وهناك طريقة لاختبار تأثير الإشارات البيئية على سلوك التزاوج في

علينا أن نظهر فحص لتحليل الإشارات البيئية والجينية التي تؤثر على سلوك التزاوج في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر .

تتأثر القيادة الجنسية للفرد بالنمط الجيني والخبرة والظروف البيئية. كيف أن هذه العوامل تتفاعل لتعديل السلوكيات الجنسية لا يزال غير مفهومة. في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ، الإشارات البيئية، مثل توافر الغذاء، تؤثر على نشاط التزاوج تقديم نظام قابل للسحب للتحقيق في آليات تحوير السلوك الجنسي. في D. ميلانوغاستر ، غالبا ما تكون الإشارات البيئية مستشعر عن طريق النظم الذقنية الحسية و الشم. هنا، نقدم طريقة لاختبار تأثير الإشارات الكيميائية البيئية على سلوك التزاوج. يتكون الفحص من الساحة التزاوج الصغيرة التي تحتوي على المتوسطة الغذاء وزوجين التزاوج. يتم رصد تردد التزاوج لكل زوجين باستمرار لمدة 24 ساعة. هنا نقدم تطبيق هذا الاختبار لاختبار المركبات البيئية من مصدر خارجي من خلال نظام الهواء المضغوط وكذلك التلاعب في المكونات البيئية مباشرة في ساحة التزاوج. شسي من نظام الهواء المضغوط مفيد بشكل خاص لاختبار تأثير المركبات المتطايرة جدا، في حين أن التلاعب المكونات مباشرة في الساحة التزاوج يمكن أن تكون ذات قيمة للتأكد من وجود المركب. ويمكن تكييف هذا الفحص للرد على أسئلة حول تأثير الإشارات الوراثية والبيئية على السلوك التزاوج والخصوبة وكذلك السلوكيات الإنجابية الأخرى للذكور والإناث.

وعادة ما يكون للسلوك التناسلي تكاليف عالية للطاقة، وخاصة بالنسبة للإناث، الذين ينتجون أشجار أكبر من الذكور، ويجب عليهم أن يختاروا بعناية ظروف تربية ذريتهم النامية. بسبب تكلفة الطاقة، فإنه ليس من المستغرب أن الإنجاب يرتبط الظروف التغذوية. وهذا صحيح في معظم، إن لم يكن كلها، والحيوانات بما فيها الثدييات، التي يمكن أن تتأخر بسبب سوء التغذية، والتي يمكن أن تتأثر سلبا الغذائية تقييد ¹ الدافع الجنسي البلوغ.

ويتأثر استنساخ الكائن الحي النموذجي ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر أيضا بالظروف التغذوية. محكمة الذكور على مستوى أعلى في وجود المواد الغذائية المتطايرة ² ، والإناث أكثر تقبلا جنسيا في وجود الخميرة، والمغذيات الرئيسية لإنتاج البيض والبقاء على قيد الحياة بقاء ^{3 ، 4 ، 5} . هذهتوفر الاستجابة التنموية للإنجاب للأغذية الفرصة لدراسة الآليات التي تربط توافر الأغذية البيئية بالتكاثر الجنسي في كائن حي وراثيا قابل للوقت وفعال. في الواقع، العمل في D. ميلانوغاستر تورط مسار الأنسولين كمنظم مهم من الصلة بين الغذاء والسلوك التزاوج ⁶ . وقد أظهرت أيضا أن فعل التزاوج نفسه يغير تفضيلات الطعام للإناث وكذلك الخلايا العصبية الحسية الكيميائية المرتبطة ^{7 ، 8 ، 9} .

ومن الواضح أن الإشارات الغذائية تؤثر على السلوكيات الإنجابية في D. ميلانوغاستر . ويبدو أن هذه التأثيرات تؤثر بشكل رئيسي على الإناث، وتحديدا أولئك الذين تزاوجوا بالفعل ⁵ . ومع ذلك، لاختبار هذه الآثار الحادة للظروف البيئية الفحص كلاسيكيا المستخدمة لسلوك التزاوج الإناث قدلا تكون مناسبة جدا بسبب انقطاعات طويلة بين حلقات التزاوج. في مقايسة ريميناتينغ الكلاسيكية، وهي أنثى البكر الأولى الاصحاب مع الذكور، وعزل على الفور وقدم مع ذكر جديد 24 إلى 48 ساعة في وقت لاحق. وقد استخدمت هذه المقايسة الكلاسيكية مع نجاح كبير لتحديد مكونات من الذكور القذف التي تعدل سلوك الأنثى والاستجابة الأنثوية ^{12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18} . وبالتالي فإن فحص التزاوج المستمر يظهر هنا، وبالتالي، إضافة إلى المقايسات التزاوج الكلاسيكية التي يمكن استخدامها لدراسة التأثير الحاد للظروف البيئية على السلوكيات الإنجابية.

باستخدام الفحص المستمر لسلوك التزاوج التي تم شرحها هنا، أظهرنا سابقا أن زوج من الذباب المعرضة للخميرة سوف ريمات sعلى مدى 24 ساعة من فترة المراقبة ^{5 ، 19 ، 20 ، 21} ، في حين أن الذباب غير المعرضة للأغذية سوف تكرر مرة واحدة فقط ⁵ . هذه النتيجة يمكن أن تكون محيرة في ضوء جزء كبير من الأدب D. ميلانوغاستر مشيرا إلى أن الإناث لا ريمات لعدة أيام بعد التزاوج الأولي (استعرض في المراجع ^{10 ، 11} ). ومع ذلك، يمكن تفسير هذا التباين بسهولة عن طريق ظروف الفحص، حيث يتم عزل الإناث لمدة تتراوح بين يوم واحد إلى عدة أيام قبل توفير فرصة التزاوج الجديدة. إذا كان الزوج لا يتزاوج في هذه الفترة المراقبة لمدة ساعة، وتتميز الأنثى بأنها ليست تقبلا. وعلاوة على ذلك، لا ينبغي أن يكون ارتفاع تزاوج التزاوج مفاجئا نظرا لأن البيانات من الذباب اشتعلت البرية تظهر أن الإناث تحتوي على الحيوانات المنوية من 4 إلى 6 ذكور في أجهزة التخزين الخاصة بهم؛ وبالتالي فيديكاتينغ أن الإناث بطبيعة الحال ريمات عدة مرات ^{22 ، 23} .

