Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Plasmodesmata (Pd) ağ geçitleri üzerinden bitki hücreleri arasında küçük ve büyük moleküllerin taşınmaktadır olarak işlev hücre hücre bağlantılardır. PD taşıma ile küçük moleküllerin, iyonlar ve su, pasif gerçekleşmesi için kabul edilir ise, biyolojik oluştururlar, böyle proteinler, hücre hücre aktarımı büyük olasılıkla belirli hedefleme sinyalleri içerir etkin bir mekanizma yoluyla oluşur molekül nakletti. Tanımlanan plasmodesmata (Pd) yerelleştirme sinyalleri (PLSs) kıtlığı ciddi protein sıralama anlayış kısıtladı yollar dahil bitki hücre hücre makromoleküllerin ulaşım ve iletişim. Bitki zenginliği endojen ve viral proteinler Pd, trafikten bilinen sadece üç PLSs bildirilmiştir bugüne kadar hepsi endojen bitki proteinleri. Böylece, gerekli ve Pd hedefleme, doğrudan yaşam için yeterli olan fonksiyonel bir PLS sırasını, tanımlamak için güvenilir ve sistematik deneysel bir strateji geliştirmek önemlidir bitki hücreleri. Burada, biz bir paradigma olarak Tütün mozaik virüsü (TMV) hücre hücre hareketi protein (MP) kullanarak böyle bir strateji tanımlarlar. Bu deneyler, tespit ve ilk karakterize viral PLS dikmek, en Pd hedeflenmiş proteinler serilerinde PLS keşfi için adapte edilebilir.

Plasmodesmata (Pd) anahtar düzenleyiciler bitki gelişme ve mRNA ve küçük RNA molekülleri transkripsiyon faktörleri kadar morfogenez, hücreler arası taşıma için kanalların görevi. Ayrıca, polis bu makromoleküllerin taşıma kapasitesi onların hücreler arası forma için çoğu bitki virüsler tarafından enfeksiyon sırasında kullanılmaktadır; PD taşımak için bitki virüs hareketi proteinler (MPs), özellikle Pd^1,2,3,4,5,6 için hedef olarak adlandırdığı özel proteinler geliştiğini ^{, 7}. Pd taşıma moleküler yollar büyük olasılıkla bu yolları taşınan proteinler hedef belirli serileri ile yakından bağlantılı. Böylece, bu Pd yerelleştirme sinyaller (PLSs) tanımlaması karşılık gelen Pd taşıma yolu tanı olabilir. Örneğin, farklı nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) dizileri^9,10için belirli olabilir farklı nükleer alma yolları için Pd taşıma⁸, kıyasen olacaktır. Kavramsal olarak, NLSs ve PLSs gerekli ve yeterli hedefleme için yarilabilir hücre altı hedefleme sıraları temsil eder. Ancak, NLSs¹¹farklı olarak, PLSs sıra vukuf ciddi sınırlıdır. Özellikle, sadece dört protein sequences Pd hedefleme dahil, hepsiyle endojen bitki proteinleri türetilmiş bildirilmiştir. İlki KN1¹² -iç hücre katmanlardan bitki yaprak¹³ epidermis için hamle bir transkripsiyon faktörü-ve onun KNOX homologs¹⁴homeobox etki alanı tarafından temsil edilir. İkincisi de bir transkripsiyon faktörü, hücreler arası (BT) ticareti olarak açıklanan bir sözde PLS içerir Dof motifi¹⁵uzaklıktadır. PDLP1 plasmodesmata yerleşik tip 1 membran protein üçüncü dizisidir ve bir transmembran etki alanı¹⁶tarafından temsil edilir. Son olarak, sıra hedefleme dördüncü Pd son zamanlarda glycosylphosphatidylinositol (GPI) rapor edilmiştir-bağlantılı protein ve glycosylphosphatidylinositol (GPI) değişiklik sinyali¹⁷tarafından temsil edilir.

İlginçtir, çok yakın zamana kadar hiçbir PLSs bildirilmiştir için viral MPs. Önceki çalışmalarda sözde PLS serilerinde bitki viral MPs^18,19ama hiçbir gerçek PLS Yani, gerekli ve yeterli Pd bir ilişkisiz kargo molekül () hedefleme için en az amino asit dizisi varlığı belirtilen örn., CFP) viral bir MP olduğu belirlendi. Henüz bu proteinler, Tütün mozaik virüsü (TMV), MP için hangi Pd Yerelleştirme ve taşıma gösterdiği²⁰olmuştur ilk biriydi.

