Montaj ve 'Kayma Rings' Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

uyarlanabilir yanı sıra endotel fenotip ve gen ifadesinde patolojik değişiklikleri uyararak normal seviyelerde ve vasküler fizyoloji ve patofizyoloji vasküler sıvı kayma oyun önemli rol modellerinden sapmalar. Özel olarak, periyodik olarak, tek yönlü akış kaynaklı kesme geriliminin uyumsuz etkileri birçok vasküler hücre tiplerinin, özellikle de endotel hücreler üzerindeki etkileri, çeşitli tetikleyebilir. Artık farklı anatomik kökenlerden gelen endotel hücreleri kültüre edilmiş ise, derinlemesine sıvı kesme onların tepkileri kesme modelleri göreli karmaşıklığı nedeniyle sekteye edilmiş analizleri (örneğin, paralel plaka akış odası, koni ve plaka akış modeli). bunların hepsi mükemmel yaklaşımları temsil ederken, bu tür modeller bot zorluklar yaratarak, teknik olarak karmaşık ve nispeten uzun ve karmaşık kurulum süresi, düşük yüzey alanları, genellikle sızdırmazlık ve conta gerektiren pompa ve basınçlandırma için gereklilikler dahil sakıncaları muzdaripsterilite ve birden fazla deneyler çalıştırmak için bir yetersizlik h bakımı. akış ve kesme yüksek verim modelleri vasküler endotelyal kayma tepkileri daha büyük bir ilerleme, kullanılabilir, ancak, moleküler seviyede, özellikle periyodik kesme araştırma, daha hızlı bir şekilde gelişmiş olabilir. kolayca tek yönlü, periyodik kayma gerilmesi çalışmalarında deneysel çoğaltır sayısının yüksek sağlayan nispeten geniş bir yüzey alanına sahip bir roman, basit-için bir araya, ve ucuz doku kültürü modeli: Burada, inşaat ve kullanım kayma halkaları tarif endotel hücreleri.

Cis-düzenleyici elemanlar ⁶ aktivasyonu, histon asetiltransferaz aktivitesi ⁷ ve kesilme baskısı tepki elemanları (SSRE) Şekiller ⁵ ila ^{8 -} Sıvı kesme stresi endotel gen Programlar ¹ modüle ettiği gösterilmiştir. Doku faktörü ⁹ ve doku plazminojen aktivatörü (tPA) ¹⁰ ifadesini modüle ederek stres etkilere koagülasyon doğru endotel katkıları Kayma. Kayma gerilmesi de PDGF-B sentezini ve yanıt ⁸ düzenleyerek anjiyogenez ¹¹ ve damar yeniden kontrolünü etkiler. Endotel, endotelin-1, Ürotensin II ve relaxin da makaslama ¹² ile vazoaktif mediyatörler Adrenomedullin düzenlenir türetilmiş. Endotelyal nitrik oksit sentaz üretimi ve nitrik oksit üretimi transkripsiyonu hem kesme bağımlı ¹⁰ vardır. Kayma endotel ICAM-1 ifadesini ¹³ kontrol eder. Bu nedenle powerfu olabilir Akış kaynaklı kayma gerilmesilly endotelyal yanıtları çok çeşitli etkiler. Önemlisi, vasküler titreşimler şimdi de vasküler demans ¹⁴ hem normal vasküler yaşlanmanın ve formların patofizyolojisinde önemli rol oynuyor gibi görünmektedir ve hatta multipl skleroz ¹⁵ gibi diğer nörodejeneratif hastalıklar, katkıda bulunabilir.

Venöz ve arteriyel endotel hücreleri doğal olarak in vivo çeşitli hemodinamik akış modelleri maruz ve birçok farklı endotel hücre fenotipleri ¹⁶ sergilenebilir. Büyüklüğü ve akış periyodu bağlı olarak, endotel hücreleri üzerindeki etkileri, gen veya protein ekspresyonu ^17,18 değişiklikleri yansıtır enflamatuar hücre aktivasyon ve apoptoz içerebilir. Endotel hücre yanıtlarının ilgili çalışmalar yeterli gibi kesme kalıpları üretmek in vitro modellerinin üretiminde bu nedenle zorluklar ile komplike kalır olayları kayma.

