dış kısmını bir küçük (2.5 cm) ve bir büyük (5 cm) çıkışa kesin.
   3. Bu çıkışları sıcak tutkalla deliklere yapıştırın.
   4. Çıkışların etrafında küçük bir plastik parafin film bandı sarın ve 1000 mcL pipet ucu ekleyin. Uç açıklığının çapı 0,1 cm'dir. Her deney için temiz ipuçları kullanın.
8. Dış çapı ≥0.5 cm olan T bölücü ve küçük PVC tüplerinden kısa parçalar kullanarak iki serolojik pipeti her iki yandaki her iki çıkışa takın. Pipetler beyaz kağıt yaprağına düz olarak sarın (çelik kutunun içindeki kameraların altında).
9. Bir hava akışı monitörü kullanarak hava akışını, 1000 mcL pipet ucu çıkışındaki hava hızı 0,5 m / s olacak şekilde ayarlayın. Bu, uç başına 0,0017 L / s'lik bir hava akışına karşılık gelir.

7. Eşleşme Davranışının İzlenmesi

1. Deneysel bir dişi, saat 15:00 (ZT 6) 'da küçük bir Petri kabına yerleştirmek için bir ağızlık pipeti kullanın (referans ^26'da açıklandığı gibi) ve birleşim alanına alışmak için 1 saat süre verin.
2. Deney kutusunu (bölüm 1'de açıklanmıştır) aşağıdaki gibi ayarlayın:
   1. Işıkları açın, yani 12 saatte beyaz ışık LED'leri: 12 saat açık-karanlık döngü, saati açan bir zamanlayıcıya bağlanır.09: 00'da (ZT0) ışık ve sürekli karanlık ışık LED'leri deneyin karanlık fazı sırasında sineklerin izlenebilmesini sağlar. Kabinin ışık kaynağına göre ısıtılmasını sınırlamak ve fazla kokuların test alanının dışına havalandırılmasını sağlamak için fanları açın.
   2. Web kameralarını bir bilgisayara bağlayın ve bunları görüntü izleme için izleme yazılımıyla başlatın.
   3. Her kamera için izleme yazılımında odağı, parlaklığı ve yakınlaştırmayı ayarlayın.
      1. Kamera ekranını sağ tıklatın, "kamera özellikleri" ni açın ve "otomatik odaklanmayı" kaldırın. Izgarayı veya kağıt sayfasındaki herhangi bir yazılı kelimeyi netleştirmek için "odak" ı ayarlayın. Gerekirse "parlaklık" ve "yakınlaştır" ı değiştirin.
   4. İzleme yazılımının programını her 2 dakikada bir 1 fotoğraf çekilecek şekilde ayarlayın. Her kamera ekranını sağ tıklayın ve "kamera düzenle" yi ve ardından "İşlemler" seçeneğini seçin. Eylemleri başlatmak için tıklayın "Normal int olarakErvals "i seçin ve süreyi" 2 dakika "olarak değiştirin. Gerçekleştirmek istediğiniz işlemler için" Fotoğraf Al "ı seçin ve sonunda" tamam "ı tıklayın.
   5. Her kamera ekranını sağ tıklayın ve "izleme işlemini başlat" ı seçin.