هنا، علينا أن نظهر استخدام هذا الفحص التزاوج المستمر لكشف كيفية جمع الذباب والجمع بين المعلومات حول الظروف البيئية لتعديل تردد التزاوج. يسمح هذا الفحص واحد لاختبار عدد كبير نسبيا من الأزواج التزاوج للدراسات الجينية واختبار تأثير الإشارات البيئية المتقلبة وغير المتطايرة. المقياس عادة ما يعمل لمدة 24 ساعة، ولكن يمكن أن تمتد إلى 48 ساعة، مما يسمح لاختبار الإشارات البيئية الدراجات مثل دورة ضوء الظلام (لد). علينا أن نظهر هذا الاختبار من خلال اختبار تأثير الإشارات المتطايرة من ثقافة الخميرة داخل نظام الهواء المضغوط في تركيبة مع توافر غير المتطايرة المغذيات الخميرة في الركيزة الغذاء.

نظام الهواء المضغوط باستمرار المضخات المتطايرة في ساحة التزاوج التي تحتوي علىالركيزة الغذائية و زوجين اختبار (الذي يتم رصد سلوك التزاوج). لتحديد مزيد من التفاصيل التي من خلالها الخميرة تؤثر على التزاوج، ونحن اختبار مجمع متقلبة كبيرة من الخميرة، وهي حمض الخليك ²⁴ ، جنبا إلى جنب مع محتوى الأحماض الأمينية التي تتطابق مع الخميرة في الركيزة الغذاء، في شكل الببتون (الأمينية الأحماض المستمدة من الهضم الأنزيمي للبروتينات الحيوانية). وتظهر هذه التجارب معا كيف يمكن اختبار تأثير الإشارات البيئية على سلوك التزاوج من D. ميلانوغاستر مع هذا الفحص.

1. مربع التزاوج التي تسيطر عليها بيئيا

1. لضمان تسيطر عليها وسهلة التنظيف منطقة الاختبار، وإعداد المقاوم للصدأ المطبخ مجلس الوزراء من 120 سم × 64 سم × 85 سم كما هو موضح في الشكل 1A.
   1. حفر ثقب واحد في الجزء الخلفي من مجلس الوزراء أسفل السقف وأربع مجموعات من أربعة ثقوب في الجانبين، كل منها يبلغ قطرها 2 سم. حفر أول مجموعتين من أربعة ثقوب، على كل جانب من مربع على ارتفاع 7 سم من الجزء السفلي من مربع ومع 12.5 سم بين الثقوب. حفر المجموعتين الأخريين على كل جانب من مربع على ارتفاع 35 سم من القاع.
      ملاحظة: يتم استخدام أربع مجموعات من أربعة ثقوب لكاميرات الطاقة الكاميرا وأنابيب مضخة الهواء للدخول والخروج من مجلس الوزراء. يتم استخدام الثقب في الجزء الخلفي لكابلات الطاقة من لوحة ضوء.
   2. بناء لوحة ضوء مع 18 صفوف من 40 بالتناوب الثنائيات الباعثة للضوء الأبيض والأحمر (ليد) مع مساحة 2.5 سم بين كل ضوء.العد المصابيح البيضاء والحمراء في سيركوير مع امدادات الطاقة. ربط كل ليد في سلسلة مع المقاوم من 560 Ω، 0.25W و 5٪ التسامح.
      ملاحظة: موجات الانبعاثات من الضوء الأحمر امتدت من 590-661 نانومتر مع ذروة حادة في 627 نانومتر. إن شدة الضوء الناتجة في المنطقة التجريبية حوالي 900 لوكس مع كل من الأضواء على و 90 لوكس فقط مع أضواء حمراء على؛ وقد تم قياس هذا باستخدام التطبيق الذكي ضوء متر.
   3. إرفاق مجلس الضوء إلى الجزء العلوي من الفولاذ المقاوم للصدأ مجلس الوزراء وتمرير كابلات الطاقة من خلال ثقب في الجزء الخلفي.
   4. قم بتوصیل مھایئ المصابیح البیضاء الأبیض إلی موقت تحکم في الطاقة للسماح بإیقاف تشغیل ليد الأبیض أثناء المرحلة المظلمة من التجربة. قم بتوصيل محول الضوء الأحمر، الذي الذباب أعمى إلى ²⁵ ، إلى إمدادات الطاقة العادية للحفاظ عليها لمدة كاملة من التجربة.
   5. إصلاح واحد 110 سم واثنين من قوسين 54 سم طويلة معدنية، ولكل منها عرض 0.5 سم، إلى الجانبين الداخلي من مربع على ارتفاع 50سم من أسفل المربع. وضع لوحة نشر الزجاج بلوري (أبعاد 119.0 سم × 54.5 سم × 0.5 سم) على هذه الأقواس.
   6. إضافة ثلاث طبقات من ورق الترشيح (120 سم × 50 سم) بين لوحة الضوء واللوحة الزجاجية لنشر الضوء والحد من الوهج على سطح ساحات التزاوج (الموصوفة في القسم 4). دبوس اثنين ورقة مرشح ورقة معا على الحافة طويلة على 120 سم طويلة قضبان خشبية باستخدام المغناطيس (على الجانب)، التمسك بها إلى الدواخل من مجلس الوزراء المعادن؛ تنفيذ هذا الإجراء 3 مرات.
   7. إرفاق أربعة المشجعين على جانبي مربع لإنشاء تيار الهواء التي تفتح باستمرار مربع التزاوج. إرفاق المجموعة الأولى من 8 سم المشجعين بين لوحة الضوء واللوحة الزجاجية، مع مدخل الهواء في الجانب الأيسر والعادم في الجانب الأيمن من مربع، للحد من بناء ارتفاع الحرارة الناتجة عن لوحة الضوء.
   8. إرفاق المجموعة الثانية من 12 سم المشجعين 25 سم فوق الجزء السفلي من مجلس الوزراء لخلق تدفق الهواء إلى الخارج أن فتحات طنزيد من مجلس الوزراء ويبرد إلى مستقرة 26 درجة مئوية. إرفاق المشجعين في الجانب العادم إلى خرطوم شفط وقيادة تيار الهواء من الغرفة لمنع إعادة تدوير الهواء في مجلس الوزراء.
2. إعداد اثنين من المدرجات (حوالي 48 سم طويل القامة) التي شنت مع اثنين من المشابك، واحد في 28 سم واحد في 30 سم من قاعدة من الحامل. إصلاح كاميرا ويب على كل من المشابك. قم بتوصيل الكاميرات 4 بجهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برنامج المراقبة.
3. ضع A4 ورقة تحت كل كاميرا ويب. استخدام أوراق بيضاء أو صحائف غير مطبوع مع شبكة مرقمة مسبقا من 7 بنسبة 5 مربعات مع 4 سم محاور لاستيعاب ساحات التزاوج (الموصوفة في القسم 4).
   ملاحظة: كاميرا هد كاميرا ويب مع 78 درجة زاوية واسعة الرؤية و 5 مليون بكسل القرار يمكن أن تغطي مساحة 21 سم × 30 سم المقابلة ل A4 ورقة ورصد ما بين 20 و 35 ساحات التزاوج.