Birçok farklı experimental protokoller, hücre mono tabakaları endotel sıvı kayma gerilimi uygulama geliştirilmiştir. ^{21 -} En sık kullanılan sistemlerden biridir odasının ¹⁹ içinde üniforma laminer akış oluşturur paralel plaka akış odası vardır. Bir peristaltik pompa tipik olarak in vivo ²² birçok yerlerde bulunan akış karakteristiklerini özetlemek olabilir periyodik akışı oluşturmak için bağlanır. Başka bir ortak kurulum sıvı kayma gerilmesi koni ²³ dönme hızı ile belirlenir 'koni ve plaka' modeli kullanır. Onlara benzer Her iki sistem de, ve diğer düzenlemeler, kurmak ve birçok laboratuvar nispeten pahalı ve ulaşılmaz olabilir bileşenleri gerektiren sıkıcı olabilir.

Bu mevcut model bir diğer önemli bir sınırlama aynı zamanda nispeten düşük bir yüzey alanı olan, her biri gerçekleştirilebilir tekrarlanan çalışmalar nispeten düşük bir sayıdır. Bu zaman ve co artırır Bu tür yaklaşımların mplexity. Bu nedenle, tek yönlü ve periyodik kesme indükleyen ideal bir model nispeten geniş bir yüzey alanına sahip bir çalışma tekrardan yüksek sayıda kolayca ayarlanabilir bir, her olabilir. Bunun yanında söz konusu modellerin birçok kullanıcı için maliyet-engelleyici olabilir oldukça sofistike bir kurulum gerektirir. Temel laboratuvar malzemeleri kullanarak sıvı kayma bozuklukları üretebilen bir model çeşitli avantajları olabilir.

Tek yönlü, periyodik kesme gerilim uygulamak için basit ve son derece ekonomik bir yöntem bir orbital çalkalayıcıda ²⁴ dairesel yemekler yerleştirilmesini içerir. Bu protokol çok basit ve gerektiği gibi çoğaltır çalışmanın yüksek sayıda, nispeten geniş bir yüzey alanına sahip her başarmak kadar ölçeklendirilebilir. Ancak, çanak merkezinde bulunan hücreler aynı çanak karışık hücresel fenotipik yanıtları veren, çevresi boyunca hücrelere göre farklı akış modelleri maruz kalmaktadır.

150 mm Çap Kesme Yüzüklerin 1. İnşaat (Şekil 1)

Not: Kayma halkaları, dış ve iç Petri kabı boyutları değişen farklı bir toplam yüzey alanına, hücre verimi olan cihazları ile sonuçlanan ve kesme kuvvetlerinin aralıkları geliştirilen birçok farklı boyutlara oluşturmak için yapılandırılabilir. Bu rapor, 98 cm ² (Şekil 2) toplam yüzey alanı, bir iç 100 mm tabak ile birlikte 150 mm tabak açıklanmaktadır.

