Une méthode pour tester l'effet des cotes environnementales sur le comportement d'accouplement dans

Nous démontrons un dosage pour analyser les indices environnementaux et génétiques qui influent sur le comportement d'accouplement dans la mouche des fruits Drosophila melanogaster .

Le comportement sexuel d'un individu est influencé par le génotype, l'expérience et les conditions environnementales. La façon dont ces facteurs interagissent pour moduler les comportements sexuels reste mal comprise. Dans Drosophila melanogaster , les indices environnementaux, tels que la disponibilité alimentaire, affectent l'activité d'accouplement, offrant un système de traçabilité permettant d'étudier les mécanismes qui modulent les comportements sexuels. Dans D. melanogaster , les signaux environnementaux sont souvent détectés via les systèmes gustatifs chemosensoriels et olfactifs. Ici, nous présentons une méthode pour tester l'effet des indices chimiques environnementaux sur le comportement d'accouplement. Le dosage consiste en une petite arène d'accouplement contenant du milieu alimentaire et un couple d'accouplement. La fréquence d'accouplement pour chaque couple est surveillée en permanence pendant 24 h. Nous présentons ici l'applicabilité de ce dosage pour tester les composés environnementaux à partir d'une source externe à travers un système d'air sous pression ainsi que la manipulation des composants environnementaux directement dans l'arène d'accouplement. VousLa présence d'un système d'air sous pression est particulièrement utile pour tester l'effet de composés très volatils, tout en manipulant des composants directement dans l'arène d'accouplement peut être utile pour déterminer la présence d'un composé. Ce dosage peut être adapté pour répondre aux questions sur l'influence des indices génétiques et environnementaux sur le comportement d'accouplement et la fécondité ainsi que sur d'autres comportements reproducteurs masculins et féminins.

Les comportements reproductifs ont généralement des coûts énergétiques élevés, en particulier pour les femmes, qui produisent des gamètes plus grands que les mâles et doivent soigneusement choisir les conditions pour élever leur progéniture en développement. En raison du coût de l'énergie, il n'est pas surprenant que la reproduction soit liée aux conditions nutritionnelles. Cela est vrai dans la plupart des animaux, y compris les animaux, y compris les mammifères, dont la puberté peut être retardée par la malnutrition et dont le comportement sexuel peut être affecté négativement par la restriction alimentaire ¹ .

La reproduction de l'organisme modèle génétique Drosophila melanogaster est également affectée par des conditions nutritionnelles. Le tribunal masculin à un niveau supérieur en présence de substances volatiles alimentaires ² , et les femelles sont plus sexuellement réceptives en présence de levure, un nutriment majeur pour la production d'œufs et la survie de la progéniture ^{3 , 4 , 5} . CeLa réponse reproductive reproductive évolutive aux aliments offre la possibilité d'étudier des mécanismes qui relient la disponibilité alimentaire environnementale à la reproduction sexuelle dans un organisme génétiquement traitable et efficace dans le temps. En effet, le travail dans D. melanogaster a impliqué la voie de l'insuline comme un régulateur important de la connexion entre la nourriture et le comportement d'accouplement ⁶ . Il a également montré que l'acte d'accouplement change la préférence alimentaire des femelles ainsi que les neurones chimiosensibles associés ^{7 , 8 , 9} .

Il est clair que les indices alimentaires affectent les comportements reproductifs chez D. melanogaster . Ces effets semblent affecter principalement les femmes, en particulier celles qui ont déjà accouplé ⁵ . Cependant, pour tester ces effets aigus des conditions environnementales, le dosage classiquement utilisé pour le comportement d'accouplement féminin pourraitNe pas être très approprié en raison des longues interruptions entre les épisodes d'accouplement. Dans l'essai de remix classique, une femelle vierge s'accouple avec un homme et est immédiatement isolée et présente un nouveau mâle de 24 à 48 h plus tard. Cet essai classique a été utilisé avec beaucoup de succès pour identifier les composants de l'éjaculation masculin qui modifient le comportement féminin et la réponse féminine ^{12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} . L'essai d'accouplement continu démontré ici, est donc un ajout aux essais d'accouplement classiques qui peuvent être utilisés pour étudier l'effet aigu des conditions environnementales sur les comportements reproductifs.

En utilisant l'analyse continue du comportement d'accouplement qui est expliqué ici, nous avons précédemment montré qu'une paire de mouches exposées à la levure remettait sChaque fois sur une période d'observation de 24 h ^{5 , 19 , 20 , 21} , alors que les mouches ne sont pas exposées à la nourriture ne seront remises qu'une fois ⁵ . Cette découverte peut être troublante à la lumière d'une grande partie de la littérature de D. melanogaster indiquant que les femelles ne se remèment pas pendant plusieurs jours après un accouplement initial (examiné dans les références ^{10 , 11} ). Cependant, cette divergence s'explique facilement par des conditions de dosage, où une femme est isolée pendant un à plusieurs jours avant qu'une nouvelle opportunité d'accouplement ne soit fournie. Si la paire ne s'accroche pas dans cette période d'observation d'une heure, la femelle est caractérisée comme non réceptive. En outre, la fréquence d'accouplement élevée ne devrait pas être surprenante étant donné que les données provenant de mouches sauvages montrent que les femelles contiennent des spermatozoïdes de 4 à 6 mâles dans leurs organes de stockage; Donc dansDisant que les femelles se remètent naturellement à plusieurs reprises ^{22 , 23} .