3. 1 saat sonra (ZT 7'de) ağız pipetini kullanarak Petri kabına vahşi tip bir erkek aktarın, çanağı web kamerası kameralarının altındaki A4 kağıt sayfalarına yerleştirin ve 24 saat boyunca "başlatmaya başlama" yı tıklayın. Hava pompası deneyi için, çanağı, çiftleşme alanının giriş deliğine bir pipet çıkışı bağlanacak şekilde yerleştirin.
4. Çiftin çiftleşme davranışını analiz etmek için aşağıdakileri yapın.
   1. Bir resim görüntüleme yazılımındaki tüm resimleri seçin ve açın ve bunlarla kronolojik sırayla sayfa alın.
   2. Aynı satırın içindeki bir elektronik tabloya tarih, deneme numarasını, çanak numarasını ve başlangıç ​​saatini yazın. Web arşivinin altına yerleştirildiği andan itibaren her arena'nın başlangıç ​​zamanını seçinM kamera. Resimlerden zaman damgasını kaydedin.
   3. Aynı satırdaki her bir kopingasyonun başlangıç ​​zamanını e-tabloda işaretleyin. Erkek çift dişi monte ettiğinde ve çift en azından beş ardışık karede (10 dakika) durgun durur ve aynı duruşta bir olay olarak bir çift olarak sayılır.
      NOT: Bu kriter, 12 D. melanogaster 27 dakika arasında değişen birleşme bildirilen uzunluğu, ve üzerinde, 10 dakika ve çiftleştirerek ^{27, 28} verimli olan gözlemine dayanır.
   4. Eşleşme sıklığını belirlemek için e-tablodaki her bir satır için kopyalanma sayısını sayın. Alternatif olarak, çiftleşmenin gecikmesinin bir ölçümü olarak her satıra ilk çiftleşmeden sonraki denemenin başlama zamanını çıkartın veya çiftleşmenin gecikmesinin ölçümü olarak ilk çiftleşmenin zamanını ikinci çiftleşmeden çıkarın.
      1. Telafi gecikmesini hesaplamak için,Elektronik tablo yazılımında ardışık gün olarak birinci ve ikinci çiftleşmenin tarihlerini tanımlayın.
   5. Bağımsız değişkenlerin-gıda ortamının istatistiksel önemini belirlemek için istatistiksel bir yazılım kullanarak (materyal tablosuna bakınız) rasgele bir faktör olarak deneyin tarihini içeren ve verilerin normal dağılımını varsayarak karışık efekt modelleri ile verileri analiz edin, Hava tipi ve etkileşim-daha önce tarif edildiği gibi ⁵ .
   6. Olası bağımsız değişkenlerin log-likelihood ratio testlerini ve ilişkili Akaike bilgilerini kullanarak geriye doğru ortadan kaldırarak en iyi açıklama modelini seçin. Modeli çalıştırdıktan sonra normalliği onaylamak için veri kalıntılarını görsel olarak inceleyin. Levens testi ile varyansların homojenliğini teyit edin. Eşit olmayan homojenlik durumunda, karekök, veriyi dönüştürür.