2. يطير تربية وجمع

1. وضع 20 الذكور و 20 أنثى البرية من نوع كانتون- Sيطير في زجاجات تربية ذبابة تحتوي على 45 مل ذبابة غنية المتوسطة الغذاء (انظر القسم 3) لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. نقل نفس البالغين ثلاث مرات من قبل التنصت عليها أولا ثم إلى زجاجات جديدة.
   1. وضع الزجاجات في حاضنة عند 25 درجة مئوية، و 12 ساعة: 12 ساعة ضوء الظلام دورة مع أضواء في الساعة 09:00 (زيتجيبر الوقت (زت) 0). سيظهر جيل جديد بعد حوالي 10 أيام.
2. تخدير الناجم حديثا الذباب إكلوسد على منصات ثاني أكسيد الكربون لمدة لا تزيد عن 5 دقائق وجمعها في قوارير الطعام يطير باستخدام فرشاة الطلاء.
   1. جمع البكر (إكلوسد حديثا) الإناث والذكور البكر من البرية من نوع كانتون- S زجاجات الأسهم في 2.5 سم × 9.5 سم قوارير تربية يطير مع 6.5 مل من الأغذية الغنية الطيران المتوسطة.
3. العمر الذباب في مجموعات الجنس نفسه من 20 يطير كل في قارورة تربية الطيران لمدة 5 إلى 8 أيام عند 25 درجة مئوية و 12 ساعة: 12 ساعة ضوء الظلام دورة والأضواء في الساعة 09:00 (زت 0).
4. Transfإيه الذباب لقوارير تربية ذبابة طازجة في اليوم السابق للتجربة.

3. إعداد الطعام المتوسطة

1. إعداد 1 لتر من ذبابة المتوسطة المتوسطة على النحو التالي.
   1. صب 1 لتر من ماء الصنبور في كوب زجاجي 2 لتر مع شريط مغناطيسي ووضع الكأس على لوحة ساخنة المغناطيسي. الحفاظ على التحريك قبالة وتحويل التدفئة تصل إلى 300 درجة مئوية حتى يتم التوصل إلى درجة حرارة الغليان.
      ملاحظة: خلال فترة الغليان الطويلة في الخطوات التالية سوف تتبخر نسبة من الماء، ولكن جنبا إلى جنب مع المكونات المضافة هذا البروتوكول النتائج في 1 لتر من المتوسطة ذبابة غنية عندما أعدت في درجة حرارة الغرفة حوالي 22 درجة مئوية.
   2. بدوره على التحريك إلى 500 طلقة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) وإضافة المكونات التالية إلى الماء المغلي: 10 غرام أجار، 30 غرام من الجلوكوز، 15 غ سكروز، 15 غرام من الذرة، و 10 غرام من القمح الجرثومية، و 10 غرام من دقيق الصويا، و 30 غراما دبس السكر، 35 جم نشط الخميرة الجافة. انتظر الخميرة إلى رغوة بقوة، ثم رفض درجة الحرارة لوحة الساخنةإراتور إلى 120 درجة مئوية.
   3. بعد 10 دقيقة تحويل لوحة الساخنة وصولا الى 30 درجة مئوية والسماح للخليط ضجة حتى يبرد إلى 48 درجة مئوية. مراقبة درجة الحرارة عن طريق إدراج ميزان الحرارة مباشرة في الطعام.
   4. حل 2 غرام من P- هيدروكسي-بنزويك حمض استر الميثيل (تيغوسيبت، 100٪) إلى 10 مل من الإيثانول 96٪. إضافة هذا و 5 مل من 1 M حمض البروبيونيك إلى الخليط. تحريك لمدة 3 دقائق.
   5. صب المتوسطة الغذاء يطير في الساحات (وصفها في القسم 4) لخلق طبقة سميكة 0.3 سم في الجزء السفلي من الساحة.
      1. استخدام كوب زجاجي 200 مل لسكب. عندما كميات دقيقة مهمة، استخدام ماصة 10 مل المصلية.
2. إعداد المتوسطة يطير ناقص الخميرة بالضبط كما هو موضح في الخطوة 3.1.1 حتى 3.1.5، ولكن تترك الخميرة في الخطوة 3.1.2.
3. إعداد وسط مع أجار مع أو بدون الببتون عن طريق خلط 10 غرام أجار و 35 غرام الببتون في 1 لتر من الماء المغلي وتنفيذ الخطوات 3.1.4 إلى 3.1.5.

4 - ماتينز إعداد الساحة

1. بيرس حفرة حوالي 0.3 سم في القطر على الجانب العلوي من 3.5 سم × 1.0 سم طبق بتري البلاستيك باستخدام إبرة إعداد ساخنة (ساخنة إلى احمرار في الموقد بنسن). بدلا من ذلك، استخدام الحديد لحام.
2. عند إعداد المواد الغذائية المتوسطة مع المركبات الرائحة، ماصة الأولى 30 ميكرولتر (1٪ من المتوسطة الغذاء النهائي، على سبيل المثال حمض الخليك الجليدية 100٪) من المركب المطلوب في الطبق لنصف من الأطباق التجريبية. ترك النصف الآخر من الأطباق فارغة للمقارنة.
   ملاحظة: مع الإعداد الموصوفة هنا، يمكن اختبار بحد أقصى 140 الساحات في آن واحد.
3. باستخدام ماصة 10 مل المصلية، صب 3 مل من الغذاء المتوسطة في الجزء السفلي من الطبق على رأس المجمع المطلوب. قم بتغطيته بقطعة قماش من الجبن لمنع التلوث، وترك الوسط لتصلب لمدة 1 ساعة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
4. وضع غطاء على الأطباق والشريط كل اغلاق على الجانبين. إعداد المقابس فيلم البارافين صغيرة لتغطية ثقوبوالأطباق من قبل قطع المتداول من فيلم البارافين إلى 0.2 سم لفات سميكة ثم قطعها إلى 0.5 سم شرائح.