Şekil 1. Kesme halkası montaj. Şeklin üst kısmı kısmen monte kesme halkası gösterir. sıkı bir mühür tamamen iç ve dış yemekler arasında oluşmuş değil, eğer bir transfer pipet ile 3 mm delikten metilen klorür 0.5 ml enjekte edilir. kayma halkası iç Edg etrafında silikon kauçuk yapışkan 1 mm kalınlığında boncuk uygulanarak kapatıldı mühürlenirkayma halkası üst e. Şeklin alt kısmında monte kesme halkası gösterir. Mavi kaplı endotel hücrelerinin alanını temsil eder. Dış ve iç kırmızı oklar orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirilen kesme halkası içinde kayma halkası ve medyanın yörüngesel hareketi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(Değil ölçekli çizilmiş) 150 mm kesme halkası Şekil 2. Yüzey ölçümleri. Üst panel yörünge dönüşe yanıt olarak dış halka yönelik sıvı santrifüj değişimini göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. Bir üreterek bir kesme halka inşaat şablonu oluşturma150 mm dairenin ortasına yerleştirilir 100 mm iç çaplı sunum yazılımı 150 mm dış kenar profili. A4 beyaz bir kağıda şablonu yazdırın.
2. Pipet 150 mm cam Petri kabı içine metilen klorür (diklorometan), 10 ml. Metilen klorür en çok plastik çözünür ve plastik bileşenler katılması için kullanıldığı gibi bulaşık, cam olup polistiren (ya da diğer vinil plastik) bir çok önemlidir.
   DİKKAT: Yeterli kaput havalandırma ile tüm inşaat için eldiven kullanın. Metilen klorid bir temas tahriş ve hepatotoksik olduğunu.
3. Dış kesme halkası şablonuna üzerine 150 mm plastik Petri kabı aynı hizaya getirin.
4. bir döner aracını kullanarak 100 mm çanak merkezinde 3 mm'lik bir delik delin. delme üretilen herhangi bir plastik talaşı çıkarın.
5. eldivenli eliyle tutarken, ters ve yaklaşık 3 saniye boyunca metilen klorür havuza önceki adımdaki 100 mm Petri kabı üst kenarını batırın.
6. Transferin dikkatle belirgin şablona üzerine 100 mm çanak hizalayarak, 150 mm çanak merkezi üzerine 100 mm çanak kenar-down "ıslatılmış". metilen klorür 100 mm ve 150 mm yemekleri katılarak, plastik sigorta olacaktır. Yavaşça 100 mm çanak saat yönünde çevirin ve birkaç kez saat yönünün tersine 150 mm çanak iyi yapışmasını sağlamak için.
   NOT: Dış çanak merkezine iç yemeğin doğru uyum sağlamak için çok dikkatli olun. Eksantrik hizalama kesme halka farklı konumlarda kesme stresi varyasyonları olabilir. metilen klorür yanlışlıkla 100 mm tabak yerleştirilmesi sırasında 150 mm Petri kabı dış hat bölümü üzerine damla izin vermemek için özen gösterin. Bu akış bozukluklarına neden olabilir düzensiz bir yüzey oluşturarak, hücreler büyümeye devam edecektir alt yüzeyinde plastik eriyecek.
7. metilen klorür kuruduktan sonra, üzerine yeni bağlanan Petri kapları çevirmek ve dikkatli olmasını sağlamak için temas noktaları kontrolbir sıkı conta iki Petri kapları arasında oluşturulmuştur.
8. bir sıkı conta, oluşturulmuş değilse, bir transfer pipetiyle, 3 mm delik metilen klorür, 0.5 ml enjekte edilir. çanak Pick up ve hafifçe metilen klorür kenarına ulaşmak için izin döndürün.
   NOT: Çok hızlı dönseydi, metilen klorür hücreleri büyüyecek yüzeyi deforme ve kayma halkası bozma, 150 mm çanak dış kısmı içine dökmek olabilir. Sızıntı kesme halkaları atılmalıdır.
9. silikon kauçuk dolgu macunu 3 mm boncuk uygulayarak 100 mm çanak delik kapatmak.
10. Bir düz bir kesme kafası ile donatılmış bir döner aleti ile, kapağın altındaki borunun en az 1 cm bırakarak, 15 ml konik polistiren doku kültür tüpü ilk 3 cm kısmı kesti. pürüzsüz ve düz kesim kafası düz tarafı kullanarak kadar kesilmiş tüp kenarına lehçe. öğütülmesi ile üretilen herhangi bir plastik talaşı çıkarın.
11. üzerine kesilmiş 15 ml konik tüp Traceyaklaşık 0,5 cm uzakta yemeğin kenarından bir işaretleyici, 150 mm çanak kapağı. Yaklaşık dairenin kenarından 1-2 mm bir marj bırakarak, çizilen dairenin içine bir delik delin.
12. açılan deliğin üzerine kesilmiş konik tüp üst yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, 150 mm'lik kapak konik tüp bağlamak için konik tüp kesme kenarlarına metilen klorid yaklaşık olarak 250 ul geçerlidir.
13. Üst Petri kabı iç kenarında silikon kauçuk dolgu macunu 1 mm kalınlığında boncuk uygulayarak 150 mm çanak üzerine 150 mm kapağını Seal.