Bu devamlı testi, çiftleşme davranışını ve çiftleşme frekansını spesifik olarak kullanarak, deneysel çevre koşulları altında belirlenebilir. Çevresel koşulları kontrol altında tutmak için, paslanmaz çelik bir mutfak dolabını, kendi ışık kaynağıyla ve difüzyonuyla, yüksek bir bolluk ışığı ve eşleşme arenalarından en az miktarda parıltı sağlayan bir test alanı haline getirdik ( Şekil 1A ) . İç test alanı, hekzan veya etanol gibi organik çözücülerle temizlemeye izin veren paslanmaz çelik ve cam ile tamamen kaplanmıştır. Buna ek olarak, kabin, basınçlı hava sisteminden uçucu ipuçları getiren hortum girişleri gibi işlev gören deliklerle donatılmıştır (bkz. Şekiller 1A ve 1B ). Maya kokuları için ayarlanmış basınçlı hava sistemi, 4 adet pipet bölücü ile test arenalarına girmeden önce sıvı bir maya kültürü aracılığıyla yönlendirilen bir hava akışından oluşurHer biri 10 çıkış ( Şekil 1C ). Bütün sistem hava geçirmezdir ve karıştırıcı kokularla bulaşmayı en aza indirgemek için maya kültürüne girmeden önce ve sonra çeşitli partikül filtreleri ile donatılmıştır ( Şekil 1B ).

Bu tahlilin kullanımını göstermek için, bir maya kültürünün uçucu ipuçlarının çiftleşme davranışını etkileyip etkileyemediğini test ettik. Hava, 24 saat süreyle sıvı bir maya kültürü vasıtasıyla kabarcıklandırıldı ve hava çıkışları, her bir araya giren alanın girişine yerleştirildi (bkz. Şekil 2A ). Çiftleşmiş alanların yarısı mayalı maydanoz (Gıda + maya) içermekteydi ve diğer yarısı maya eklenmeden sinek gıda maddeleri içeriyordu (Gıda mayası). Harici maya kültüründen gelen kokulara vahşi tip bir erkek ve kadın maruz kalmış ve çiftleşme sıklığı kaydedilmiştir. Hangi değişkenlerin grafiksel sonuçları açıklamak için gerekli olduğunu belirlemek için, karışık efekt modelleri kullandık veya dahil ettik.Besin ortamı, maya havası ve ikisinin etkileşimi arasındaki bağımsız değişkenleri araştırmak. Şekil 2B'deki veriler gıda ortamı (p = 0.001) ve maya havası (p = 0.061) bağımsız değişkenlerini içeren bir model ile en iyi gösterilir, ancak etkileşim etkisini açıklayan hiçbir şey yoktur. Bu veri kümesinde maya hava değişkeni belirgin değilse de, sonuçları açıklamak gerekir. Gıda ortamı için ayrılmış maya havasının analizi, yiyecek ortamında hiçbir maya bulunmadığında (hava: p = 0.992), çiftleşmiş bir çiftin maya kokularına cevap vermediğini gösterir; ancak maya havada maya havasındaki çiftleşme frekansını arttırırlar Besin ortamına da eklendi (hava: p = 0.018). Birlikte, bu sonuçlar, gıda maddesi ortam koşullarıyla birlikte çevre kokularının etkisini test etmek için basınçlı hava sisteminin uygulanabilirliğini ortaya koymaktadır.