5. الخميرة الثقافة للرائحة

1. تنمو الخميرة النشطة الجافة على الخميرة استخراج بيبتون سكر العنب (يبد) أجار في 14.0 سم × 2.06 سم طبق بتري. ارتداء قفازات لمنع التلوث في هذه الخطوة.
   1. إعداد يارد أجار لوحات بإضافة 10 غرام استخراج الخميرة، 20 غرام الببتون، 22 غرام من الجلوكوز (0 (+) - مونوهيدرات الجلوكوز) و 15 غرام أجار (نقية) إلى 1 لتر من الماء المغلي عالى النقاء. طبقة الجزء السفلي من طبق بتري مرة واحدة يتم حل كل شيء وتخزين رأسا على عقب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية، لمدة تصل إلى 2 أشهر.
   2. رش بعض الحبوب من الخميرة المجففة على لوحة متوسطة يبد، والسماح لهم تذوب. ثم خط لوحة متوسطة باستخدام حلقة معقمة. تخزين لوحة في حاضنة 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك، تخزين الثقافة في الثلاجة لمدة لا تزيد عن 1 أسبوع.
2. إعداد يبد السائل المتوسطة طن 1 لتر زجاجات بإضافة 10 غرام استخراج الخميرة، 20 غرام الببتون، 22 غرام من الجلوكوز (0 (+) - مونوهيدرات الجلوكوز) وحلقة ضجة إلى 1 L الماء عالى النقاء.
   1. الأوتوكلاف لمدة 25 دقيقة عند 120 درجة مئوية و 1 بار الضغط. بعد ذلك، تخزين الزجاجات في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر حتى الاستخدام.
3. تناسب قبعات زجاجة مفتوحة (4.5 سم) مع 0.32 سم سيليكون الحاجز السميك.
   1. قطع اثنين من الثقوب الصغيرة في الحاجز لتلائم بشكل مريح التجهيزات الحاجز الشائكة. إرفاق أنابيب البولي فينيل الصغيرة (بك) (أقطار: الخارجي 0.8 سم والداخلية 0.5 سم) لكلا المنافذ التي تخرج من زجاجة واحدة فقط من مداخل دخول زجاجة. انظر الشكل 1B للتوضيح.
   2. التفاف قبعات المجهزة والأنابيب في رقائق الألومنيوم والأوتوكلاف لمدة 25 دقيقة عند 120 درجة مئوية و 1 بار الضغط.
4. ارتداء قفازات للحماية من التلوث في هذه الخطوة. تراجع عقيمة ماصة ميكرولتر 100 طرف في واحدة من المستعمرات الخميرة من لوحة يجار يبد (دالمكشوف في 5.1) وإسقاطه في زجاجة يبد المتوسطة السائل تعقيمها.
   1. كاب هذا الخميرة الملقحة يبد زجاجة السائل المتوسطة وكذلك يبد زجاجة التحكم المتوسط ​​(الخميرة لم تضاف) مع قبعات تعقيمها شنت مع في ومخرج (وصفها في الخطوة 5.3). وضع كل من الزجاجات على لوحات مغناطيسية منفصلة ويقلب في 100 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة قبل بدء التجربة للسماح للثقافة الخميرة في النمو.
   2. ربط مداخل كل من زجاجات لفصل مضخات الحوض لتزويد الهواء إلى ثقافة الخميرة. تأكد من توصيل منفذ من زجاجة الخميرة التجريبية إلى أنبوب تنفيس الخميرة رائحة من الغرفة التجريبية لمنع التدخل مع التجربة.