Ici, nous démontrons l'utilisation de cet essai d'accouplement continu pour décrire comment les mouches se rassemblent et combinent des informations sur les conditions environnementales pour moduler la fréquence d'accouplement. Ce test permet de tester un nombre relativement élevé de couples d'accouplement pour des études génétiques et de tester l'influence de signaux environnementaux volatiles et non volatiles. Le dosage fonctionne généralement pendant 24 h, mais peut être prolongé jusqu'à 48 h, ce qui permet de tester les signaux environnementaux cycliques tels que le cycle lumière-sombre (LD). Nous démontrons ce dosage en testant l'influence des indices volatiles d'une culture de levure dans un système d'air sous pression en combinaison avec la disponibilité de nutriments de levure non volatiles dans le substrat alimentaire.

Le système d'air sous pression pompe continuellement des signaux volatiles dans une arène d'accouplement qui contientUn substrat alimentaire et un couple de test (dont le comportement d'accouplement est surveillé). Pour déterminer davantage les spécificités par lesquelles la levure influence l'accouplement, nous testons un composé volatil majeur de levure, à savoir l'acide acétique ²⁴ , en combinaison avec une teneur en acides aminés qui correspond à celle de la levure dans le substrat alimentaire, sous forme de peptone (amino Acides dérivés de la digestion enzymatique des protéines animales). Ensemble, ces expériences démontrent comment l'effet des indices environnementaux sur le comportement d'accouplement de D. melanogaster peut être testé avec ce dosage.

1. Boîte d'accouplement contrôlée par l'environnement

1. Pour assurer une zone d'essai contrôlée et facile à nettoyer, installez une armoire de cuisine en acier inoxydable de 120 cm x 64 cm x 85 cm, comme illustré à la figure 1A.
   1. Percer un trou à l'arrière de l'armoire juste en dessous du plafond et quatre ensembles de quatre trous dans les côtés, chacun avec un diamètre de 2 cm. Percer les deux premiers ensembles de quatre trous, de chaque côté de la boîte à une hauteur de 7 cm du bas de la boîte et à 12,5 cm entre les trous. Percer les deux autres ensembles de chaque côté de la boîte à une hauteur de 35 cm du bas.
      REMARQUE: les quatre ensembles de quatre trous sont utilisés pour que les câbles d'alimentation de l'appareil photo et les tubes de la pompe à air pénètrent et sortent de l'armoire. Le trou à l'arrière est utilisé pour les câbles d'alimentation d'un panneau lumineux.
   2. Créez un panneau lumineux avec 18 lignes de 40 diodes électroluminescentes (LED) en alternance et blancs avec un espace de 2,5 cm entre chaque lumière. Monter les LED blanches et rouges en circuitT avec alimentation électrique. Connectez chaque LED en série avec une résistance de 560 Ω, 0.25W et une tolérance de 5%.
      REMARQUE: les longueurs d'onde d'émission du feu rouge s'étendaient de 590 à 661 nm avec un pic pointu à 627 nm. L'intensité lumineuse résultante dans la zone expérimentale est d'environ 900 lux avec les deux lumières allumées et 90 lux avec seulement les feux rouges allumés; Cela a été mesuré à l'aide d'une application de compteur de lumière pour smartphones.
   3. Fixez le panneau lumineux au haut de l'armoire en acier inoxydable et passez les câbles d'alimentation à travers le trou à l'arrière.
   4. Connectez l'adaptateur des LED blanches à une minuterie de commande de puissance pour permettre d'éteindre la LED blanche pendant la phase obscure de l'expérience. Connectez l'adaptateur de la lumière rouge, qui vole est aveugle à ²⁵ , à une alimentation régulière pour les maintenir allumés pendant toute la durée de l'expérience.
   5. Fixez un cordon métallique de 110 cm et deux de 54 cm de long, chacun avec une largeur de 0,5 cm, aux côtés intérieurs de la boîte à une hauteur de 50Cm du bas de la boîte. Placez une plaque de diffusion de verre dépoli (dimensions de 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) sur ces supports.
   6. Ajoutez trois couches de papier filtrant (120 cm x 50 cm) entre le panneau lumineux et la plaque de verre pour diffuser la lumière et limiter l'éblouissement sur la surface des arènes correspondantes (décrit à la section 4). Enfilez deux feuilles de papier filtre sur leur bord long sur des tiges en bois de 120 cm de long à l'aide d'aimants (sur le côté), pour les coller à l'intérieur de l'armoire métallique; Effectuez cette action 3 fois.
   7. Fixez quatre ventilateurs sur les côtés de la boîte pour créer un flux d'air qui évacue continuellement la boîte d'accouplement. Fixez le premier ensemble de ventilateurs de 8 cm entre le panneau lumineux et la plaque de verre, avec l'entrée d'air du côté gauche et l'échappement sur le côté droit de la boîte, afin de minimiser l'accumulation de chaleur générée par le panneau lumineux.
   8. Fixez le deuxième ensemble de ventilateurs de 12 cm 25 cm au-dessus du bas de l'armoire pour créer un flux d'air extérieur qui évacue le iNside du cabinet et le refroidit à une température stable de 26 ° C. Fixez les ventilateurs côté échappement à un tuyau d'aspiration et conduisez le flux d'air hors de la pièce pour empêcher le recyclage de l'air dans l'armoire.
2. Mettre en place deux supports (environ 48 cm de hauteur) montés avec deux pinces, une à 28 cm et une à 30 cm de la base du support. Fixez une webcam sur chacune des pinces. Connectez les 4 caméras à un ordinateur exécutant le logiciel de surveillance.
3. Placez les feuilles A4 sous chaque webcam. Utilisez des feuilles ou des feuilles blanches non imprimées avec une grille pré-numérotée de 7 par 5 carrés avec des axes de 4 cm pour tenir compte des arènes d'accouplement (décrites à la section 4).
   REMARQUE: une caméra webcam HD avec une vue grand angle de 78 ° et une résolution de 5 millions de pixels peut couvrir une surface de 21 cm x 30 cm correspondant à une feuille A4 et surveiller entre 20 et 35 zones d'accouplement.