Bu boşluğu adrese TMV MP PLS tanımlamak için deneysel bir stratejisi geliştirdi. Bu strateji üç kavramlar üzerine dayanıyordu. (i) biz PLS gerekli ve yeterli protein Pd²¹' e hedefleme için en az amino asit dizisi olarak tanımlanır. (ii) çünkü TMV MP Öncelikle Pd hedefleyen ve bu kanalları²²translocates, biz bu iki etkinlikler uncoupling ve iyi niyetli PLS, hangi görev sonraki taşıma için değil de yalnızca Pd hedefleme için tanımlama amaçlı. (iii) biz etkinlik, yapısal veya fonksiyonel olarak hedefleme onun Pd amino asit kalıntıları eklenmesi önemli için tanımlanan PLS analiz edildi. Bu yaklaşımı kullanarak, bir 50-amino asit kalıntı sıra amino-terminus iyi niyetli PLS davranır TMV MP, belirlendi. Bu protein tüm uzunluğu doymuş TMV MP parçaları bir dizi üreten, onların karboksil termini CFP ile etiketleme ve geçici onları bitki dokularda ifade tarafından yapıldı. PD yerelleştirme her test parçaları bir Pd marker protein, PDCB1 (Pd callose bağlayıcı protein 1)²³coexpressing tarafından tespit edilmiştir. PLS temsil etmek için hala merkeze lokalize ama polisi, dizinlere değil en küçük parçası olarak kabul edildi. Son olarak, PLS alanin onun yapısı ve/veya işlev için gerekli anahtar amino asit kalıntıları belirlemek için taranan.

Oysa burada TMV MP PLS tanımlaması açıklayarak bu yaklaşım göstermek, o herhangi bir diğer Pd hedeflenmiş proteinler arasında PLSs keşfetmek için bitki patojenleri veya bitkiler kendileri ile kodlanmış olup olmadığını istihdam edilebilir; Bunun nedeni bizim yöntem viral MPs onların yetenek-e doğru hedef açısından herhangi bir benzersiz özelliklerinin avantajlarından merkeze almaz.

1. bitki materyali

1. Bitki türlerinin seçimi
2. Faiz, Yani, hangi endojen proteinler için bu protein kodlar ya da patojen viral proteinler için doğal konağını temsil eden bir protein için yerli bitki türü kullanın. Buna ek olarak, seçilen bitki türleri için geçici genetik dönüşüm yöntemi seçilen mükellef olması gerekir.
   Not: Çalışmalar düzenli olarak TMV için iyi bir ev sahibi gösteren ve verimli bir şekilde genetik dönüşümü Agrobacterium aracılı tekniği, Yani, agroinfiltration tarafından dönüştürülür Nicotiana benthamiana, istihdam (bkz. Adım 3). İ. benthamiana bitkiler de kolayca yetişir ve kolayca Agrobacterium tarafından aşılamaya ve kolayca confocal mikroskobu tarafından analiz büyük yaprakları vardır.
3. Bitki büyüme
   1. İ. benthamiana tohumları yüksek yoğunluklu, ıslak toprak bitki. 20-25 ˚C altında 16 h ~ 75 µmol fotonlar m^-2 s^-1 , ışık ve karanlığın 8 h kontrollü ortam odasında kalsın. Euphyll çapı 0.5 cm ulaştıktan sonra dikkatle için daha büyük tencere fide aktarmak ve büyüme aynı koşullar altında aynı odasında devam etmek.
   2. Onlar ne zaman en büyük 4-6 cm çapında yapraklar 4 hafta içinde 4-8-yaprak Sahne Alanı'na büyümek kadar bitkiler korumak; Şu anda, onlar agroinfiltration için kullanılabilir (bkz. Adım 3).
      Not: gelişimsel bu aşamada yaprak mimari kez^24,25bazen tutarsız sonuçlar için önde gelen, değişir çünkü çiçek başladılar da önemlisi, hiçbir zaman bitkiler kullanın.