Kayma Yüzüklerin 2. Sterilizasyon

1. Pipet yaklaşık fosfat 10 ml, 15 ml konik tüp bağlantı noktası üzerinden yeni oluşan kayma halka içine tamponlu tuz. kayma halkası içinde herhangi bir enkaz kaldırmak için etrafında girdap. Pasteur pipeti / aspiratör ile fosfat tamponlu tuzlu su çıkarın.
2. enkaz çıkarılana kadar önceki adımı yineleyin.
3. Steri içinlizedirler kayma halkası, UV radyasyonu ile% 70 etanol durulama bir arada kullanabilirsiniz.
   1. erişim noktası üzerinden havalandırmalı kapak, pipet% 70 etanol yaklaşık 10 ml sökün ve arka kapağını kapatın. Döndürün ve kesme halkasının içine iyice yıkanır sağlanması, kesme halkası birden çok kez ters çevirin.
   2. davlumbaz altında, aşırı% 70 etanol dışarı aspire. bir sprey şişesi ile,% 70 etanol ile kapak ve bir erişim portuna püskürtün.
   3. tamamen kuruyana kadar doku kültürü kaputu içinde UV ışınları altında kayma halkası ve kap yerleştirin.
4. Hücre kültürü kaplama kullanılıncaya kadar kuru sonra oda sıcaklığında tekrar kapağı ve mağaza sterilize kayma halkaları vida.

3. Kesme Stres Çalışmaları

1. dönüştürülmüş endotel hücre hatları için 4'e bölünmüş oranı: genellikle 1 kullanarak standart hücre kültürü protokolü takip sterilize kesme halkaları endotel hücrelerini Plate.
   NOT: Sıçan retina microvascular endotel hücreleri, ticari olarak elde edildi. İnsan beyin endotelyal hücreleri (hCMEC / D3) hücreleri, Dr. Pierre-Oliver Couraud (INSERM, Fransa) cömert bir hediye olarak verilmiştir ve tam endotel bazal ortamı (EBM) 'de kültürlenmiştir.
2. Kültürler önce akım çalışmaları başlamadan izdiham ulaşmak için izin verin. Doku kültür ortamı 30 ml (% 10 fetal buzağı serumu,% 1 penisilin / streptomisin / amfoterisin ile Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı) kullanın. Her 3 günde bir hücre kültür ortamı değiştirin ve% 7.5 _CO2 ve% 92.5, oda havası ile 37 ° C 'de hücreleri korumak.
3. inkübatör orbital karıştırıcı yerleştirin.
   Not: Orbital shakers genellikle ağır (> 10 kg). raf stres ve titreşimi en aza indirmek için kuluçka alt rafında yörünge çalkalayıcı yerleştirin.
4. orbital çalkalayıcı deneysel kesme halkaları yerleştirin. Aynı inkübatör içinde statik kontrol grubu kayma halkaları yerleştirin.
5. sh içinde maksimum kayma gerilmesi tahmindenklemi ile kulak halkası nerede orbital çalkalayıcı dönme yarıçapı, (cm olarak) olan ortamının viskozitesi (poise in) (G / ml), orta yoğunluklu ve ²⁴ (devir / sn) dönme sıklığıdır.
6. Kesilme baskısı uygulama (örneğin, 72 saat), istenen bir süre için karıştırma cihazı üzerinde, kayma halkaları bırakarak istenilen devir (örneğin, 90 rpm) orbital çalkalayıcı üzerinde rotasyonu ayarını başlatmak.
   NOT: inkübatör sıcaklığı 37 ° C deney süresi boyunca korunmasını sağlamak için başlangıçta izlenmelidir böylece Orbital shakers, ısı üretebilir. Seçenek olarak ise, sduymak halkaları dönen inkübatör içinde yer sonra çevresel odaları (örneğin, modüler inkübatör odası) ve aktarılabilir.
7. hücre tabakaları zaman istenilen uzunluğa için kesme inkübatör kesme halkaları çıkarmak maruz kalmış sonra. Kayma halkası kapağı çekin ve istenen son nokta analizleri (örneğin, Western blot, floresan aktif hücre sıralama, vb) ²⁵ incelenmesi için hücreleri ve / veya medya almak.