2. Élevage et collecte de la mouche

1. Placez 20 hommes et 20 femmes de type sauvage Canton-SVole dans des bouteilles d'élevage de mouches contenant 45 mL de milieu alimentaire riche en mouches (voir la section 3) pendant trois à quatre jours. Transférer les mêmes adultes trois fois en les tapant tout d'abord et ensuite dans des bouteilles fraîches.
   1. Placez les bouteilles dans un incubateur à 25 ° C et 12 h: 12 h de cycle clair-sombre avec les lumières allumées à 09:00 (heure de Zeitgeber (ZT) 0). Une nouvelle génération apparaîtra environ 10 jours plus tard.
2. Anesthésier les mouches nouvellement fermées résultantes sur des tampons de dioxyde de carbone pendant plus de 5 minutes et les recueillir dans des flacons de nourriture à la mouche à l'aide d'une brosse à peinture.
   1. Recueillir les femelles vierges (nouvellement fermées) et les mâles vierges des bouteilles de stock de type sauvage Canton-S dans des flacons d'élevage de mouches de 2,5 cm x 9,5 cm avec 6,5 ml de milieu riche en mouches.
3. Âge, les mouches dans les groupes de même sexe de 20 mouches chacune dans des flacons d'élevage de mouches pendant 5 à 8 jours à 25 ° C et 12 h: 12 h de cycle clair-sombre et les lumières allumées à 09:00 (ZT 0).
4. TransfLes mouches aux flacons d'élevage de mouches fraîches la veille de l'expérience.

3. Préparation moyenne alimentaire

1. Préparez 1 L de moyen de mouche riche comme suit.
   1. Versez 1 L d'eau du robinet dans un bécher en verre de 2 L avec une barre d'agitation magnétique et placez le bécher sur une plaque chauffante magnétique. Maintenir l'agitation et faire chauffer jusqu'à 300 ° C jusqu'à ce que la température d'ébullition soit atteinte.
      REMARQUE: Pendant le temps d'ébullition prolongé dans les étapes suivantes, une proportion d'eau s'évapore, mais avec les ingrédients ajoutés, ce protocole entraîne 1 L de milieu de mouche riche lorsqu'il est préparé à température ambiante d'environ 22 ° C.
   2. Mettez sous agitation à 500 rounds par minute (rpm) et ajoutez les ingrédients suivants à l'eau bouillante: 10 g d'agar, 30 g de glucose, 15 g de saccharose, 15 g de farine de maïs, 10 g de germe de blé, 10 g de farine de soja, 30 g Mélasse, 35 g de levure sèche active. Attendez que la levure crache vigoureusement, puis baissez la température de la plaque chauffanteÀ 120 ° C.
   3. Après 10 minutes, tourner la plaque chauffante jusqu'à 30 ° C et laisser le mélange remuer jusqu'à refroidissement à 48 ° C. Surveillez la température en insérant un thermomètre directement dans les aliments.
   4. Dissoudre 2 g d'ester méthylique d'acide p-hydroxy-benzoïque (tegosept, 100%) dans 10 ml d'éthanol à 96%. Ajouter ceci et 5 ml d'acide propionique 1 M dans le mélange. Remuer pendant 3 min.
   5. Verser le milieu alimentaire de la mouche dans les arènes (décrit dans la section 4) pour créer une couche de 0,3 cm d'épaisseur au bas de l'arène.
      1. Utilisez un bécher en verre de 200 ml pour verser. Lorsque les quantités exactes sont importantes, utilisez une pipette sérologique de 10 ml.
2. Préparer le moyen moule moins la levure exactement comme décrit à l'étape 3.1.1 jusqu'à 3.1.5, mais laisser tomber la levure à l'étape 3.1.2.
3. Préparer le milieu avec de la gélose avec ou sans peptone en mélangeant 10 g d'agar et 35 g de peptone dans 1 L d'eau bouillante et effectuer les étapes 3.1.4 à 3.1.5.