6. مضخة الهواء مجموعة المتابعة

1. إرفاق أنابيب بك كبيرة (أقطار: الخارجي 1.2 سم والداخلية 0.9 سم) لتوريد الهواء المضغوط وقيادة ذلك من خلال اثنين من زجاجات L 1 إرلنمير مليئة الفحم المنشط إلى 800 ملخط لتنقية الهواء. استخدام الهواء المضغوط عادة ما يتم توفيره في المختبرات كإمدادات الهواء، أو توصيل الأنابيب إلى مضخة الهواء (الهواء المضغوط كان يستخدم هنا).
   ملاحظة: يجب اختيار المواد الأنابيب استنادا إلى الخصائص الكيميائية للالمتطايرة، واختبارها لمنع متقلبة من التمسك بطانة الأنابيب (على سبيل المثال بولي تيترافلوروإيثيلين، النايلون أو الفولاذ المقاوم للصدأ).
2. جعل اثنين من الخائن الهواء من أنابيب 15 مل وثلاثة 1،000 ميكرولتر نصائح ماصة لكل منهما.
   1. جعل ثلاثة ثقوب من ~ 1 سم القطر. أولا حرق اثنين من الثقوب، وذلك باستخدام إبرة إعداد ساخنة (ساخنة الأحمر في الموقد بنسن)، المتاخمة لبعضها البعض تحت غطاء أنبوب 15 مل. ثم جعل الثقب الثالث عن طريق إزالة الجزء السفلي من الأنبوب.
   2. الغراء نصائح ماصة ميكرولتر 1،000 في الثقوب مع نهاية ضيقة لافتا إلى الخارج. قطع نهاية نصائح ماصة للسماح أكبر تدفق الهواء.
3. ربط أنابيب بك كبيرة من منفذ من جقارورة إرلنماير مليئة بالخروق إلى طرف ماصة في الجزء السفلي من أنبوب 15 مل. إضافة منافذ الأنابيب البلاستيكية الصغيرة إلى اثنين من نصائح ماصة الأفقية وتقودهم نحو السيطرة وزجاجة التجريبية.
4. لمنع التلوث من وسط يبد مع الكائنات الحية الدقيقة، ونعلق أنابيب صغيرة إلى مرشح حقنة معقمة (0.45 ميكرون حجم المسام) مع دفع البلاستيك على موصل أنابيب الحاجز الذهاب نحو مرشح، ومسمار على موصل الحاجز البلاستيك ترك مرشح. ثم، نعلق الأنابيب إلى مدخل زجاجة الثقافة يبد (انظر الشكل 1B ).
5. لمنع الخميرة المحمولة جوا من السفر من قارورة الثقافة إلى الساحة التجريبية، إرفاق أنبوب زجاجي (6.5 سم، القطر الخارجي = 0.5 سم والقطر الداخلي = 0.3 سم) إلى مخرج كل زجاجة الثقافة يبد باستخدام أنابيب صغيرة. نعلق الأنابيب البلاستيكية إلى الجانب الآخر من أنبوب الزجاج وتؤدي هذا نحو الثقوب السفلى (حفر في كل جانب) من مربع التجربة.
   1. ملء أنبوب مع الألياف الزجاجية والأوتوكلاف قبل الاستخدام.
6. إضافة آخر 15 مل أنبوب الخائن (وصفها في القسم 6.2) إلى أنابيب بك الصغيرة، في كل جانب من المربع التجريبي، للحصول على أنابيب اثنين في مربع في كل من الجانب التجريبي (الأقرب لاستنفاد تيار الهواء مروحة، والحق) وجانب التحكم (الأقرب إلى مدخل تيار مروحة الهواء، اليسار).
7. إعداد 8x 25 مل الماصات المصلية مع كل 10 منافذ لاختبار 80 الأزواج التزاوج في نفس الوقت، أي 40 لكل حالة الجو.
   1. حرق 10 ثقوب من ~ 0.8 سم القطر، 2 سم بعيدا في ماصة.
   2. قطع الجزء الخارجي من حقنة 1 مل في واحدة صغيرة (2.5 سم) واحد كبير (5 سم) منفذ.
   3. الغراء هذه المنافذ في الثقوب مع الغراء الساخن.
   4. التفاف مجموعة صغيرة من البلاستيك فيلم البارافين حول نهاية منافذ وإرفاق 1،000 ميكرولتر ماصة طرف. قطر فتح طرف هو 0.1 سم. استخدم نصائح نظيفة لكل تجربة.
   5. نعلق اثنين ماصات المصلية، وذلك باستخدام T- الخائن مع القطر الخارجي ≥0.5 سم وقطع قصيرة من الأنابيب البلاستيكية الصغيرة، إلى كل من اثنين من منافذ في كلا الجانبين. الشريط الماصات مسطحة على ورقة بيضاء ورقة (تحت الكاميرات في مربع الصلب).
   6. باستخدام رصد تدفق الهواء، تعيين تدفق الهواء بحيث سرعة الهواء عند الخروج من 1000 ميكرولتر ماصة طرف هو 0.5 م / ث. وهذا يتوافق مع تدفق الهواء من 0.0017 لتر / ثانية لكل طرف.

   7. مراقبة سلوك التزاوج

   1. استخدام ماصة الفم (كما هو موضح في المرجع ²⁶ ) لوضع أنثى تجريبية واحدة في طبق بتري صغير (وصفها في القسم 4) في 15:00 ظهرا (زت 6) وتعطي لها 1 ساعة للتأقلم إلى الساحة التزاوج.
   2. قم بإعداد المربع التجريبي (الموضح في القسم 1) كما يلي:
      1. تشغيل الأضواء، أي المصابيح ضوء أبيض على 12h: 12 ساعة ضوء الظلام دورة متصلة الموقت الذي يتحول علىضوء في 09:00 (ZT0) ومصابيح الضوء الأحمر المستمر للسماح رصد الذباب خلال المرحلة المظلمة من التجربة. بدوره على المشجعين للحد من تسخين من مجلس الوزراء من مصدر الضوء وضمان تنفيس الروائح الزائدة خارج منطقة الاختبار.
      2. قم بتوصيل كاميرات كاميرات الويب بجهاز كمبيوتر وابدأها برصد برنامج مراقبة الصور.
      3. لكل كاميرا، تعيين التركيز والسطوع، والتكبير في برنامج الرصد.
         1. انقر بزر الماوس الأيمن على شاشة الكاميرا، وافتح "خصائص الكاميرا"، وانقر على "التركيز التلقائي". ضبط "التركيز" لتوضيح الشبكة أو أي كلمات مكتوبة على ورقة ورقة. إذا لزم الأمر، قم بتغيير "السطوع" و "التكبير".
      4. تعيين برنامج برنامج الرصد لالتقاط 1 صورة كل 2 دقيقة. انقر بزر الماوس الأيمن على كل شاشة الكاميرا واختر "تحرير الكاميرا" ثم خيار "الإجراءات". انقر لبدء الإجراءات "في إنت العاديةإرفالس "وتغيير الوقت إلى" 2 دقيقة ". اختر" أخذ صورة "لاتخاذ إجراءات محددة لأداء وأخيرا انقر على" موافق ".
      5. انقر بزر الماوس الأيمن على كل شاشة الكاميرا وحدد "بدء الرصد".
   3. بعد 1 ساعة (في زت 7)، نقل الذكور ويلديب إلى طبق بتري باستخدام ماصة الفم، ضع الطبق على ورقة ورقة A4 تحت كاميرات كاميرا ويب، وانقر على "بدء الرصد" لمدة 24 ساعة. لتجربة مضخة الهواء، ضع الطبق في مثل هذه الطريقة التي يتم توصيل ماصة منفذ إلى ثقب مدخل الحلبة التزاوج.
   4. لتحليل سلوك تزاوج الزوجين، قم بما يلي.
      1. حدد وفتح جميع الصور في برنامج عرض الصور والصفحة من خلالها في الترتيب الزمني.
      2. اكتب التاريخ ورقم التجربة ورقم الطبق ووقت البدء في جدول بيانات داخل الصف نفسه. تأخذ وقت البدء من كل الساحة من اللحظة التي يتم وضعها تحت ويبكاm. تسجيل الطابع الزمني من الصور.
      3. حدد وقت بدء كل عملية تكاثر في الصف نفسه في جدول البيانات. عد التزاوج كحدث عندما كان الذكور قد شنت الإناث ويبقى الزوجان معتدلة ثابتة وفي نفس الموقف لمدة لا يقل عن خمسة إطارات متتالية (10 دقيقة).
         ملاحظة: ويستند هذا المعيار على طول المبلغ عنها من الجماع، تتراوح بين 12 إلى 27 دقيقة في D. ميلانوغاستر ، والملاحظة التي كوبولاتيونس من 10 دقيقة وأكثر هي خصبة ^{27 ، 28} .
      4. قم بحساب عدد الثقافات لكل صف في جدول البيانات لتحديد تردد التزاوج. بدلا من ذلك، طرح وقت البدء من التجربة من وقت التزاوج الأول لكل صف كمقياس للتزاوج الكمون، أو طرح الوقت من التزاوج الأول من وقت التزاوج الثاني كمقياس للتكرار الكمون.
         1. لحساب زمن الاستجابة، تأكد منتحديد تواريخ التزاوج الأول والثاني كأيام متتالية في برنامج جداول البيانات.
      5. تحليل البيانات مع نماذج الآثار المختلطة، على افتراض التوزيع الطبيعي للبيانات، بما في ذلك تاريخ التجربة كعامل عشوائي، وذلك باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد) لتحديد الدلالة الإحصائية للمتغيرات المستقلة - الوسط الغذائي، نوع الهواء، والتفاعل - كما هو موضح سابقا ⁵ .
      6. حدد أفضل نموذج شرح عن طريق تنفيذ القضاء الوراء للمتغيرات المستقلة غير الهامة باستخدام اختبارات نسبة احتمال السجل والمعلومات أكيك المرتبطة بها. بعد تشغيل النموذج، فحص بصريا بقايا البيانات لتأكيد الحياة الطبيعية. تأكد من تجانس الفروق باستخدام اختبار ليفين. في حالة التجانس غير المتكافئ، تحويل جذر مربع البيانات.