Burada kesme halkaları kültür hCMEC / D3 beyin endotelyal hücre ve sıçan retina mikrovasküler endotel hücre mono tabakaları, hem temsili sonuçlarını sunmak.

hCMEC / D3 beyin endotelyal hücre mono tabakaları tam EBM içinde ortak akışa kadar büyümeye bırakıldıktan sonra, kesme halkaları 72 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerine yerleştirildi. Adım 3.5 den denklem kullanılarak, maksimum kayma gerilmesi hesaplanır olan parametreler ile yaklaşık 2.8 din / ^cm2 ( = 0.95 cm, = 0.0101 duruş, = 0,9973 g / ml ²⁴ = 1.5 dönmeler / saniye ). Bu hücre tabakası, genellikle çalışma boyunca kayma halkası yüzeyine mükemmel yapışma sahip, bu muntazam gözlenmez, ancak, bu endotel hücre mono tabakaları, bazen, düzenli akış (Şekil 3) istikametinde paralel olarak uyum gösteren bulduk.

bırakıldıktan sonra sıçan retina mikrovasküler endotel hücre mono tabakaları, EGF / VEGF büyüme faktörü takviyeleri dahil olmak üzere tam fare endotelial hücre ortamı içinde, ortak akışa kadar büyümeye, kesme halkaları 72 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerine yerleştirildi. Adım 3.5 den denklem kullanılarak, maksimum kayma gerilmesi hesaplanır oldu yaklaşık 12 din / parametrelerle cm ² ( = 0.95 cm, = 0.0101 duruş,iles / ftp_upload / 54.632 / 54632eq4.jpg "/> = 0,9973 g / ml ²⁴ = İkinci 4 devir /). 4 β-aktin yükleme kontrolü ile karşılaştırıldığında, endotel hücre yüzeyinden trombosit endotelyal hücre yapışma molekülü (PECAM-1 / CD31) 'in bir büyük ve önemli bir kayıp olduğunu göstermektedir.

PECAM-1 bir immüno reseptör tirosin bağımlı inhibisyon motifi ya da 'itim ^26' içerir -superfamily immünoglobulin (Ig) bir üyesi olan bir integral membran proteinidir. PECAM-1 sadece endotel hücreleri üzerinde ifade değil aynı zamanda hematopoietik hücreler üzerinde bulunur. PECAM-1 kesme geriliminin Mekanik-transdüksiyon önemlisi endotel hücre-hücre yapışması, lökosit birleşim göçüne, hücre sinyallerinde önemli bir rol oynar, ve. makaslama stresi algılama içinde PECAM-1'in rolü vasküler endotheli fonksiyonları için önemlidir El hücreleri ve homeostasis ^17. Endotelyal monokatmanlarına kesme gerilmesine maruz kaldığında, PECAM-1 kaskad ²⁷ sinyal ERK1 / 2 kendi tirosin fosforilasyonunu değiştirilmesiyle bu üzerine uygulanan mekanik kuvvet ve aktivasyonu doğrudan cevap verir. Ayrıca, PECAM-1 eNOS karmaşık ilişki kayma gerilmesi ²⁸ bozukluklar tarafından kesildi. Bu nedenle, PECAM-1 damar duvarının ²⁹ reaktif dilatasyon yol açabilir sıvı kayma gerilmesi kuvvetlerinin değişiklikleri algılamak için damar endotel hücrelerini sağlar.