4. MatinG Préparation à l'arène

1. Percez un trou d'environ 0,3 cm de diamètre sur le côté supérieur d'une boîte à pétales en plastique de 3,5 cm x 1,0 cm à l'aide d'une aiguille de préparation chauffée (chauffée à la rougeur dans un brûleur Bunsen). Alternativement, utilisez un fer à souder.
2. Lorsque vous préparez un milieu alimentaire avec des composés odorants, faites d'abord une pipette de 30 μL (1% du milieu alimentaire final, par exemple l'acide acétique glacial 100%) du composé souhaité dans le plat pour la moitié des plats expérimentaux. Laissez l'autre moitié de la vaisselle vide pour comparaison.
   REMARQUE: avec la configuration décrite ici, un maximum de 140 arènes peut être testé à la fois.
3. À l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml, versez 3 ml de milieu alimentaire au fond du plat sur le composé désiré. Couvrez-le avec un chiffon à fromage pour éviter toute contamination et laissez le milieu se solidifier pendant environ 1 heure à température ambiante.
4. Placez un couvercle sur la vaisselle et tapez chaque fermeture sur deux côtés. Préparer de petits bouchons de paraffine pour couvrir les trous deLa vaisselle en roulant des morceaux de paraffine dans des rouleaux de 0,2 cm d'épaisseur, puis on les coupe dans des segments de 0,5 cm.

5. Culture de levure pour l'odeur

1. Cultiver une levure active sèche sur de l'extrait de levure de peptone de dextrose (YPD) dans une boîte de Petri de 14,0 cm x 2,06 cm. Portez des gants pour éviter toute contamination dans cette étape.
   1. Préparer des plaques d'agar YPD en ajoutant 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone, 22 g de glucose (0 (+) - glucose monohydraté) et 15 g d'agar (pur) à 1 L d'eau éponge ultrapure. Couchez le fond de la boîte de Petri une fois que tout est dissous et rangez à l'envers dans le réfrigérateur à 4 ° C, jusqu'à 2 mois.
   2. Saupoudrer quelques grains de levure séchée sur une plaque moyenne YPD, les laisser dissoudre. Ensuite, striez la plaque moyenne en utilisant une boucle stérile. Rangez la plaque dans un incubateur à 30 ° C toute la nuit. Ensuite, rangez la culture au réfrigérateur pendant plus de 1 semaine.
2. Préparez YPD liquide moyen iN 1 L en ajoutant 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone, 22 g de glucose (0 (+) - glucose monohydraté) et une barre d'agitation à 1 L d'eau ultrapure.
   1. Autoclave pendant 25 min à 120 ° C et 1 bar de pression. Ensuite, rangez les bouteilles à 4 ° C jusqu'à 2 mois jusqu'à utilisation.
3. Ajuster les bouchons ouverts (4,5 cm) avec une cloison en silicone de 0,32 cm d'épaisseur.
   1. Coupez deux petits trous dans le septum pour ajuster parfaitement les raccords de cloison barbelés. Fixez le petit tube de chlorure de polyvinyle (PVC) (diamètres: extérieur 0,8 cm et 0,5 cm intérieur) aux deux sorties qui sortent de la bouteille et à une seule des entrées entrant dans la bouteille. Voir la figure 1B à titre d'illustration.
   2. Enrouler les capuchons et les tubes en aluminium et autoclave pendant 25 min à 120 ° C et 1 bar de pression.
4. Portez des gants pour protéger contre la contamination dans cette étape. Trempez une pointe de pipette stérile de 100 μL dans l'une des colonies de levure de la plaque d'agar YPD (dDécrit dans 5.1) et déposez-le dans la bouteille liquide liquide YPD autoclavée.
   1. Capuchons cette bouteille liquide liquide YPD inoculée à la levure ainsi qu'une bouteille de contrôle moyenne YPD (levure non ajoutée) avec des bouchons autoclavés montés avec entrée et sortie (décrits à l'étape 5.3). Mettez les deux bouteilles sur des plaques magnétiques séparées et agitez à 100 tr / min à température ambiante pendant 24 h avant le début de l'expérience pour permettre à la culture de levure de croître.
   2. Connectez les entrées des deux bouteilles pour séparer les pompes d'aquarium pour fournir de l'air à la culture de la levure. Assurez-vous de connecter la sortie de la bouteille de levure expérimentale à un tube qui évacue l'odeur de levure hors de la salle expérimentale pour éviter toute interférence avec l'expérience.