باستخدام هذا الفحص المستمر، السلوك التزاوج، وتزاوج التزاوج في محددة، يمكن تحديدها في ظل الظروف البيئية التجريبية. للسيطرة على الظروف البيئية، قمنا بتحويل مجلس الوزراء المطبخ الفولاذ المقاوم للصدأ في منطقة الاختبار، مع مصدر الضوء الخاصة بها ونشرها، مما يضمن وفرة عالية من الضوء وكمية الحد الأدنى من وهج من أعلى الساحات التزاوج ( الشكل 1A ) . منطقة الاختبار الداخلي مغطاة تماما من الفولاذ المقاوم للصدأ والزجاج، والذي يسمح للتنظيف مع المذيبات العضوية، مثل الهكسان أو الإيثانول. بالإضافة إلى ذلك، تم تجهيز مجلس الوزراء مع الثقوب التي تعمل كمداخل لأنابيب، جلب الإشارات المتطايرة من نظام الهواء المضغوط (انظر الشكلين 1A و 1 B ). نظام الهواء المضغوط، تعديل لرائحة الخميرة، ويتكون من تدفق الهواء الموجهة من خلال ثقافة الخميرة السائلة قبل دخول ساحات الاختبار من خلال 4 الخائن ماصة مع10 منافذ كل ( الشكل 1C ). النظام كله محكم ومزودة بعدة مرشحات للجسيمات، سواء قبل وبعد دخول ثقافة الخميرة، للحد من التلوث مع الروائح الخلط ( الشكل 1B ).

لإثبات استخدام هذا الفحص، اختبرنا ما إذا كانت الإشارات المتطايرة من ثقافة الخميرة يمكن أن تؤثر على سلوك التزاوج. وكان الهواء فقاعة من خلال ثقافة الخميرة السائلة لمدة 24 ساعة، ووضعت منافذ الهواء في مدخل كل الساحة التزاوج (انظر الشكل 2A ). نصف الساحات التزاوج يحتوي على الطعام يطير مع الخميرة (الغذاء + الخميرة)، والنصف الآخر يحتوي على الطعام يطير دون الخميرة المضافة (الغذاء - الخميرة). وقد تعرض أحد الذكور والإناث للروائح القادمة من ثقافة الخميرة الخارجية، وسجلت تزاوجها التزاوج. لتحديد المتغيرات الضرورية لشرح النتائج البيانية، قمنا بتشغيل نماذج الآثار المختلطة، سواء بما في ذلك أو استبعادفي المتغيرات المستقلة من الغذاء المتوسطة، والهواء الخميرة، والتفاعل بين الاثنين. يتم تمثيل أفضل البيانات في الشكل 2B من قبل نموذج بما في ذلك المتغيرات المستقلة من الغذاء المتوسطة (P = 0.001) والهواء الخميرة (p = 0.061)، ولكن ليس هناك تفسير تأثير التفاعل. على الرغم من أن متغير الهواء الخميرة ليست كبيرة في مجموعة البيانات الكاملة هذه، فمن الضروري شرح النتائج. تحليل الهواء الخميرة مفصولة للأغذية المتوسطة يدل على أن زوجين التزاوج لا تستجيب لرائحة الخميرة عندما لا توجد الخميرة الموجودة في الغذاء المتوسطة (الهواء: p = 0.992)، ولكنها تزيد من تواتر التزاوج في الهواء الخميرة عندما الخميرة هو إضافة إلى الوسط الغذائي (الهواء: p = 0.018). وتظهر هذه النتائج معا إمكانية تطبيق نظام الهواء المضغوط لاختبار تأثير الروائح البيئية بالاقتران مع الظروف المتوسطة للأغذية.