2. ifade vektör İnşaat

1. İfade sistem seçimi
   1. En iyi maiyet-protein okudu bitki türleri ilgi ifade ifade sistemi, Yani, vektörel çizimler ve vektör Teslimat yöntemi, seçin.
      Not: Bazen, böyle belirli kombinasyonları test protein/bitki türlerinin gerektiren belirli vektörel çizimler ve Teslimat yöntemi en iyi ifade ve faiz protein fonksiyonu için vektör. En çenekli bitkiler için ikili plazmid olarak ifade vektörel çizimler ve dağıtım sistemi olarak agroinfiltration ancak, seçin.
2. Protein flüoresan etiketleme
   1. Fluorescently Pd yerelleştirme dahil olmak üzere onun hücre altı dağıtım²², analiz için ifade her protein etiketleyin.
      Not: autofluorescent proteinleri CFP ve DsRed2, gibi Etiketler istihdam. CFP ile test edilmiş protein etiketli ve ücretsiz bir DsRed2 ile coexpress. CFP işlevleri hem etiketi hem bir virüs ilgisi olmayan kargo molekül olarak. DsRed2 işlevleri geçici ifade genel verimliliğini kalibre ve hücre-başlangıçta dönüştürülmüş hücre; tanımlamak için özerk, çünkü Bu ikinci işlev potansiyel olarak olmayan-cep-özerk test edilmiş proteinlerin hücre hücre hareketi değerlendirirken önemlidir. Aynı zamanda hücre özerk, PDCB1, Pd marker ile coexpression için test edilmiş protein CFP ve DsRed2 ile PDCB1 ile etiketleyin.
   2. Kural olarak autofluorescent etiketi ifade protein karboksil terminus için sigorta. Ancak, Pd hedefleme öğesini tam uzunlukta test protein sergiler tehlikeye etiketi amino-terminus için protein aktarın.
   3. Uygun bitki ifade vektör test edilecek proteinlerin kodlama dizileri klon.
      Not: Sitemizde floresan etiketleme sağlayan birçok farklı bitki ifade vektörel çizimler. PSAT plazmid²⁶ bir dizi veya bir bölümü, çerçeve ile (bkz. Adım 2.2.1) önerilen autofluorescent Etiketler amino hem de doğrudan ilgi dizi klonlama için uygun olan onların türevleri^27,28, kullandığımız- ve karboksil-terminal yönler.
   4. Her ifade kaset Agrobacterium ikili vektör aktarın.
      Not: pSAT tabanlı yapıları bitki doku, agroinfiltration, içine doğrudan biolistic teslimat için uygun olmakla birlikte burada (bkz. Adım 3), önerilen dönüşüm yöntemi olan gerektirir T-DNA arasında bulunan olmasını ifade kaset ²⁹kenarlıklarının rengini bir ikili vektör.
      Not: Tüm pSAT vektörel çizimler devrin pPZP RCS2 multigene ifade ikili vektör^26,30 bir tek adım kullanarak nadir kesme nükleaz AscI, -PpoI, -SCEI, CeuI, klonlama tarafından izin vermek için tasarlanmıştır PI-PspI ve PI-TliI ²⁶. Contegra lox siteleri³¹, kullanarak recombinatorial klonlama, kullanmak için tercih eden araştırmacılar örneğin, pSAT vektör türevleri^26,27istihdam.
   5. Coexpression, her iki ifade kaset transferi, örneğin, test protein-CFP ve DsRed2 veya test protein-CFP ve PDCB1-DsRed2 (bkz: adım 2.1), aynı pPZP-RCS2 ikili vektör için.
      Not: Alternatif olarak, bireysel ikili yapılarını barındıran Agrobacterium kültürlerin birlikte infiltrasyon i. benthamiana içine için karışık olabilir (bkz. Adım 3.1).

