Ассамблея и применение "Shear колец": Роман эндотелиальной Модель для Orbital, однонаправленные и периодического потока жидкости и напряжения сдвига

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Отклонения от нормальных уровней и форм сосудистых жидкости играть сдвига важную роль в сосудистой физиологии и патофизиологии, индуцируя адаптивными, а также патологические изменения в эндотелиальной фенотипа и экспрессии генов. В частности, неадекватные эффекты периодического, однонаправленный поток индуцированного напряжения сдвига может вызвать различные эффекты на нескольких сосудистых типов клеток, в частности эндотелиальных клеток. В то время как сейчас эндотелиальные клетки из разных анатомических происхождения культивировали, углубленный анализ их реакции на сдвиг жидкости были затруднены относительной сложности сдвига моделей (например, параллельная камера пластины потока, конус и потоковая модель пластины). В то время как все они представляют собой отличные подходы, такие модели технически сложны и страдают от недостатков, в том числе относительно длительный и сложный время установки, низкие площади поверхности, требования для насосов и давления часто требующих герметиков и прокладок, создавая проблемы для ботач поддержание стерильности и невозможностью выполнения нескольких экспериментов. Однако, если модели с более высокой пропускной способности потока и сдвига были доступны, больший прогресс на сосудистых эндотелиальных сдвиговых реакций, в частности периодические исследования сдвига на молекулярном уровне, может быть более быстро продвигались вперед. Здесь мы опишем построение и использование сдвига колец: роман, простой в сборке, а также модель недорогой тканевой культуры с относительно большой площадью поверхности, что позволяет легко для большого количества экспериментальных повторах в однонаправленных, стресс исследований периодические сдвига по эндотелиальные клетки.

Fluid напряжение сдвига было показано , модулировать Programs эндотелиальной гена ^{1 - 5} через активацию цис-регуляторных элементов ^6, ацетилтрансферазы активности гистона ⁷ продольных и поперечных элементов стрессовой реакции (SSRE) ^8. Касательное напряжение , влияет эндотелиальные вклад в коагуляции путем модуляции коэффициента ⁹ ткани и тканевой активатор плазминогена (ТАП) ¹⁰ выражение. Напряжение сдвига также влияет на управление ангиогенеза ¹¹ и ремоделирования сосудов, регулируя синтез PDGF-B и отзывчивость ^8. Эндотелиальной производный вазоактивные медиаторы адреномедуллин, эндотелин-1, уротензин II и релаксин также регулируются сдвига ^12. Транскрипция эндотелиальной синтазы производства оксида азота и оксида азота оба сдвига зависит ^10. Shear также контролирует эндотелиальную ICAM-1 экспрессию ^13. Flow-индуцированное напряжение сдвига, следовательно, может powerfuLLY влияют на большое разнообразие эндотелиальных реакций. Важно отметить, что сосудистые пульсации в настоящее время также , по всей видимости , играют важную роль в патофизиологии как нормальной сосудистой старения и форм сосудистой деменции ¹⁴ и даже может способствовать других нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз ^15.

Венозные и артериальные эндотелиальные клетки по своей природе подвержены различным гемодинамических картины течения в естественных условиях, и много различных фенотипа эндотелиальных клеток могут быть выставлены ^16. В зависимости от величины и периодичности потока, воздействие на эндотелиальных клетках , могут включать в себя активацию воспалительных клеток и апоптоз, что может отражать изменения в экспрессии генов или белков ^17,18. Исследования реакций эндотелиальных клеток сдвига явления поэтому остаются сложными трудностями в производстве в моделях пробирке , которые адекватно производят такие сдвига модели.

Много различных experimental протоколы были разработаны для применения напряжения сдвига жидкости в эндотелиальные клетки монослоя. Одним из наиболее широко используемых систем является параллельная камера пластины потока, которая создает равномерный ламинарный поток внутри камеры ^{19 - 21.} Шланговый насос обычно соединяется создать периодический поток, который может резюмировать характеристики потока , как правило , можно обнаружить во многих местах в естественных условиях ^22. Другой распространенный набор использует модель 'конуса и пластины', где напряжение сдвига жидкости определяется скоростью вращения конуса ^23. Обе системы, и другие механизмы, подобные им, может быть утомительным для настройки и требуют компонентов, которые могут быть относительно дорогими и недоступными для многих лабораторий.