6. Installation de la pompe à air

1. Fixez le grand tube en PVC (diamètres: extérieur 1,2 cm et 0,9 cm interne) à un courant d'air sous pression et le conduire à travers deux flacons Erlenmeyer en verre de 1 L remplis de charbon actif aux 800 mlLigne pour purifier l'air. Utilisez l'air sous pression généralement fourni dans les laboratoires comme alimentation en air, ou connectez les tubes à une pompe à air (l'air sous pression a été utilisé ici).
   REMARQUE: Le matériau de la tubulure doit être choisi en fonction des propriétés chimiques de la volatilité et testé pour éviter que les volatils ne collent à la doublure du tube (p. Ex. Polytétrafluoroéthylène, nylon ou acier inoxydable).
2. Faites deux séparateurs d'air à partir de tubes de 15 ml et trois boutons de pipette 1000 μL chacun.
   1. Faire trois trous de ~ 1 cm de diamètre. Préchauffer d'abord deux trous, en utilisant une aiguille de préparation chauffée (rouge chauffé dans un brûleur Bunsen), adjacente l'un à l'autre juste au-dessous du couvercle du tube de 15 ml. Ensuite, faites le troisième trou en enlevant le fond du tube.
   2. Collez les pointes de pipette de 1000 μL dans les trous avec l'extrémité étroite pointant vers l'extérieur. Couper la fin des pointes de la pipette pour permettre un meilleur débit d'air.
3. Raccorder le grand tube en PVC de la sortie du cErlenmeyer rempli de harcole à la pointe de la pipette au fond du tube de 15 mL. Ajouter de petites prises de tubes en PVC aux deux pointes de pipettes horizontales et les conduire vers un contrôle et une bouteille expérimentale.
4. Pour éviter la contamination du milieu YPD par des microorganismes, fixez le petit tube à un filtre à seringue stérile (taille de pore de 0,45 μm) avec une pression plastique sur le connecteur de la cloison de la cloison vers le filtre et une vis sur le connecteur en plastique de la cloison sortant du filtre. Ensuite, fixez le tube à l'entrée de la bouteille de culture YPD (voir Figure 1B ).
5. Pour éviter que la levure dans l'air ne se déplace du ballon de culture dans l'arène expérimentale, attachez un tube de verre (6,5 cm de long, diamètre extérieur = 0,5 cm et diamètre intérieur = 0,3 cm) à la sortie de chaque bouteille de culture YPD en utilisant de petits tubes. Fixez le tube en PVC de l'autre côté du tube de verre et dirigez-le vers les trous inférieurs (forés de chaque côté) de la boîte d'expérience.
   1. Remplissez le tube avec de la fibre de verre et autoclavez-le avant utilisation.
6. Ajouter un autre séparateur de tube de 15 mL (décrit dans la section 6.2) sur le petit tube en PVC, de chaque côté de la boîte expérimentale, pour obtenir deux tubes dans la boîte au côté expérimental (le plus proche de l'échappement du flux d'air du ventilateur, à droite) Et le côté de commande (le plus proche de l'entrée du flux d'air du ventilateur, à gauche).
7. Préparez 8x 25 mL de pipettes sérologiques chacune avec 10 sorties pour tester 80 couples accouplés en même temps, soit 40 pour chaque condition atmosphérique.
   1. Brûlez 10 trous de ~ 0,8 cm de diamètre, 2 cm de distance dans la pipette.
   2. Couper la partie extérieure d'une seringue de 1 ml dans une petite (2,5 cm) et une grande (5 cm) de sortie.
   3. Collez ces prises dans les trous avec de la colle chaude.
   4. Enrouler une petite bande de film de paraffine en plastique autour de la fin des sorties et attacher une pointe de pipette de 1000 μL. Le diamètre de l'ouverture de la pointe est de 0,1 cm. Utilisez des conseils propres pour chaque expérience.
8. Fixez deux pipettes sérologiques, en utilisant un diviseur en T avec un diamètre extérieur ≥ 0,5 cm et des petits morceaux de petits tubes en PVC, à chacune des deux sorties des deux côtés. Tapez les pipettes à plat sur la feuille de papier blanc (sous les caméras dans la boîte en acier).
9. À l'aide d'un moniteur de débit d'air, régler le débit d'air de sorte que la vitesse de l'air à la sortie de la pointe de pipette de 1000 μL soit de 0,5 m / s. Cela correspond à un débit d'air de 0,0017 L / s par pointe.

7. Surveillance du comportement d'accouplement

1. Utilisez une pipette à bouche (comme décrit dans la référence ²⁶ ) pour placer une femelle expérimentale dans une petite boîte à pétri (décrite à la section 4) à 15:00 heures (ZT 6) et lui donner 1 h pour s'acclimater dans l'arène d'accouplement.
2. Configurez la boîte expérimentale (décrite dans la section 1) comme suit:
   1. Allumez les lumières, c'est -à- dire les voyants lumineux blancs sur un cycle lumière-obscur de 12h: 12 h connecté à une minuterie qui allume leLa lumière à 09:00 (ZT0) et les LED de lumière rouge continue pour permettre la surveillance des mouches pendant la phase obscure de l'expérience. Allumez les ventilateurs pour limiter le chauffage de l'armoire par la source lumineuse et pour s'assurer que les odeurs excédentaires sont ventilées en dehors de la zone d'essai.
   2. Connectez les caméras webcam à un ordinateur et démarrez-les avec le logiciel de surveillance pour la surveillance de l'image.
   3. Pour chaque caméra, définissez la mise au point, la luminosité et le zoom dans le logiciel de surveillance.
      1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l'écran de la caméra, ouvrez "les propriétés de la caméra" et désactivez "mise au point automatique". Ajustez le "focus" pour clarifier la grille ou les mots écrits sur la feuille papier. Si nécessaire, modifiez la "luminosité" et "zoom".
   4. Réglez le programme du logiciel de surveillance pour capturer 1 image toutes les 2 min. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l'écran de chaque caméra et choisissez "Modifier la caméra", puis l'option "Actions". Cliquez pour lancer les actions "At int régulierErvals "et changer le temps à" 2 minutes. "Choisissez" Take Photo "pour certaines actions à effectuer et enfin cliquez sur" ok ".
   5. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l'écran de chaque caméra et sélectionnez "Démarrer la surveillance".
3. Après 1 h (à ZT 7), transférez un mâle de type sauvage sur la boîte de Petri à l'aide de la pipette à bouche, placez le plat sur les feuilles de papier A4 dans les caméras de la webcam et cliquez sur "commencer la surveillance" pendant 24 h. Pour l'expérience de la pompe à air, placez le plat de manière à ce qu'une sortie de pipette soit connectée au trou d'entrée de l'arène d'accouplement.
4. Pour analyser le comportement d'accouplement du couple, procédez comme suit.
   1. Sélectionnez et ouvrez toutes les images dans un logiciel de visualisation d'image et faites-les passer par ordre chronologique.
   2. Notez la date, le numéro d'expérience, le numéro de plat et l'heure de début dans une feuille de calcul dans la même rangée. Prenez l'heure de début de chaque arène à partir du moment où il est placé sous la webcaM caméra. Enregistrez l'horodatage des images.
   3. Marquez l'heure de début de chaque copulation dans la même ligne dans la feuille de calcul. Comptez un accouplement comme un incident lorsque le mâle a monté la femelle et le couple reste modérément stationnaire et dans la même posture pour au moins cinq cadres consécutifs (10 min).
      NOTE: Ce critère est basé sur la durée de copulation rapportée, allant de 12 à 27 min dans D. melanogaster , et l'observation que les copulations de 10 min et plus sont fertiles ^{27 , 28} .
   4. Comptez le nombre de copulations pour chaque ligne dans la feuille de calcul afin de déterminer la fréquence d'accouplement. Alternativement, soustraire l'heure de début de l'expérience à partir du moment de la première accouplement pour chaque rangée en tant que mesure de la latence d'accouplement, ou soustraire l'heure du premier accouplement à partir du moment du second accouplement comme mesure de la latence de remixage.
      1. Pour calculer la latence remixante, assurez-vous deDéfinissez les dates du premier et du deuxième accouplement en tant que jours consécutifs dans la feuille de calcul.
   5. Analysez les données avec des modèles d'effets mixtes, en supposant une distribution normale des données et incluant la date de l'expérience comme facteur aléatoire, en utilisant un logiciel statistique (voir la table des matériaux) pour déterminer la signification statistique des variables indépendantes-milieu alimentaire, Type d'air et interaction - comme décrit précédemment ⁵ .
   6. Sélectionnez le meilleur modèle d'explication en effectuant l'élimination en arrière des variables indépendantes non significatives en utilisant les tests de rapport log-vraisemblance et les informations Akaike associées. Après avoir exécuté le modèle, inspectez visuellement les résidus de données pour confirmer la normalité. Confirmer l'homogénéité des variances à l'aide du test de Levene. Dans le cas d'une homogénéité inégale, la racine carrée transforme les données.