3. Agroinfiltration

1. PPZP-RCS2-esaslı plazmid 1 µg adım 2.2.5-100 µL kültür Agrobacterium tumefaciens yük EHA105 veya GV3101 açıklanan³²hazırlanan yetkili hücre eklemek, 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya, 1 dk, sıvı azot flaş-donma ve 15 dakika 28 ° C'de kuluçkaya.
   1. Sonra 1 mL LB orta (10 g/L tryptone, 5 g/L Maya özü ve 10 g/M NaCl) yetkili hücre karışıma ekleyin ve 28 ° c 2 h Spin 3000 × g 1 dk. için hücreleri aşağı için kuluçkaya, onları yeniden 0.2 mL LB askıya alma ve onları LB agar (örneğin, 100 mg/L Spektinomisin ve 50 mg/L Rifampisin pPZP-RSC2-esaslı vektörel çizimler^26,30için) uygun antibiyotiklerle birlikte üzerinde plakası. Bireysel kolonileri görünür hale gelene kadar 48 h 28 ° C'de büyümek.
2. Almak ve bir taze LB agar plaka üzerine bireysel sömürgeler plakası (bkz. Adım 3.1), 48 h 28 ° C'de büyümek ve belirli ikili yapıları varlığını doğrulamak için koloni PCR³³ tarafından bakteri analiz için küçük bir miktar almak.
3. Her Agrobacterium koloni gecede 28 ° C'de ilgi 5 mL LB orta (bkz. Adım 3.1.1) uygun antibiyotiklerle birlikte yapı ile büyümek. 3000 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve onları yeniden OD₆₀₀için askıya agroinfiltration arabellek (10 mM MgCl₂, 10 mM MES (pH 5.6), 150 µM acetosyringone) 0.5 =. Oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
   1. Bir tek multigene ifade plazmid yerine ikili plazmid karışımı protein coexpression için kullanılıyorsa, infiltrasyon önce 1:1 v/v oranında karşılık gelen hücre kültürleri karıştırın. Sonra hücreleri 28 ° c 2 h için kuluçkaya.
4. İnoculum 1 mL plastik şırınga ve basın karşı tam olgun i. benthamiana alt (abaxial) epidermis şırınga (iğne) meme yaprakları yükleyin. Eldivenli bir parmak ile yaprak adaxial yüz^34,35üzerinde tutun.
   1. Agrobacterium infiltrasyon ortamda yavaş iğne ile tanıtmak. İstatistiksel anlamlılık için birkaç her bitki yapraklarda sızmak.
      : Not tutarlı ifade düzeyleri verir gibi en eski yaprakları kullanılır.
   2. Bütün yaprakları içinde in situaşılamak. İnfiltre bitki gözlem kadar adım 1.2 ile açıklandığı gibi korumak.

4. confocal mikroskobu

1. Her yaprak damarları arasında parçalara kesmek için bir bıçak kullanın 24-48 h sonra infiltrasyon (bağlı olarak geçici ifade belirli test protein verimlilik); Öyle ki dilim kapak mikroskopi için kullanılan cam (22 mm x 40 mm) tarafından tamamen kapsadığı her doku dilimin boyutu olmalıdır.
2. Nesne üzerinde yaprak dilimleri, karşı karşıya abaxial yaprak yüzeyi ile slayt yer yaprak dilim üzerinde bir damla su koyun ve cam ile kapsar. Küçük parçalar halinde her tarafında kaset ile kapak cam hareketsiz.
3. Bir lazer confocal mikroskobu tarama altındaki agroinfiltrated dokuları gözlemlemek ve elde edilen görüntüleri.
   1. İlk olarak, 10 X objektif lens hücreleri sinyal ile tanımlamak için kullanın ve 63 x objektif lens daha detaylı gözlemler için kullanın.
   2. Kullanım 458 nm dalga boyları üzerinden CFP ve 543 heyecanlandırmak için bir argon iyon lazer DsRed2 heyecanlandırmak için nm. Resim alma, Yani, lazer yoğunluğu ve deneyler arasında photomultiplier tüp (PMT) ayarları için tüm ayarlarını korur. Ortalama olarak, 100-120 hücreleri deneysel her koşul için inceleyin.