Ayrıca, basınçlı hava sisteminin byp olabileceğini de gösteririzÇevresel kimyasal ipuçlarını doğrudan test arenasına ekleyerek kanıtladı. Hangi özel maya bileşiklerinin çiftleşme frekansını etkilediğini göstermek için, mayada amino asit içeriğinin çiftleşme üzerindeki etkisi için gerekli olduğu hipotezini test ettik, mayada agardan tedarik edilen amino asitlere tekabül eden pepton (hidrolize proteinler) bir doz yerleştirerek Çiftleşme alanını astarlayan alt tabaka. Ayrıca, mayanın büyük uçucu fermantasyon ürünlerinden biri olan asetik asitin gerekliliğini, çiftleşme sıklığını artırmak için test ettik. Bu asetik asit doğrudan besin ortamına eklenerek yapıldı. Bir vahşi tipli erkek ve dişi, besin ortamında doğrudan asetik asit bulunan veya içermeyen peptonlu agar veya agardan oluşan arenalarda test edildi ( Şekil 3B ). Bu, çok basit bir gıda ortamı ve kötü bir çevre için yapar; Bu nedenle, ortalama çiftleşme frekansı da Şekil 2B'ye kıyasla azalır. Şekil 3B'deki veriler en iyi şekilde,Besin ortamının bağımsız değişkenleri (p = 0.002), asetik asit havası (p = 0.001) ve ikisinin etkileşimi (p = 0.022). Dişi alıcılık, asetik asit varlığının artmasıyla, ancak ortamda pepton bulunduğu durumda artmaktadır. Bu, sineklerin eşleşme sıklığını artırmak için amino asitleri ve asetik asidi aynı anda algılamaları gerektiğini göstermektedir ( Şekil 3B ). Bu, kokuların doğrudan test arenasına eklenmesinin çiftleşme davranışını etkileyebileceğini ve bu etkilerin çok basit çevre koşullarında tespit edilebileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Deney kutusu ve mayalı basınçlı hava sisteminin diyagramı. ( A ) Bölüm 1'de açıklanan çevresel olarak kontrol edilen çiftleşme kutusunun şematik gösterimi. Ekli numaraların ve okların açıklaması: 1. ışık tahtası Ternating beyaz ve kırmızı ışıklar; 2. küçük fan; 3. 3 kat filtre kağıdı, her katman iki filtre kağıdı tabakasından oluşur; 4. kutunun 3 yanına tutturulmuş parantez üzerine dayanan cam difüzyon plakası; 5. büyük fan; 6. Boru ve kablolar için delikler; 7. deney alanı; Geniş ok, cam plakaya 50 cm; Orta ok, kablo delikleri için 35 cm yükseklik; Ve küçük ok, boru delikleri için 7 cm yükseklik. ( B ) 5, 6.4 ve 6.5 bölümlerinde anlatıldığı gibi, hava akımı ile sıvı maya kültürünün şematik gösterimi. Açıklamalı sayıların açıklaması: 1. tek kullanımlık filtre ünitesi; 2. Silikon septum ve dışa ve girişlere sahip kapak; 3. sıvı ortam; Ve 4. cam elyaflı cam tüp. ( C ) Bölüm 6.7'de açıklandığı gibi hava çıkışlarının şematik gösterimi. Açıklamalı sayıların açıklaması: 1. serolojik pipet; 2. 1 mL enjektörden kesilen boru ve 3. 1,000 μL pipet ucu.Target = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Maya kokusu, gıda substratında mayanın bulunduğu ortamda kadınların alıcılığını artırır. ( A ) Şekil 1C'deki hava çıkışından giriş deliğinden giren bir erkek ve bir dişi ve bir pipet ucuyla çiftleşme arenasının şematik gösterimi. ( B ) Sinek gıdasında Mayonez kokusu ve maya kokusu için bir Canton-S eşleşme çiftinin çiftleşme frekansındaki yanıtın grafiksel sunumu (Gıda mayası: orta hava n = 12, maya hava n = 13 ve Gıda + maya : Orta hava n = 24, maya hava n = 23). SEM hata çubuklu çizgi grafiği ve hava ile bağımsız değişken olarak karışık efekt modellerinin istatistiksel çıktıları ve her besin ortamı için bağımsız olarak rasgele değişken olarak tarih. Ana istatistikL modeli gıda (p = 0.001) ve maya havası (p = 0.061) içermektedir. Referansdan uyarlanmıştır ⁵ . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Sinek gıda substratındaki asetik asit, pepton varlığında kadınların reseptivitesini arttırır. ( A ) Asetik asit içeren sinek gıda maddesi ve giriş deliğini kapatan bir plastik parafin film tapası olan çiftleşme alanının şematik gösterimi. ( B ) Agar veya pepton ortamında (agar: -asetik asit n = 52, + asetik asit = 40 ve pepton: -asetik asitte asetik asit karşısında bir Canton-S eşleşme çiftinin çiftleşme frekansının grafik sunumu N = 28, + asetik asit n = 25). SEM hata çubukları ve stati ile çizgi grafiği(P = 0.002), asetik asit havası (p = 0.001) ve gıda * havası (p = 0.022) bağımsız değişkenler olarak rastgele değişken olarak karışık etki modelinin stik outputu. Referansdan uyarlanmıştır ⁵ . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Bu protokol, çiftleşme çiftinin çiftleşme frekansını belirlemek için kullanıldığı varsayılan çevresel ipuçlarını sürekli kontrol ederken, çiftleşme davranışını 24 saat boyunca test eden bir testi açıklamaktadır. Ortam mayayı da içerdiğinde basınçlı bir hava sistemi vasıtasıyla sağlanan maya havasına yanıt olarak çiftleşme frekansını arttırmak mümkündür ( Şekil 2B ). Ek olarak, çiftleşme frekansında benzer bir tepki, ortamda doğrudan agar, pepton ve asetik asit kokusu içeren basitleştirilmiş bir besin ortamı ile gözlemlenebilir ( Şekil 3B )