كما نوضح كيف يمكن لنظام الهواء المضغوط أن يكون بيبأسيد بإضافة الإشارات الكيميائية البيئية مباشرة إلى الساحة الاختبار. لإثبات أي مركبات خميرة محددة تؤثر على تردد التزاوج، اختبرنا فرضية أن محتوى الأحماض الأمينية من الخميرة ضروري لتأثيره على التزاوج عن طريق وضع جرعة من الببتون (البروتينات تحلل) المقابلة للأحماض الأمينية التي توفرها الخميرة في أجار الركيزة بطانة الساحة التزاوج. اختبرنا أيضا ضرورة حمض الخليك، واحدة من منتجات التخمير المتقلبة الرئيسية من الخميرة، لزيادة تردد التزاوج. وقد تم ذلك بإضافة حامض الخليك مباشرة إلى الوسط الغذائي. تم اختبار ويلديب الذكور والإناث في الساحات التي تحتوي على أجار أو أجار مع الببتون، مع أو بدون حمض الخليك مباشرة في المتوسطة الغذاء ( الشكل 3B ). وهذا يجعل وسط بسيط جدا الغذاء والبيئة السيئة. وبالتالي، فإن متوسط ​​تردد التزاوج كما انخفض بالمقارنة مع الشكل 2B. يتم تمثيل البيانات في الشكل 3B أفضل نموذج بما في ذلك(p = 0.002)، وحمض الخليك (p = 0.001)، والتفاعل بين الاثنين (p = 0.022). زيادة تقبل الإناث على وجود حمض الخليك، ولكن فقط في حالة وجود الببتون في الوسط. وهذا يدل على أن الذباب تحتاج إلى الشعور في وقت واحد الأحماض الأمينية وحمض الخليك لزيادة تردد التزاوج بهم ( الشكل 3B ). وهذا يدل على أن إضافة المركبات الرائحة مباشرة إلى الساحة اختبار يمكن أن تؤثر على سلوك التزاوج وأن تلك التأثيرات يمكن الكشف عنها في ظروف بيئية بسيطة جدا.

الشكل 1: مخطط مربع التجريبية ونظام الهواء المضغوط مع الخميرة. ( A ) رسم تخطيطي لمربع التزاوج التي تسيطر عليها بيئيا الموصوفة في القسم 1. وصف الأرقام المشروحة والسهام: 1. مجلس ضوء مع آل تريناتينغ الأبيض والأحمر أضواء؛ 2. مروحة صغيرة؛ 3. 3 طبقات من ورق الترشيح، كل طبقة تتكون من صفحتين من ورق الترشيح؛ 4. الزجاج نشر لوحة يستريح على بين قوسين تعلق على 3 جوانب من مربع. 5. مروحة كبيرة؛ 6. ثقوب لأنابيب وكابلات؛ 7 - المنطقة التجريبية؛ كبير السهم، 50 سم إلى لوحة من الزجاج؛ السهم الأوسط، ارتفاع 35 سم لثقوب الكابل؛ وسهم صغير، ارتفاع 7 سم لثقوب الأنابيب. ( ب ) رسم تخطيطي لثقافة الخميرة السائلة مع تدفق الهواء، كما هو موضح في الأقسام 5 و 6.4 و 6.5. وصف الأرقام المشروحة: 1. وحدة تصفية القابل للتصرف. 2. كاب مع سيليكون الحاجز و خارج و مداخل. 3. السائل المتوسطة؛ و 4. أنبوب الزجاج مع الألياف الزجاجية. ( C )، تخطيطي، تصوير، بسبب، ال التعريف، الجو، المنافذ، برغم، دسكريبد، إلى داخل، تقاطع، 6.7. وصف الأرقام المشروح: 1. ماصة المصلية. 2. قطع الأنابيب من حقنة 1 مل، و 3. 1،000 ميكرولتر ماصة طرف.تارجيت = "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: رائحة الخميرة يزيد من تقبل الإناث في وجود الخميرة في الركيزة الغذاء. ( A ) رسم تخطيطي من الساحة التزاوج مع واحد من الذكور والإناث واحد وماصة طرف من منفذ الهواء في الشكل 1C دخول من خلال ثقب مدخل. ( B ) عرض بياني للاستجابة في تزاوج تردد كانتون- S الزوجين التزاوج إلى رائحة الخميرة مع وبدون الخميرة في ذبابة المتوسطة الغذاء (الغذاء - الخميرة: الهواء المتوسط ​​ن = 12، الخميرة الهواء ن = 13 و فود + الخميرة : متوسط ​​الهواء ن = 24، الخميرة الهواء ن = 23). رسم بياني خطي مع أشرطة الخطأ سيم والإخراج الإحصائي من نماذج الآثار المختلطة مع الهواء كمتغير مستقل وتاريخ كمتغير عشوائي لكل المتوسطة الغذائية بشكل مستقل. و ستاتيستيكا الرئيسيةلتر نموذج يشمل الغذاء (p = 0.001) والهواء الخميرة (p = 0.061). مقتبس من المرجع ⁵ . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: حمض الخليك في الركيزة الغذاء يطير يزيد من تقبل الإناث في وجود الببتون. ( A ) رسم تخطيطي لساحة التزاوج، مع يطير الطعام المتوسطة التي تحتوي على حمض الخليك والبلاستيك فيلم البارافين قابس إغلاق مدخل حفرة. ( B ) عرض بياني لتكرار التزاوج من زوجين التزاوج كانتون- S ردا على حمض الخليك إما على أجار أو وسط الببتون (أجار: حمض أسيتيك ن = 52، + حامض الخليك ن = 40 والببتون: حمض أسيتيك ن = 28، + حامض الخليك ن = 25). رسم بياني خطي مع أشرطة الخطأ سيم و ستاتي(p = 0.002)، والهواء الحامض الخليك (p = 0.001)، والغذاء * الهواء (p = 0.022) كمتغيرات مستقلة وتاريخ كمتغير عشوائي. مقتبس من المرجع ⁵ . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يصف هذا البروتوكول فحص لاختبار السلوك التزاوج أكثر من 24 ساعة في حين تسيطر باستمرار على الإشارات البيئية التي يفترض أن زوجين التزاوج لاستخدامها لتحديد تردد التزاوج. فمن الممكن لزيادة تردد التزاوج ردا على الهواء الخميرة تسليمها من خلال نظام الهواء المضغوط عندما يحتوي المتوسطة الخميرة كذلك ( الشكل 2B ). بالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة استجابة مماثلة في تردد التزاوج مع المتوسطة الغذائية مبسطة تحتوي فقط أجار، الببتون، ورائحة حمض الخليك مباشرة في المتوسطة ( الشكل 3B )