5. tanımlaması PLS

1. Yerelleştirme confocal mikroskop (Bölüm 4) kullanarak test protein teşhis. Test protein karakteristik periferik punctate desen^{25,36,37,38,39,40,41} vardır ve colocalizes kontrol edin Pd işaretçisiyle PDCB1²³. Bu test protein olasılıkla PLS dizileri içerdiğini gösterir.
2. Sonra onun açık okuma çerçevesi (ORF) (genbank katılım numarası BAF93925.1) giderek daha alt bölümlere ayırma test protein, PLS aktivitesinin onay daha küçük parçaları, autofluorescently, (örneğin, CFP,) her biri etiket ve analiz onların 4. adımda açıklandığı gibi hücre altı yerelleştirme. Başlangıçta, boyutu 100 amino asit kalıntıları eklenmesi Kentler her parça için önerilir.
3. Daha fazla PLS etkinlik ve hala merkeze yerelleştirir en küçük parçası kadar adım 4'te açıklandığı gibi onların hücre altı yerelleştirme kontrol kesilmiş parçaları alt bölümlere ayırma, Yani autofluorescent etiket kargo taşımacılığı için yeterli PD için tanımlanır. Bu parçada PLS sırasını göstermek için olduğu tahmin edilmektedir.
4. Sözde PLS tam uzunlukta test protein, Yani sigorta sözde PLS olmadan test proteinin kalan kısmını autofluorescent etiketi silin ve ortaya çıkan mutant proteinin hücre altı yerelleştirme adımda anlatıldığı gibi belirlemek 4. sözde PLS yoksun bu mutant proteinin merkeze yerelleştirmek başarısız olursa, bu tespit PLS sadece yeterli (bkz. Adım 5.3), ama aynı zamanda test protein Pd taşıtlar için gerekli olmadığını belirtir.
5. Agroinfiltrate (bkz. Adım 3.3) CFP öğesini PLS ve ücretsiz DsRed2 için yaprakları ifade yataklık Agrobacterium kültürlerin karışımı ile inşa. 10 adım 4,3 olduğu gibi aynı ayarları kullanarak x objektif lens ile confocal mikroskop kullanarak infiltre doku gözlemlemek.
6. Başlangıçta infiltre hücreler olarak CFP ve DsRed2 sinyalleri içerir ve bu sinyalin CFP içeren bitişik hücreleri bu sergi hareketin skor hücreleri puan.
   Not: Bu adımı potansiyel hücre hücre hareket kabiliyetini için tanımlanan PLS inceler; Pd (dahil olmak üzere çoğu viral MPs bitki) hedef birçok protein taşımak da Pd ile komşu hücrelere olmasıdır. İnfiltrasyon için kullanılan Agrobacterium konsantrasyonu sırasıyla farklı yapıları ifade verimliliği üzerinde bağlıdır. Agroinfiltration için (i) tek hücre, bitişik hücreleri dönüştürülmemiş bırakarak dönüştürme sağlar, (ii) ifade benzer verimliliği elde hücre kültür seyreltme kullandığınızdan emin olun. Örneğin, bizim deneyler OD₆₀₀ 0,01 ve 0.005 CFP öğesini PLS ve ücretsiz DsRed2, ifade için sırasıyla kullanmaktadır.

6. anahtar PLS⁴² alanin tarama kullanarak artıkları tanımlaması

1. Sıra astar istenen mutasyon, Yani, ikame alanin, her astar Merkezi bölgenin etrafında ile hedef amino asit kalıntısı açıklandığı gibi içerecek şekilde tasarlanmış bir çift istihdam kodlama PLS ^{yükseltmek için standart PCR iletişim kurallarını kullanır 21}. Astar tasarım ve kullanım sitesi yönetmen mutagenesis kit site yönettiği mutagenesis üretici yönergelerine göre için yürütmek.
2. Herhangi bir standart DNA arıtma kiti kullanılarak elde edilen PCR ürünleri arındırmak ve ebeveyn ortadan kaldırmak için DpnI ile 37 ° C'de sindirir (Yani, mutasyona uğramış olmayan) metillenmiş ve hemimethylated DNA'sı. Bu (değil on Ice) oda sıcaklığında 5 min için sakin olun. Daha sonra karışımı doğrudan E. coli yetkili hücreleri⁴³dönüştürmek ve koloniler istenen mutant yapıları ile adım 3.2 açıklandığı gibi tanımlar.
3. 2.2.4. adımda açıklandığı gibi ikili vektör mutant yapıları tanıtmak, adım 3'te açıklandığı gibi agroinfiltration yapmak ve adımları 4 ve 5. 1 açıklandığı gibi Pd hedefleme değerlendirmek.