L'utilisation de cet essai continu, le comportement d'accouplement et la fréquence d'accouplement en particulier peuvent être déterminés dans des conditions environnementales expérimentales. Pour contrôler les conditions environnementales, nous avons transformé une armoire de cuisine en acier inoxydable en une zone d'essai, avec sa propre source de lumière et sa diffusion, ce qui garantit une grande quantité de lumière et une quantité minimale d'éblouissement du sommet des arènes d'accouplement ( Figure 1A ) . La zone d'essai interne est entièrement encastrée en acier inoxydable et en verre, ce qui permet de nettoyer avec des solvants organiques tels que l'hexane ou l'éthanol. En outre, l'armoire est équipée de trous qui servent d'entrées pour les tubes, apportant des indices volatiles du système d'air sous pression (voir figures 1A et 1B ). Le système d'air sous pression, ajusté pour les odeurs de levure, se compose d'un flux d'air guidé à travers une culture de levure liquide avant d'entrer dans les arènes de test grâce à 4 séparateurs de pipettes avec10 sorties chacune ( Figure 1C ). L'ensemble du système est étanche à l'air et équipé de plusieurs filtres à particules, avant et après l'entrée de la culture de levure, afin de minimiser la contamination par des odeurs de confusion ( Figure 1B ).

Pour démontrer l'utilisation de ce dosage, nous avons testé si les indices volatiles d'une culture de levure peuvent influencer le comportement d'accouplement. L'air a été bouillonné à travers une culture de levure liquide pendant 24 h, et les points d'air ont été placés à l'entrée de chaque arène d'accouplement (voir la figure 2A ). La moitié des arènes d'accouplement contenaient des aliments pour voler avec de la levure (Food + levure), et l'autre moitié contenait des aliments pour voler sans addition de levure (levure alimentaire). Un homme et une femelle de type sauvage ont été exposés aux odeurs provenant de la culture de levure externe, et leur fréquence d'accouplement a été enregistrée. Pour déterminer quelles variables sont nécessaires pour expliquer les résultats enregistrés, nous avons utilisé des modèles à effets mixtes, y compris ou excluantLes variables indépendantes du milieu alimentaire, de l'air de levure et une interaction des deux. Les données de la figure 2B sont mieux représentées par un modèle comprenant les variables indépendantes du milieu alimentaire (p = 0,001) et de l'air de levure (p = 0,061), mais il n'y a pas d'effet d'interaction explicatif. Même si la variable de l'air de levure n'est pas significative dans cet ensemble complet de données, il est nécessaire d'expliquer les résultats. L'analyse de l'air de levure séparé pour le milieu alimentaire montre qu'un couple d'accouplement ne répond pas aux odeurs de levure lorsqu'il n'y a pas de levure présente dans le milieu alimentaire (air: p = 0.992), mais ils augmentent leur fréquence d'accouplement dans l'air de levure lorsque la levure est Également ajouté au milieu alimentaire (air: p = 0,018). Ensemble, ces résultats démontrent l'applicabilité du système d'air sous pression pour tester l'influence des odeurs environnementales en combinaison avec des conditions de milieu alimentaire.