Bu veriler endotel hücreleri aşağı-düzenleyen hücrelerarası temas yanı sıra transvasküler hücre değişimini aracılık önemli bir kavşak ve yapışkan determinantı, periyodik, tek yönlü sıvı kesme maruz kalma yanıt olduğunu gösteren bu modeli desteklemektedir.

632fig3.jpg "/>
Bir kesme halkası Şekil 3. Beyin endotel hücre morfolojisi. Periyodik sıvı kesme veya statik maruz 48 saat aşağıdaki kesme halkaları hCMEC / D3endothelial hücre mono tabakaları görünümü. Kültürlerin hizalama hep. (Okla gösterilen) akış yönüne paralel görülmez , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Periyodik kesme Şekil 4. Hücre tepkileri. Sıçan Retinal damar içi endotelial hücre mono tabakaları kayma halkaları kültüre PECAM1 / CD31 nispetle bir azalma-p aktin gösterdi periyodik sıvı Shea 72 saat sonra (n = 3, her öğrenci t-test, * p <0.05, Hata çubukları standart sapmayı bakınız)kesme halkaları r.

kesme endotel hücrelerini sergilemek için kesme halka sisteminin inşaat kayma gerilmesi çalışmalar yapmak için basit bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, üstün kesme yüzük ve daha iyi sonuçlar elde etmek için kritik olan birkaç adım vardır. Tam bir mühür örnekleri arasında tutarsız kayma gerilmesi oluşturabilir sızıntı medyayı engellemek için iç ve dış halka arasındaki yapılmalıdır. Tam bir conta yapılmaması halinde, metilen klorid az miktarda iç halka delikten bir transfer pipetiyle, iç ve dış çanak arasındaki kenarı eklenmelidir. Yavaşça metilen klorür tam bir sızdırmazlık oluşturmak için izin vermelidir halkasını çevirerek. Ayrıca, yanlışlıkla kesme üretilen plastik talaşı, kesme halka yolda mevcut olabilir bu yüzden olumsuz hücre büyümesini etkileyen ve tutarsız kayma gerilmesi uygulamasını verebilir herhangi bir enkaz kaldırmak gerekir inşaattan sonra kesme halkasını dışarı durulama.

smakalesinde tarif edilen duymak halkalar örnek başına çıktı, yüksek hacme gelen boyutu daha büyüktür. Ancak, küçük versiyonları küçük Petri kapları kullanılarak inşa edilebilir (örneğin, bir 60 mm eki ile 100 mm Petri kabı). diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında hala numune başına nispeten büyük sıvı hacimleri ve yüzey alanları korurken çalışma çoğaltır ve inşa birden fazla küçük kesme halkaları yüksek sayılar için izin verebilir.

makaslama halkaları kullanırken Bazı konular gündeme gelmiştir. İlk olarak, bazı yörünge shakers ısı aşırı miktarda üretmek ve bazı kuluçka sıcaklık bu artışı kontrol etmek için başarısız. Bu rotatörlerde uygun seçimi ve çok daha kolayca ısı alışverişi olmayan su ceketli kuluçka, kullanımı ile kaçınılabilir. Özellikle açık hava ortamında montaj sonrasında kesme halkaları kullanırken kültür kontaminasyonu başka potansiyel bir sorundur. Kesme halkaları Kullanmadan önce iyice sterilize edilmelidir.

J. Winny Yun Annette Funicello kuruluşundan itibaren bir araştırma bursu vardır. J. Steven Alexander Nöroloji, LSUHSC-S Bölümü'nden araştırma desteği vardır.

Yazarlar Sayın Christopher Nguyen, Aaron Hunter ve Shreveport Jumpstart'a, SMART ve Biostart eğitim programlarının yardımı yanı sıra Biyofizik, Shreveport, LA Yüzüncü Koleji Louisiana bölümü kabul etmek istiyorum.