Sadakatle açıklanan kurallarından beklenen sonuçlar göstermek ve TMV MP PLS tanımlamak, temsilcisi verileri Yuan ve ark. adapte olmuşlardır ²¹. şekil 1A ilk özetleyen önemli yapılar tam uzunlukta TMV MP (1-268), TMV MP PLS (oluşan ilk 50 amino asit kalıntıları protein 1-50), ifade ve onun alanin V4A türevleri tarama erimiş (olarak üretilen CFP için açıklanan adımları 2.2, 5.2 ve 6) şekil 1B özetleyen ve etiketli bu proteinler hücre altı lokalizasyonu quantifies oysa. Şekil 1 c TMV MP-CFP için ve için TMV MP PLS-CFP de coexpressed Pd işaretçiyi gelince, PDCB1-DsRed2 gözlenen karakteristik periferik punctate Pd yerelleştirme desen gösterir (bkz. Adım 5.1). Şekil 2A gösterir Pd TMV MP-CFP ve coexpressed ücretsiz DeRed2 TMV MP PLS-CFP ve nucleocytoplasmic dağıtımı için hedefleme (bkz. Adım 5.1). Son olarak, şekil 2B hem TMV MP ve TMV MP bu kalıntı PLS yapısı ve fonksiyonu için önemli olduğunu belirten PLS ile bir tek alanin ikame V4A, Pd hedefleme kaybı gösterir; aynı PDCB1 hala yerelleştirir merkeze coexpressed Pd marker hücreleri (bkz. Adım 6).

Bu kavramsal olarak ve teknik olarak basit bir prosedür protein parçaları, bir autofluorescent işaret-kargo protein füzyon ve yetenek merkeze yerelleştirmek test sistematik üretiminin en az protein sıra tanımlayabilirsiniz bu veri göster gerekli ve Pd hedefleme, Yani, PLS için yeterli. Bu yerelleştirme veriler doğru yorumlanması için bilinen bir Pd protein, örneğin, PDLP veya PDCB aile üyeleri^16,23 veya bir bitki ile colocalization deneyler gerçekleştirmek için önemlidir Pd^{44 sıralamak viral MPs} . Belli ki, colocalization gibi tüm P yerelleştirme proteinler aynı merkeze hedefleyebilir, ancak en az bir Pd marker proteinlerin colocalization istatistiksel olarak anlamlı bir ölçüde PLS etkinliği tanımlamak için gerekli olan tam, olmak zorunda değil.

Şekil 1: TMV MP kimliği PLS. (A)Özeti TMV MP PLS. TMV MP dizileri, yeşil kutuları tanımlamak için kullanılan ana CFP-fusion oluşturur; CFP, mavi kutu; P, organizatörü; T, Sonlandırıcı. Soldaki sayıları her TMV MP parçasının içinde yer amino asit kalıntıları olduğunu gösterir. (B) (A) gösterilen füzyon proteinlerin hücre altı yerelleştirme özetini. PD yerelleştirme veya nucleocytoplasmic yerelleştirme karşılık gelen hücre altı işaretleri, PDCB1-DsRed2 ve ücretsiz DsRed2, yerelleştirme sırasıyla göre tespit edilmiştir. Her yerelleştirme desen sergilenmesi hücre yüzdesi yapı üç bağımsız deneylerde başına 100 ifade hücre puanlama üzerinde gösterilir. Ortalama ± standart hataları (SE) verilerdir. (C) Pd TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP ve Pd marker PDCB1-DsRed2 hedefleme. CFP sinyal mavidir; DsRed2 sinyal mor olduğunu; Plastit autofluorescence filtre. Tek confocal bölümleri görüntülerdir. Ölçek çubukları 10 µm. DIC, fark girişim kontrast test =. Bu rakam Yuan ve ark. adapte ²¹. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: TMV MP, TMV MP PLS ve onların alanin tarama mutantlar Pd hedefleme. (A)hücre altı yerelleştirme TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP ve nucleocytoplasmic işaret DsRed2. (B) kaybı, yetenek V4A alanin tarama mutant TMV MP-CFP ve TMV MP PLS-CFP hedefleme Pd. PD Pd işaret PDCB1-DsRed2 coexpression tarafından görüntülenmiştir. CFP sinyal mavidir; DsRed2 sinyal mor olduğunu; Plastit autofluorescence filtre. Tek confocal bölümleri görüntülerdir. Ölçek çubukları 10 µm. DIC, fark girişim kontrast test =. Bu rakam Yuan ve ark. adapte ²¹. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu iletişim kuralının dört çekirdek bileşenlerinin vardır: gerekli ve yeterli test eritme merkeze sistematik lige uzunluğu, giderek azalır parçaları ilgi proteinin hedefleme için bir dizi tanımlama kavramı Hem etiketi hem makromoleküllerin kargo ve Pd yaşayan hedefleme için fonksiyonel tahlil olarak hizmet veren bir autofluorescent protein parçaları test füzyon proteinlerin geçici ifade aşağıdaki dokular bitki. Not geçici ifade Agrobacterium aracılı zaman, Yani, birkaç gün, sık sık benzer çalışmalar¹⁵dakika içinde kullanılan transgenik bitkilerin üretimi için gerekli ay ile karşılaştırıldığında göreceli olarak kısa bir süre içinde veri oluşturur.