Еще одним важным ограничением этих современных моделей является относительно низкое число повторных исследований, которые могут быть проведены одновременно, каждое с относительно низкой поверхности. Это увеличивает время и сотрудничества mplexity таких подходов. Таким образом, идеальная модель, которая вызывает однонаправленное и периодический сдвиг может быть один, где большое количество учебных повторах можно легко настроить, каждый с относительно большой площадью поверхности. Кроме того, вышеупомянутые модели требуют довольно сложной установки, которая может быть непомерно для многих пользователей. Модель, которая может производить помехи сдвига жидкости с использованием основных лабораторных материалов могут иметь ряд преимуществ.

Простой и экономичный метод весьма применения однонаправленной, периодического напряжения сдвига включает в себя размещение круговых блюд на орбитальном шейкере ^24. Этот протокол очень прост и может быть расширена до достижения высоких числа обучения повторах, каждая с относительно большой площадью поверхности, по мере необходимости. Тем не менее, клетки, расположенные в центре тарелки подвергаются различным схем потока, чем клеток по периферии, что дает клеточные фенотипические смешанные реакции в том же блюде.

1. Конструкция 150 мм Диаметр Shear колец (Рисунок 1)

Примечание: Shear кольца могут быть сконструированы, чтобы создать много различных размеров путем изменения внешних и внутренних размеров чашки Петри, в результате чего в устройствах с различными суммарными площадями поверхности, урожайность клеток и разработаны диапазоны сил сдвига. Этот отчет описывает 150 мм блюдо в сочетании с внутренним 100 мм блюдо для общей площадью поверхности 98 см ² (рисунок 2).

Рисунок 1. Shear кольцо в сборе. Верхняя часть рисунка показывает частично собранном виде кольца сдвига. Вводят 0,5 мл хлористого метилена через отверстия 3 мм с передаточным пипетку, если герметичное уплотнение не полностью сформирован между внутренними и внешними блюд. Сдвига кольцо плотно закрыта путем нанесения толстого валика 1 мм силиконовой резины клея вокруг внутреннего EDGе срезаемого кольца сверху. В нижней части рисунка показаны в собранном виде кольца сдвига. Синий представляет собой площадь посеянных эндотелиальных клеток. Внешние и внутренние красные стрелки указывают на орбитальное движение кольца сдвига и средств массовой информации внутри срезаемого кольца при размещении на орбитальном шейкере. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Измерения поверхности для кольца 150 мм сдвига (не в масштабе). Верхняя панель показывает центробежную смещение жидкости в направлении внешнего кольца в ответ на орбитального вращения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Создание шаблона сдвига кольца строительства путем создания150 мм Профиль наружный край в презентации программного обеспечения с внутренним диаметром 100 мм, помещенной в центре 150 мм круг. Печать шаблона на листе белой бумаги формата А4.
2. Пипеткой 10 мл хлористого метилена (дихлорметан) в 150 мм стеклянную чашку Петри. Очень важно, чтобы блюдо из стекла, а не из полистирола (или другого виниловый пластик), а метиленхлорид растворяет большинство пластмасс и используется здесь, чтобы присоединиться пластиковых компонентов.
   ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки для всей конструкции с достаточной вентиляцией капота. Метиленхлорид является контактным раздражителем и гепатотоксичным.
3. Совместите 150 мм пластиковые чашки Петри на внешнюю шаблон сдвига кольца.
4. Дрель 3 мм отверстие в центре 100 мм чашку с помощью роторного инструмента. Удалите все пластиковые стружки, произведенные из бурения.
5. Удерживая рукой в ​​перчатке, инвертировать и опустите верхний край 100 мм чашки Петри из предыдущего шага в бассейн метиленхлорида в течение примерно 3 сек.
6. Трансфер "увлажненный" 100 мм блюдо края вниз на центр 150 мм блюдо, тщательно совместив 100 мм блюдо на маркированной шаблон. Метиленхлорид будет плавить пластик, соединяющий 100 мм и 150 мм блюда. Осторожно повернуть 100 мм блюдо по часовой стрелке и против часовой стрелки несколько раз, чтобы обеспечить хорошую адгезию к 150 мм блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы обеспечить надлежащее выравнивание внутреннего блюдо в центре внешней тарелки. Эксцентричный выравнивание может привести к изменениям напряжения сдвига в различных местах в срезаемого кольца. Будьте осторожны, чтобы не позволить Метиленхлорид случайно капать на внешней части дорожки 150 мм чашки Петри во время размещения 100 мм блюдо. Это будет плавиться пластик на нижней поверхности, где клетки будут расти, создавая неровную поверхность, которая может вызвать возмущения потока.
7. После того, как метиленхлорид высохнет, переверните вновь связанных чашки Петри снова и внимательно осмотрите точки соприкосновения, чтобы гарантировать, чтогерметичное уплотнение было образовано между двумя чашках Петри.
8. Если герметичное уплотнение не полностью сформирован, вводят 0,5 мл хлористого метилена через отверстия 3 мм с передаточным пипеткой. Возьмите блюдо и осторожно поверните ее, чтобы метиленхлорид до края.
   Примечание: Если вращается слишком быстро, метиленхлорид может распространиться на внешнюю часть 150 мм чашку, деформируя поверхность, где клетки будут расти и разрушая кольцо на сдвиг. Протекающие кольца сдвига должны быть отброшены.
9. Заглушить отверстие в 100 мм блюдо путем нанесения 3 мм шарик из силиконового каучука герметика.
10. Используя ротационный инструмент, снабженный плоской режущей головкой, отрезать см порцию 15 мл коническую полистирола культуры ткани верхней части пробки 3, в результате чего по меньшей мере, 1 см трубы ниже колпачка. не отполировать край разрезанной трубы до гладкой и плоской, используя плоскую сторону режущей головки. Удалите пластиковые стружки, произведенные путем измельчения.
11. Трассировка Катоф 15 мл коническую трубку наКрышка 150 мм чашку с маркером, приблизительно 0,5 см от края тарелки. Просверлите отверстие внутри нарисованного круга, оставляя запас приблизительно 1-2 мм от края круга.
12. Поместите отрезать коническую верхнюю часть пробки над просверленное отверстие. Использование передачи пипетки нанести приблизительно 250 мкл метиленхлорида с обрезанными краями конической трубки, чтобы связать коническую трубку до 150 мм крышкой.
13. Уплотнение 150 мм крышку на 150 мм чашку путем нанесения толстого бусинку 1 мм из силиконового каучука герметиком вокруг внутренней кромки верхней чашки Петри.