مع التجارب التي تظهر هنا، لا يمكن استخلاص النتائج إلا على سلوك التزاوج العام للزوجين، لأن كلا الجنسين يتعرضون لنفس الظروف البيئية. ومع ذلك، فإننا نعلم من الأبحاث السابقة أن 47٪ من الاختلاف في تردد التزاوج يتم تحديدها من قبل الإناث، في حين أن مساهمة الذكور تمثل فقط 11٪ من الاختلاف²⁰ . ولذلك، فإن معظم التغيرات في تردد التزاوج لوحظ من المرجح أن تكون نتيجة لالتقبل الجنسي للإناث. زيادة الذكور محاكة لا يزال يترك الإناث لقبول أو رفض التزاوج، كما الكبار D. ميلانوغاستر الإناث يمكن أن تحرف بنجاح محاولات التزاوج ²⁹ . وللاستنتاجات الراسخة وتحديد الاختلافات في تردد التزاوج للإتقان الجنسي للإناث على وجه التحديد، من الضروري اختبار أزواج تزاوج إضافية حيث يختلف النمط الوراثي للإناث ولكن يبقى الذكور ثابتا.

وقد أثبت هذا البروتوكول طريقتين لتقديم المركبات الرائحة للزوجين التزاوج، إما مع نظام الهواء المضغوط أو مباشرة في الغذاء المتوسطة. نظام الهواء المضغوط لديه ميزة أن أي تأثير يمكن أن يعزى إلى المركبات التي يتم تسليمها من خلال الهواء، في حين أن هذا لا يمكن استنتاجها عندما يتم وضع المركبات مباشرة في الغذاء المتوسطة. من ناحية أخرى، wالدجاجة لا يوجد تأثير مع نظام الهواء المضغوط، فإنه لا يعني تلقائيا أن جديلة لا يؤثر على السلوك. ويمكن أن يعني أيضا أن المجمع لا يتم تسليمها بكفاءة من خلال نظام الهواء المضغوط. ويمكن تحليل تكوين الهواء في منفذ نظام تسليم الهواء عن طريق وضع فلتر الهيدروكربونية وتحليل محتوى الهواء المحاصرين مع اللوني للغاز إلى جانب مطياف الكتلة. نظام الهواء المضغوط هو فحص جيد لاختبار المركبات التي يمكن بسهولة جعلها المحمولة جوا على مدى أطول. وقد يكون من الضروري وضع مركبات أقل تقلبا في الوسط الغذائي مباشرة. عيب آخر من نظام الهواء المضغوط هو تأثير سرعة الهواء يمكن أن يكون على سلوك الطيران. الذباب تتوقف تتحرك عندما تكون سرعة الهواء مرتفعة جدا (فوق 0.7-1.6 م / ث) ³⁰ . بالإضافة إلى ذلك، فإن نظام الهواء المضغوط يمكن أن تجعل بيئة بسيطة، وذات جودة منخفضة لا تطاق من خلال تجفيف المتوسطة الغذاء. في كلتا الحالتين، قد الذباب لا بيرفأورم على قدم المساواة بشكل جيد، ولا يمكن بعد ذلك أن تعزى أي استنتاجات إلى مركبات محددة اختبارها.

عدة خطوات ضرورية أثناء التحضير للتشغيل الأمثل لهذه المقايسات. الخطوة الأولى التي تتطلب الاهتمام هي إعداد الوسيط. من المهم أن يتم تحضير الوسط، بما في ذلك المركبات المتطايرة الرائحة مثل حامض الخليك، في يوم التجربة وليس عاجلا من أجل تجنب التبخر. أيضا، يحتاج المتوسطة إلى تتصلب على سطح مع عدم وجود تدفق الهواء اضافية (تجنب استخدام اغطية الدخان لهذا)، لأن تدفق الهواء يمكن أن تحفز تبخر الرائحة. الخطوة الثانية التي تتطلب رعاية خاصة هي إنشاء نظام الهواء المضغوط. تدفق الهواء يحتاج إلى أن تكون عالية بما فيه الكفاية فقاعة بلطف ثقافة الخميرة دون نقل أي السوائل إلى الساحة.

هذا البروتوكول يوضح فحص السلوكي مع الروائح الخميرة في تركيبة مع السلوك التزاوج. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا النظام على أينوع من الرائحة، فضلا عن أنواع أخرى من السلوكيات. لاستخدام هذا النظام لروائح أخرى، فمن الضروري لضبط تدفق الهواء ورائحة المتوسطة لتحسين نقل المركبات إلى الأطباق. ومع ذلك، بشكل عام، أي مركب التي يمكن نقلها عن طريق الجو يمكن اختبارها مع هذا النظام. وبالإضافة إلى ذلك، أي نوع من السلوك، في كل من الذكور والإناث، ويمكن اختبار، إما باستخدام نفس النوع من الأطباق أو عن طريق ضبط الأنابيب للوصول إلى وربط أكبر أو أصغر مجالات الاختبار. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم اختبار السلوكيات أكثر تفصيلا، ومعدلات الإطار وقرارات الكاميرات المستخدمة تحتاج إلى إعادة النظر فيها. على أي حال، إذا تم تشغيل كل من التجارب مع وبدون رائحة الاختبار في نفس الوقت ومع نفس مصدر الهواء، يمكن الكشف عن أي رد على جديلة البيئية، بغض النظر عن التغيرات في الضغط أو التركيز من تجربة واحدة إلى أخرى. وأخيرا، يمكن أن تمتد الفحص أظهرت هنا على الأقل دورة أخرى لد (تصل إلى 48 ساعة)، طالما أن fإمدادات العود لا يجف.

المؤلفين ليس لديهم مصالح المتنافسة للكشف.

نشكر مركز الأسهم بلومينغتون ذبابة الفاكهة للأسهم ذبابة. C. غهر، جت ألكيما، و S. فان هاسلت لمحاولتهم المبكرة في تطوير مقايسة الهواء المضغوط؛ جاسبر بوسمان للحصول على المشورة بشأن زراعة الخميرة. و ريززا أزانشي وجويل ليفين لتطوير أصلا رصد الفاصل الزمني للسلوك التزاوج ذبابة الفاكهة . تم دعم جا غورتر من قبل مدرسة أبحاث علم الأعصاب بن / نو برنامج الدراسات العليا. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (نو) (المرجع: 821.02.020) إلى جس بيليتر.