Coexpression protein hücre altı yerelleştirme işaretçileri olan ilgi, örneğin, PDCB1 veya ücretsiz DsRed2, genellikle bir multigene ifade vektör gerçekleştirilir. Tek bir vektör içine birkaç ifade kaset transferi teknik olarak sorunlu ise, ancak, coexpression da her kaset ayrı bir ikili yapı aktarılması ve eşdeğer miktarda sıvı kültürleri birleştirerek gerçekleştirilebilir agroinfiltration için elde edilen Agrobacterium suşları. Bu protokolü geçici ifade kullanır çünkü varlıklarını ifade verimliliği için zararlı olmasa da ikili vektör seçim işaretleri istikrarlı dönüşüm, taşımak.

Bu protein ifade için optimize edilmiş ve i. benthamianahedefleme protokoldür; Ancak, Arabidopsis^45,46, mükellef tarafından Agrobacterium genetik dönüşümü için de dahil olmak üzere diğer bitki türlerinde kullanılabilir. Diğer bitki türü için veya aksi takdirde istenirse, bu iletişim kuralını biolistic teslim⁴¹ ifade kaset için ikili vektörel çizimler aktarmak için ihtiyaç kaçınarak doğrudan pSAT tabanlı vektörel çizimler, geçici ifade için kullanmak için adapte edilebilir.

Kritik nokta bu protokolündeki bitki materyali tutarlı fizyolojik ve gelişimsel durumdur. Özellikle, tüm bitkiler tüm deney boyunca sağlıklı olması gerekir, ve, agroinfiltration için i. benthamiana bitkiler 4-hafta değerinden küçük olması gerekir eski ve 4-6 cm çapında olmak en büyük yaprak ile 4-8-yaprak aşamada. Eğer bitkiler çok genç, agroinfiltration etkileri çok ağır, ifade yerelleştirme tagged proteinlerin çalışmasına mani olacak. Öte yandan, büyük bitkiler kez Pd^24,25Pd hedefleme desenleri tutarlılığını da etkileyen, değişken mimari sergi.

Yine de, fizyolojik şartlarda bitki bir bütün olarak ve onun dönüştürülmüş hücrelerin özellikle değişen nedeniyle, Pd her deneyde hedefleme verimliliğini biraz farklı olabilir. Böylece, hücreleri nispeten çok sayıda analiz etmek önemlidir (> 100) deney, başına ve her denemenin en az üç biyolojik çoğaltır gerçekleştirin. Genellikle, en az % 70 Pd yerelleştirme dönüştürülmüş hücrelerin sergiler, etkinlik, hedefleme Pd içermesi için test edilmiş bir parça göz önünde bulundurun. Her parça, örneğin, yüzde Pd özgü punctate birikimi desen gösterilen dönüştürülmüş hücrelerin verimliliğini hedefleyen Pd farklılıkları Öğrenci t-Testi ve p-değerleri tarafından analiz < 0,05-0,01, karşılık gelen istatistiksel olasılık % 95-99 daha fazla.