2. Стерилизация сдвиговых колец

1. Пипеткой приблизительно 10 мл фосфатного буферного раствора в новообразованной кольца сдвига через отверстие конической пробирке на 15 мл. Вертеться вокруг, чтобы удалить любой мусор внутри срезаемого кольца. Удалите фосфатно-буферный раствор с Пастера пипетка / вакуумного аспиратора.
2. Повторите предыдущий шаг, пока мусор не будет удален.
3. Для STERILize сдвига кольца, используйте комбинацию 70% полоскании этанола с УФ-облучением.
   1. Отвинтите вентилируемого колпак, пипеткой приблизительно 10 мл 70% этанола через порт доступа, и закрутить пробку обратно. Поворот и переворачивают срезаемого кольца несколько раз, гарантируя, что внутренняя часть срезаемого кольца тщательно промывают.
   2. Под вытяжкой, аспирация лишнюю 70% этанола. С пульверизатор, тщательно опрыскивать колпачок и получить доступ к порту с 70% этанола.
   3. Поместите кольцо сдвига и колпачок под действием УФ-излучения в капюшоне культуры ткани до полного высыхания.
4. После высыхания, винт крышку на место и хранить стерилизуют сдвига кольца при комнатной температуре до использования в клеточной культуре обшивкой.

3. Стресс Исследования Shear

1. Пластинчатый эндотелиальные клетки в стерилизованные сдвиговых колец в соответствии со стандартным протоколом для культивирования клеток, как правило, с использованием 1: 4 соотношение раздвоение трансформированных клеточных линий эндотелиальных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: microv Крыса сетчатки глазаascular эндотелиальные клетки были получены на коммерческой основе. Клетки мозга эндотелиальные человека (hCMEC / D3) клетки были предоставлены как щедрый подарок от доктора Пьера-Oliver Couraud (Inserm, Франция) и культивировали в полной эндотелиальной базальной среде (EBM).
2. Разрешить культур достичь слияния до начала исследований потока. Используйте 30 мл среды культуры ткани (10% эмбриональной телячьей сыворотки, среда Дульбекко, модифицированную орла с 1% пенициллин / стрептомицин / амфотерицином). Изменение клеточной культуральной среды через каждые 3 дня и поддержания клеток при 37 ° C с 7,5% CO ₂ и 92,5% комнатного воздуха.
3. Поместите орбитальном шейкере в инкубаторе.
   Примечание: Орбитальные шейкеры, как правило, тяжелые (> 10 кг). Поместите орбитальный шейкер на нижней полке инкубатора, чтобы свести к минимуму стресс при хранении и вибрации.
4. Поместите экспериментальные кольца сдвига на орбитальном шейкере. Поместите статические кольца контрольной группы сдвига внутри одного инкубатора.
5. Расчетный показатель максимального напряжения сдвига в шСережка с уравнением где радиус поворота для орбитальном шейкере (в см), является вязкость среды (в пуаз), плотность среды (в г / мл), и частота вращения (в ротации / сек) ^24.
6. Инициирование настройки вращения на орбитальном шейкере до желаемой оборотов в минуту (например, 90 оборотов в минуту), в результате чего кольца сдвига на шейкере в течение требуемой продолжительности сдвига приложения напряжений (например, 72 ч).
   Примечание: Орбитальные шейкеры может производить тепло, так что температура в инкубаторе следует контролировать сначала, чтобы обеспечить 37 ° С поддерживают в течение всего периода эксперимента. В качестве альтернативы, сСлушайте кольца могут быть переданы в климатические камеры (например, инкубатором камеры) , а затем помещают в вращающийся инкубатор.
7. После того, как клеточные слои подвергались воздействию сдвига в течение требуемого промежутка времени, снимите кольца сдвига из инкубатора. Снять срезаемого кольца крышку и извлечь клетки и / или средств массовой информации для изучения желаемой конечной точки анализа (например, Вестерн - блоттинга, флуоресценция активированный сортировки клеток и т.д.) ^25.

Здесь мы представляем репрезентативные результаты как hCMEC / D3 мозга эндотелиальных клеток и крысы монослоев сетчатки микрососудистых эндотелиальных клеток, культивируемых в касательных кольцах.

После предоставления возможности hCMEC / D3 монослоев эндотелиальных клеток головного мозга расти до слияния в полной EBM, сдвиговые кольца были помещены на орбитальный шейкер в течение 72 часов. Используя уравнение с шага 3.5, расчетное максимальное напряжение сдвига составляла приблизительно 2,8 дин / см ² (с параметрами = 0,95 см, = 0,0101 уравновешенность, = 0,9973 г / мл ^24, = 1,5 оборотов / сек ). Мы обнаружили , что эти эндотелиальные клеточные монослои иногда демонстрируют выравнивание параллельно с направлением периодического потока (рис 3), хотя это не является единообразным , поскольку клеточные слои , как правило , имеют отличную адгезию к поверхности срезаемого кольца на протяжении всего исследования.

Дают крыс сетчатки микрососудистых монослоев эндотелиальных клеток расти до слияния в полной среде клеток крысы эндотелиальной, включая EGF / VEGF фактора роста добавок, сдвиговые кольца были помещены на орбитальный шейкер в течение 72 часов. Используя уравнение с шага 3.5, расчетное максимальное напряжение сдвига составляла примерно 12 дин / см ² (с параметрами = 0,95 см, = 0,0101 уравновешенность,Iles / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0,9973 г / мл ^24, = 4 об / сек). На рисунке 4 показано , что по сравнению с контролем погрузочной бета-актина, была большая и значительная потеря тромбоцитов эндотелия молекулы клеточной адгезии (РЕСАМ-1 / CD31) с клеточной поверхности эндотелиальной.