Burada gösterilen deneylerle, her iki cinste de aynı çevre koşullarına maruz kaldığı için, çiftin genel çiftleşme davranışı üzerine sonuçlar çıkarılabilir. Bununla birlikte, daha önceki araştırmalardan, çiftleşme sıklığındaki varyasyonun% 47'sinin kadın tarafından belirlendiğini biliyoruz; erkeklerin oranı yalnızca varyasyonun% 11'ini oluşturur²⁰ . Dolayısıyla, çiftleşme sıklığında gözlemlenen değişikliklerin büyük bir çoğunluğu kadın cinsel alıcılığının bir sonucudur. Artan erkekler kurları, yetişkin D. melanogaster kadınlarının çiftleşme girişimlerini başarılı bir şekilde saptırabilmesi için dişiyi çiftleşmeyi kabul veya reddetmeye devam ediyor ²⁹ . Kesin sonuçlar için ve çiftleşme cinsiyetine özgü farklılıkları kadın cinsel alıcılığa özel olarak uydurmak için, kadının genotipi değiştiği halde erkeğin genotipi sabit tutulduğunda ek çiftleşme çiftlerinin test edilmesi gereklidir.

Bu protokol, basınçlı hava sistemi ya da doğrudan besin ortamına çiftleşme çiftine kokulu bileşikler vermek için iki yol gösterdi. Basınçlı hava sistemi, hava yoluyla iletilen bileşiklere herhangi bir etkinin atfedileceği avantajına sahiptir; bu, bileşimler doğrudan gıda ortamına konulduğunda sonuçlandırılamaz. Öte yandan, wO basınçlı hava sisteminde bir etki bulunmazsa, otomatik olarak işaretin davranışları etkilemediği anlamına gelmez. Aynı zamanda, bileşiğin basınçlı hava sistemi vasıtasıyla verimli bir şekilde iletilmediği anlamına gelebilir. Hava dağıtım sisteminin çıkışındaki havanın bileşimi, bir hidrokarbon filtresi yerleştirilerek ve sıkışan hava içeriğini, kütle spektrometresi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ile analiz ederek analiz edilebilir. Basınçlı hava sistemi, daha uzun bir aralıkta kolaylıkla havadan yapılabilen bileşikleri test etmek için iyi bir testtir. Daha az uçucu bileşiklerin doğrudan besin ortamına konması gerekebilir. Basınçlı hava sisteminin diğer bir dezavantajı, hava hızının süratli olabileceği etkisidir. Hava hızları çok yüksek olduğunda sinekler hareket etmeyi bırakır (0,7-1,6 m / s'nin üstünde) ³⁰ . Buna ek olarak, basınçlı hava sistemi, yiyecek ortamını kurutarak basit, düşük kaliteli bir ortam dayanılmaz hale getirebilir. Her iki durumda da sinekler işe yaramayabilirOrm da eşit derecede iyi sonuç verir ve test edilen spesifik bileşiklere atıf yapılamaz.

Bu tahlillerin en iyi şekilde çalıştırılması için hazırlık sırasında bazı adımlar gereklidir. Dikkat gerektiren ilk adım, aracın hazırlanmasıdır. Asetik asit gibi kokulu uçucu bileşiklerin de bulunduğu ortamın deneme günü hazırlanıp buharlaşmayı önlemek için değil, hazırlanması önemlidir. Ayrıca, hava akışı kokunun buharlaşmasını tetikleyebileceğinden, ortamın fazladan bir hava akışı olmadan bir yüzey üzerinde sertleşmesi gerekir (buhar kulübeleri kullanmaktan kaçının). Özel bakım gerektiren ikinci adım basınçlı hava sisteminin kurulmasıdır. Hava akışı maya kültürünü arenaya aktarmadan yavaşça kabarcıklanacak kadar yüksek olmalıdır.

Bu protokol, çiftleşme davranışıyla birlikte maya kokularına sahip bir davranış testini gösterir. Ancak, bu sistem herhangi birine uygulanabilirKoku türü ve diğer davranış türlerine bağlıdır. Bu sistemi diğer kokular için kullanmak için, bileşiklerin tabaklara transferini optimize etmek için hava akışı ve koku ortamını ayarlamak gerekir. Bununla birlikte, genel olarak, hava yoluyla aktarılabilen herhangi bir bileşik, bu sistemle test edilebilir. Buna ek olarak, hem erkekler hem de dişilerde her tür davranış, ya aynı türdeki bulaşıkları kullanarak ya da daha büyük ya da daha küçük test alanlarına erişmek ve bunlara bağlanmak için hortumu ayarlayarak test edilebilir. Ayrıca, daha ayrıntılı davranışlar test edildiğinde, kullanılan kameraların kare hızları ve çözünürlükleri yeniden düşünülmelidir. Her durumda, test kokusunun bulunduğu ve olmadığı her iki deney aynı anda ve aynı hava kaynağıyla çalıştırılırsa, bir denemeden diğerine olan basınç veya konsantrasyon değişikliklerine bakılmaksızın, çevre işaretine karşı herhangi bir yanıt tespit edilebilir. Son olarak, burada gösterilen deney, en az bir başka LD siklusu (48 saate kadar) için uzatılabilir;Ops beslemesi kurumaz değil.

Yazarların ifşa ettikleri hiçbir çıkar çıkarları yoktur.

Sinek stokları için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ediyoruz; C. Gahr, JT Alkema ve S. van Hasselt, basınçlı hava testini geliştirme konusundaki ilk girişimlerinden; Maya yetiştirme tavsiyesi için Jasper Bosman; Ve Rezza Azanchi ve Joel Levine, orijinal olarak Drosophila çiftleşme davranışının zaman aşımı izlemesini geliştirdiler. JA Gorter bir Neuroscience Araştırma Okulu BCN / NWO Lisansüstü Programı hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, kısmen Hollandalı bilimsel araştırma organizasyonu (NWO) (referans: 821.02.020) tarafından JC Billeter tarafından desteklendi.