Füzyon molekül floresan etiket/kargo konumunu başka bir önemli konudur. Bazı Pd hedeflenmiş proteinler de endoplazmik retikulum (ER) ile ilişkilendirmek ve bu Derneği engelsiz amino-terminal sıra gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, karboksil-terminus ilgi protein parçasının amino-terminus için floresan etiketinin eritilmiş olan amino-terminal füzyon, örneğin, CFP veya DsRed2, kullanılmalıdır. Bu varsayılan yerleşim etiketinin aşağıdaki durumlarda değiştirilebilir. (i) Eğer amino-terminal füzyon kullanılamadığına – Yani, onlar yapmak değil anlamlı hücre altı yerelleştirme Desen Sergisi, kötü ifade edilir veya floresan sinyal için güvenilir algılama – yeterli oluşturmaz ve eğer protein ilgi yok amino-terminal sinyal dizileri veya karboksil-terminal füzyon amino-terminus test parçasının etiketi karboksil-terminus eritilmiş olan içermemesi, onlar denenmesi gerektiğini. (ii) sinyal dizileri, karboksil terminus adlı protein ilgi içeriyorsa, karboksil-terminal füzyon de kullanılmalıdır. (III) faiz protein GPI bağlantılı proteinler arasında bulunanlar gibi her iki amino - ve karboksil-terminal sinyali veya bir amino-terminal sinyal peptid içeriyorsa, henüz onun amino-terminal füzyon kullanılamaz varsa, etiketin dahili olarak, yer almalıdır) ya aşağı amino-terminal sinyal veya karboksil-terminal sinyal ters yönde). Bizim daha önceki yayınları^47,48yılında iç floresan proteinlerin etiketleme için yararlı bazı yordamlar açıklanmıştır.

Şu anda, hiçbir bilinen fikir birliği sıra PLS için vardır. Bu nedenle (Adım 5.2), başlangıçta protein bitişik ~100-200 kalıntı uzunluğundaki parçaları ayırmaktan tavsiye ediyoruz. Bunlar daha sonra giderek daha kısa yapılabilir gözlenen Pd hedefleme aktivite veya bunların eksikliği dayalı. Bir diğer potansiyel sinyalleri (örneğin, NLS, sinyal peptidler, vb) protein mevcut hedefleme dikkatli olmalıdır. Ancak, böyle dizileri PLS serileri ile potansiyel çakışma bilinmeyen olduğu gibi bu protein bölgeler mutational bu çözümlemeye dahil edilmelidir.

Şimdiye kadar bu iletişim kuralı bir protein molekülü²¹içinde tek bir PLS tanımlamak için kullanıldı. Büyük olasılıkla, ancak, bir protein birden fazla sinyal sıra içerebilir; birden çok NLSs gerçekten de GATA transkripsiyon faktörleri⁴⁹da dahil olmak üzere birçok nükleer protein nitelendirdiler. Böylece, farklı parçaları test protein hedefleme Pd için analiz ederken, birden böyle parçası, bağımsız olarak ya da sinerjik hareket birden fazla PLSs varlığını gösteren belirtilir ki mümkündür.

Ana bu protokolü geçici agroinfiltration, görsel olarak hücre altı yerelleştirme aşağıdaki ilgi ifade proteinlerin en iyi elde edilir epidermal hücrelerin ve nispeten dar büyüme aşamasında, kısıtlamasıdır. Gerektiğinde, bu sınırlama stabil her onların doku ve hücre tiplerinin çoğunda test edilmiş proteinlerin hızlı transgenik bitkiler üreterek üstesinden gelebilir. Ayrıca, bu iletişim kuralını viral MPs veya geçici genetik dönüşümü için mükellef değildir bitki türlerinde işlev diğer Pd hedeflenmiş proteinler çalışmaları için yararlı olmaz.

Bu teknik bir PLS TMV MP tanımlanması için geliştirdiğimiz iken, PLSs keşif herhangi bir diğer bitki için viral MPs veya merkeze, geçici veya kalıcı olarak yerelleştirmek bitki endojen proteinlerde kullanılabilir. Ayrıca, uygun hücre altı yerelleştirme işaretleri⁴⁷ile birlikte, bu protokol proteinler tesislerinde ilgi içinde birçok hedefleme sinyalleri tanımlanması için uygundur.

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Yeterli yer olmaması, çoğunlukla gözden makaleler gösterdi ve meslektaşlarımıza orijinal eserleri değil gösterildi özür dileriz. V.C. laboratuvar çalışmalarında V.C. NIH, NSF, USDA/NIFA, Ozan ve BSF hibe tarafından desteklenmektedir ve S.G.L. laboratuvar NIH ve bitki patoloji bölümleri ve bitki-mikrop Biyoloji fonlarından için S.G.L. tarafından desteklenmektedir