Nous montrons également comment le système d'air sous pression peut être bypAssuré en ajoutant des indices chimiques environnementaux directement à l'arène de test. Pour démontrer quels composés de levure spécifiques affectent la fréquence d'accouplement, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle la teneur en acides aminés de la levure est nécessaire pour son effet sur l'accouplement en plaçant une dose de peptone (protéines hydrolysées) correspondant aux acides aminés fournis par la levure dans l'agar Substrat qui recouvre l'arène d'accouplement. Nous avons également testé la nécessité de l'acide acétique, l'un des principaux produits de fermentation volatils de la levure, pour augmenter la fréquence d'accouplement. Cela a été fait en ajoutant de l'acide acétique directement au milieu alimentaire. Un homme et une femelle de type sauvage ont été testés dans des arènes contenant de l'agar ou de l'agar avec de la peptone, avec ou sans acide acétique directement dans le milieu alimentaire ( figure 3B ). Cela permet un milieu alimentaire très simple et un environnement médiocre; Par conséquent, la fréquence d'accouplement moyenne est également diminuée par rapport à la figure 2B. Les données de la figure 3B sont mieux représentées par un modèle comprenant lesVariables indépendantes du milieu alimentaire (p = 0,002), de l'air acide acétique (p = 0,001) et de l'interaction des deux (p = 0,022). La réceptivité féminine augmente avec la présence d'acide acétique, mais seulement dans la condition où la peptone est présente dans le milieu. Cela montre que les mouches doivent détecter simultanément les acides aminés et l'acide acétique pour augmenter leur fréquence d'accouplement ( figure 3B ). Cela démontre que l'ajout de composés odorants directement à l'arène du test peut influencer le comportement d'accouplement et que ces influences peuvent être détectées dans des conditions environnementales très simples.

Figure 1: Diagramme de la boîte expérimentale et du système d'air sous pression avec levure. ( A ) Illustration schématique de la boîte d'accouplement contrôlée par l'environnement décrite dans la section 1. Description des nombres annotés et des flèches: 1. panneau lumineux avec al Ternation de lumières blanches et rouges; 2. petit ventilateur; 3. 3 couches de papier filtre, chaque couche comprenant deux feuilles de papier filtre; 4. plaque de diffusion en verre reposant sur des supports attachés à 3 côtés de la boîte; 5. grand fan; 6. trous pour tubes et câbles; 7. zone expérimentale; Grande flèche, 50 cm à la plaque de verre; Flèche centrale, 35 cm de hauteur pour les trous de câble; Et petite flèche, 7 cm de hauteur pour les trous de tubes. ( B ) Illustration schématique de la culture de levure liquide avec flux d'air, comme décrit dans les sections 5, 6.4 et 6.5. Description des numéros annotés: 1. unité de filtre jetable; 2. capuchon avec septum en silicone et sorties et entrées; 3. milieu liquide; Et 4. tube en verre avec fibre de verre. ( C ) Illustration schématique des sorties d'air comme décrit dans la section 6.7. Description des nombres annotés: 1. pipette sérologique; 2. Tuyaux coupés à partir d'une seringue de 1 mL et 3.000 μL de pointe de pipette.Target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: L'odeur de levure augmente la réceptivité féminine en présence de levure dans le substrat alimentaire. ( A ) Illustration schématique d'une arène d'accouplement avec un mâle et une femelle et une pointe de pipette de la sortie d'air de la figure 1C entrant par le trou d'entrée. ( B ) Présentation graphique de la réponse en fréquence d'accouplement d'un couple accouplement Canton-S à l'odeur de levure avec et sans levure dans le milieu alimentaire de la mouche (Aliments - levure: air moyen n = 12, levure air n = 13 et Aliments + levure : Air moyen n = 24, levure air n = 23). Graphique linéaire avec barres d'erreur SEM et sortie statistique des modèles à effets mixtes avec l'air comme variable indépendante et la date comme variable aléatoire pour chaque milieu alimentaire de manière indépendante. La statistique principaleLe modèle comprend les aliments (p = 0,001) et l'air de levure (p = 0,061). Adapté de la référence ⁵ . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: L'acide acétique dans le substrat de nourriture pour mouches augmente la réceptivité féminine en présence de peptone. ( A ) Illustration schématique d'une arène d'accouplement, avec un milieu alimentaire pour mouches contenant de l'acide acétique et un bouchon de paraffine en plastique fermant le trou d'entrée. ( B ) Une présentation graphique de la fréquence d'accouplement d'un couple d'accouplement Canton-S en réponse à l'acide acétique sur agar ou peptone (agar: -acide acide n = 52, + acide acétique n = 40 et peptone: -acide acide N = 28, + acide acétique n = 25). Graphique linéaire avec barres d'erreur SEM et le statiLa sortie optique du modèle d'effets mixtes avec un milieu alimentaire (p = 0,002), l'air acide acétique (p = 0,001) et l'air alimentaire * (p = 0,022) en tant que variables indépendantes et la date comme variable aléatoire. Adapté de la référence ⁵ . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Ce protocole décrit un dosage pour tester le comportement d'accouplement sur 24 h tout en contrôlant en permanence les indices environnementaux qu'un couple d'accouplement a l'hypothèse d'utiliser pour déterminer la fréquence d'accouplement. Il est possible d'augmenter la fréquence d'accouplement en réponse à l'air de levure délivré par un système d'air sous pression lorsque le milieu contient également de la levure ( figure 2B ). En outre, une réponse similaire en fréquence d'accouplement peut être observée avec un milieu alimentaire simplifié contenant uniquement de l'agar, de la peptone et de l'odeur d'acide acétique directement dans le milieu ( figure 3B )