РЕСАМ-1 представляет собой интегральный мембранный белок , который является членом иммуноглобулина (Ig) , который содержит -superfamily иммунорецептора тирозин-зависимой ингибирующий мотив или 'ITIM' ^26. РЕСАМ-1 не только экспрессируется на эндотелиальных клетках, но также находится на гемопоэтических клетках. РЕСАМ-1 играет значительную роль в клеточной адгезии клеток эндотелия, лейкоцитарной переселении, соединительного клеточной сигнализации, и, что важно, механо-трансдукции напряжения сдвига. Роль РЕСАМ-1 в зондирования напряжения сдвига имеет решающее значение для функций сосудистого endotheli Al клетки и гомеостаз ^17. Когда эндотелиальные монослои подвергаются напряжению сдвига, РЕСАМ-1 реагирует непосредственно на механическую силу, оказываемого на него, изменяя его фосфорилирования тирозина и последующей активации ERK1 / 2 каскада ²⁷ сигнализации. Кроме того, РЕСАМ-1-Енос комплекс ассоциация прерывается возмущениями в напряжении сдвига ^28. Таким образом, РЕСАМ-1 позволяет сосудистые эндотелиальные клетки , чтобы воспринимать изменения в жидкости , сдвиговых напряжений сил , которые могут привести к реактивным дилатацией стенки сосуда ^29.

Эти данные подтверждают эту модель, показывая, что эндотелиальные клетки реагируют на воздействие периодического, однонаправленного сдвига жидкости путем снижения регулирующей важный узловой и клейкую определитель, который опосредует межклеточные контакты, а также transvascular клеточный обмен.

632fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Мозг морфологии клеток эндотелия в срезаемого кольца. Появление монослоев hCMEC / D3endothelial клеток в касательных кольцах следующие 48 часов периодического сдвига жидкости или статической экспозиции. Выравнивание культур не всегда наблюдается параллельно направлению потока (показано стрелкой). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. клеточные ответы на периодические сдвига. Крысы микрососудов сетчатки глаза монослои эндотелиальных клеток , культивируемых в касательных кольцах показали снижение PECAM1 / CD31 по отношению к бета-актина (п = 3 каждый, студенты непарный т-тест, * р <0,05, столбики ошибок см стандартное отклонение), после 72 часов периодического жидкости Sheaг в поперечных колец.

Конструкция сдвига кольцевой системы для воздействия эндотелиальные клетки сдвига является простой подход к выполнению исследования напряжения сдвига. Тем не менее, есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для получения превосходные кольца сдвига и лучшие результаты. Полное уплотнение должно быть сделано между внутренним и внешним кольцом, чтобы предотвратить просачивание СМИ, которые могли бы создать противоречивую напряжение сдвига среди образцов. Если полное уплотнение не сделано, минимальное количество хлористого метилена следует добавить к краю между внутренним и наружным блюдо с передаточным пипеткой через отверстие во внутреннем кольце. Осторожно вращая кольцо должно позволить хлористый метилен, чтобы сформировать полную герметизацию. Кроме того, пластиковые стружка непреднамеренно производимые из резки могут присутствовать на сдвиге кольцевой трассе, поэтому промывание кольцо при сдвиге после строительства должны удалить любой мусор, который может отрицательно повлиять на рост клеток и дать непоследовательное применение напряжения сдвига.

В sСлушайте кольца, описанные в статье, являются относительно большими по размеру, что приводит к высокому объему производства на пробу. Тем не менее, меньшие версии могут быть построены с использованием меньшего размера чашки Петри (например, 100 мм чашки Петри с 60 - мм вставкой). Построение несколько меньшие сдвига кольца может позволить для большего числа исследования размножается при сохранении относительно больших объемов жидкости и площади поверхности на выборку по сравнению с другими методами.

Несколько вопросов были отмечены при использовании кольца сдвига. Во-первых, некоторые орбитальные шейкеры производят избыточное количество тепла, а некоторые инкубаторы не могут контролировать это повышение температуры. Этого можно избежать путем соответствующего выбора вращатели и использование неводных оболочечных инкубаторах, которые теплообмен гораздо легче. Загрязнение Культура является еще одним потенциальной проблемой при использовании кольца сдвига, особенно после сборки в среде под открытым небом. Поперечные кольца должны быть тщательно стерилизовать перед использованием.

J. Winny Юн имеет исследовательский грант от фонда Аннет Funicello. J. Стивен Александр имеет научно-исследовательскую поддержку со стороны Департамента неврологии, LSUHSC-S.

Авторы хотели бы поблагодарить за помощь г-на Кристофера Нгуен, Аарон Хантер и Шривпорта Jumpstart, SMART и учебных программ Biostart, а также Столетний Колледж Луизианы отдел биофизики Шривпорте, штат Луизиана.