Avec les expériences démontrées ici, les conclusions ne peuvent être tirées que du comportement d'accouplement général du couple puisque les deux sexes sont exposés aux mêmes conditions environnementales. Cependant, nous savons, dans des recherches antérieures, que 47% de la variation de la fréquence d'accouplement est déterminée par la femme, alors que la contribution masculine représente seulement 11% de la variation²⁰ . Par conséquent, la plupart des changements dans la fréquence d'accouplement observée sont probablement le résultat de la réceptivité sexuelle féminine. La nudité masculine accrue laisse encore la femelle d'accepter ou de rejeter l'accouplement, car les femelles D. melanogaster adultes peuvent détourner avec succès les tentatives d'accouplement ²⁹ . Pour des conclusions fermes et pour attribuer spécifiquement des différences dans la fréquence d'accouplement à la réceptivité sexuelle féminine, il est nécessaire de tester d'autres couples d'accouplement où le génotype de la femelle varie mais celui du mâle est maintenu constant.

Ce protocole a démontré deux façons de délivrer des composés odorants à un couple d'accouplement, soit avec un système d'air sous pression, soit directement dans le milieu alimentaire. Le système d'air sous pression présente l'avantage que tout effet peut être attribué aux composés qui sont transmis dans l'air, alors que cela ne peut être conclu lorsque les composés sont directement placés dans le milieu alimentaire. D'autre part, wSi l'on ne trouve aucun effet sur le système d'air sous pression, cela ne signifie pas automatiquement que le signal de signalisation n'affecte pas le comportement. Cela pourrait également signifier que le composé n'est pas efficacement livré dans le système d'air sous pression. La composition de l'air à la sortie du système de distribution d'air peut être analysée en plaçant un filtre hydrocarboné et en analysant la teneur en air piégé avec une chromatographie en phase gazeuse associée à une spectrométrie de masse. Le système d'air sous pression est un bon dosage pour tester des composés qui peuvent facilement être transportés dans l'air sur une plus longue portée. Des composés moins volatils peuvent être mis directement dans le milieu alimentaire. Un autre inconvénient du système d'air sous pression est l'effet de la vitesse de l'air sur le comportement de la mouche. Les mouches cessent de bouger lorsque la vitesse de l'air est trop élevée (au-dessus de 0,7-1,6 m / s) ³⁰ . En outre, le système d'air sous pression peut rendre un environnement simple et de mauvaise qualité intolérable en séchant le milieu alimentaire. Dans les deux cas, les mouches peuvent ne pas perdreOrm également bien, et aucune conclusion ne peut être attribuée aux composés spécifiques testés.

Plusieurs étapes sont essentielles lors de la préparation du bon fonctionnement de ces essais. La première étape qui nécessite une attention est la préparation du support. Il est important que le milieu, y compris les composés volatils odorants tels que l'acide acétique, soit préparé le jour de l'expérience et pas plus tôt pour éviter l'évaporation. En outre, le milieu doit durcir sur une surface sans circulation d'air supplémentaire (éviter d'utiliser des hottes pour cela), car le flux d'air peut stimuler l'évaporation de l'odeur. La deuxième étape qui nécessite un soin particulier est la mise en place du système d'air sous pression. Le flux d'air doit être suffisamment élevé pour faire exploser doucement la culture de levure sans transférer de liquide dans l'arène.

Ce protocole démontre un dosage comportemental avec des odeurs de levure en combinaison avec le comportement d'accouplement. Cependant, ce système peut être appliqué àType d'odeur, ainsi que d'autres types de comportements. Pour utiliser ce système pour d'autres odeurs, il est nécessaire d'ajuster le flux d'air et l'odeur pour optimiser le transfert des composés à la vaisselle. Cependant, en général, tout composé qui peut être transféré par voie aérienne peut être testé avec ce système. En outre, tout type de comportement, chez les mâles et les femelles, peut être testé, soit en utilisant le même type de vaisselle, soit en ajustant le tube pour atteindre et se connecter à des zones de test plus grandes ou plus petites. En outre, lorsque des comportements plus détaillés sont testés, les cadences et les résolutions des caméras utilisées doivent être reconsidérées. En tout cas, si les deux expériences avec et sans l'odeur de test sont exécutées en même temps et avec la même source d'air, toute réponse à la réponse environnementale peut être détectée, indépendamment des changements de pression ou de concentration d'une expérience à l'autre. Enfin, le dosage démontré ici peut être prolongé pour au moins un autre cycle LD (jusqu'à 48 h), tant que le fL'approvisionnement en eau ne se dessèche pas.

Les auteurs n'ont aucun intérêt concurrentiel à divulguer.

Nous remercions le Bloomington Drosophila Stock Center pour les stocks de mouches; C. Gahr, JT Alkema et S. van Hasselt pour leur tentative initiale de développer le dosage de l'air sous pression; Jasper Bosman pour les conseils sur la culture de la levure; Et Rezza Azanchi et Joel Levine pour l'origine du développement de la surveillance de la durée du comportement d'accouplement de Drosophila . JA Gorter a été soutenu par une bourse de programme d'études supérieures BCN / NWO de recherche en neurosciences. Ce travail a été soutenu en partie par l'organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (référence: 821.02.020) à JC Billeter.