La Asamblea y la Aplicación de 'Shear Anillos': A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Las desviaciones de los niveles normales y los patrones de juego de cizallamiento importantes funciones de fluido vascular en la fisiología vascular y la fisiopatología de la inducción de adaptación, así como los cambios patológicos en el fenotipo endotelial y la expresión génica. En particular, los efectos de mala adaptación de, la tensión de cizallamiento inducido por el flujo unidireccional periódica puede accionar una variedad de efectos sobre varios tipos de células vasculares, en particular células endoteliales. Mientras que por ahora las células endoteliales de diversos orígenes anatómicos han sido cultivadas, los análisis en profundidad de sus respuestas a la fricción fluida se han visto obstaculizados por la relativa complejidad de los modelos de corte (por ejemplo, la cámara de flujo de placas paralelas, cono y placa de modelo de flujo). Si bien todos estos representan excelentes enfoques, tales modelos son técnicamente complicado y adolecen de inconvenientes, incluyendo el tiempo de preparación relativamente largo y complejo, las zonas superficiales bajas, los requisitos para las bombas de presurización y con frecuencia requieren sellantes y juntas, creando retos para both mantenimiento de la esterilidad y una incapacidad para ejecutar múltiples experimentos. Sin embargo, si estaban disponibles, mayor progreso en las respuestas cortantes endoteliales vasculares mayores modelos de rendimiento de flujo y corte, la investigación de cizallamiento sobre todo periódica a nivel molecular, podría ser más avanzado rápidamente. A continuación, se describe la construcción y el uso de anillos de corte: una novela, sencilla de montar, y el modelo de cultivo de tejidos de bajo costo con una superficie relativamente grande que permite fácilmente de un alto número de réplicas experimentales en, cizalla periódica estudios de estrés unidireccionales en células endoteliales.

Tensión de cizallamiento de fluido se ha demostrado que modulan programas de genes endoteliales ^1-5 través de la activación de los elementos reguladores ^cis-6, la actividad histona acetiltransferasa ⁷ y elementos de respuesta a la tensión de cizallamiento (SSRE) ^8. Cizallamiento influencias de estrés contribuciones endoteliales hacia la coagulación mediante la modulación del factor tisular ⁹ y activador del plasminógeno tisular (tPA) ¹⁰ expresión. Esfuerzo de corte también influye en el control de la angiogénesis ¹¹ y el remodelado vascular mediante la regulación de la síntesis de PDGF-B y la capacidad de respuesta ^8. El derivado del endotelio mediadores vasoactivos adrenomedulina, la endotelina-1, urotensina II y relaxina también están regulados por cizallamiento ^12. La transcripción de la producción de óxido nítrico sintasa endotelial y la producción de óxido nítrico son ambos dependientes de cizallamiento ^10. Shear también controla endoteliales ICAM-1 de expresión ^13. Flujo inducido por esfuerzo de corte, por tanto, puede powerfuinfluir LLY una gran variedad de respuestas endoteliales. Es importante destacar que, pulsaciones vasculares ahora también parecen jugar un papel importante en la fisiopatología de tanto el envejecimiento vascular normal y formas de demencia vascular ¹⁴ y pueden incluso contribuir a otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la esclerosis múltiple ^15.

Venosa y las células endoteliales arteriales son inherentemente expuestos a diversos patrones de flujo hemodinámicos in vivo, y muchos diferentes fenotipos de células endoteliales pueden ser exhibidos ^16. Dependiendo de la magnitud y la periodicidad de flujo, los efectos sobre las células endoteliales pueden incluir la activación de células inflamatorias y la apoptosis, lo que puede reflejar los cambios en el gen o proteína de expresión ^17,18. Los estudios sobre las respuestas de células endoteliales a cizalla fenómenos por lo tanto permanecen complicados por las dificultades en la producción de modelos in vitro que producen adecuadamente tales patrones de corte.

Muchos EXPERIME diferenteprotocolos NTAL se han desarrollado para aplicar la tensión de cizallamiento de fluido a monocapas de células endoteliales. Uno de los sistemas más utilizados es la cámara de flujo de placas paralelas, lo que crea un flujo laminar uniforme dentro de la cámara ^{19 - 21.} Una bomba peristáltica suele estar conectado para crear un flujo periódico, que pueden recapitular las características de flujo que se encuentran típicamente en muchos lugares en vivo ^22. Otra forma común de configuración utiliza el modelo de 'cono y placa', donde el estrés de cizalla de fluidos está determinada por la velocidad de rotación del cono ^23. Ambos sistemas, y otros arreglos similares a ellos, puede ser tedioso de instalar y requieren componentes que pueden ser relativamente caro e inaccesible para muchos laboratorios.

Otra limitación importante de estos modelos actuales es el número relativamente bajo de los estudios de replicación que se pueden realizar de forma simultánea, cada uno con un área de superficie relativamente baja. Esto aumenta el tiempo y co mplexity de tales enfoques. Por lo tanto, un modelo ideal que induce la cizalladura unidireccional y periódica podría ser uno donde un alto número de repeticiones de estudio se puede configurar fácilmente, cada uno con una superficie relativamente grande. Además, los modelos anteriormente mencionados requieren una configuración bastante sofisticado, que puede ser un costo prohibitivo para muchos usuarios. Un modelo que puede producir alteraciones de cizalla de fluidos utilizando materiales básicos de laboratorio puede tener varias ventajas.

Un método simple y muy económica de la aplicación de la tensión de cizallamiento unidireccional, periódica consiste en la colocación de platos circulares en un agitador orbital ^24. Este protocolo es muy simple y se puede escalar hasta alcanzar altos números de estudio réplicas, cada uno con un área superficial relativamente grande, según sea necesario. Sin embargo, las células situadas en el centro del plato están expuestos a diferentes patrones de flujo de las células a lo largo de la periferia, dando respuestas fenotípicas celulares mixtos en el mismo plato.

1. Construcción de 150 mm de diámetro de los anillos de corte (Figura 1)

NOTA: anillos de cizallamiento se pueden construir para crear muchas dimensiones diferentes, variando los tamaños de plato exterior e interior de Petri, resultando en dispositivos con diferentes áreas superficiales totales, los rendimientos celulares y desarrollado gamas de fuerzas de cizallamiento. Este informe describe un plato de 150 mm combinado con una placa de 100 mm interno para una superficie total de 98 ^cm2 (Figura 2).

Figura 1. conjunto de anillo de cizallamiento. La parte superior de la figura muestra un anillo de corte parcialmente montado. Inyectar 0,5 ml de cloruro de metileno a través del agujero 3 mm con una pipeta de transferencia si un sello hermético no ha completamente formado entre los platos de interior y exterior. El anillo de corte es sellada mediante la aplicación de un cordón grueso de 1 mm de adhesivo de caucho de silicona en el interior edge de la parte superior del anillo de corte. La parte inferior de la figura muestra el anillo de corte montado. El azul representa el área de las células endoteliales plateados. Las flechas rojas indican exterior e interior del movimiento orbital del anillo de corte y los medios de comunicación en el interior del anillo de corte cuando se coloca en un agitador orbital. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Las mediciones de superficies para un anillo de corte 150 mm (no está dibujado a escala). El panel superior muestra el desplazamiento centrífuga del fluido hacia el anillo exterior en respuesta a la rotación orbital. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Crear una plantilla de construcción de anillo de corte mediante la generación de unaperfil de borde exterior 150 mm en el software de presentación con un diámetro interno de 100 mm colocada en el centro del círculo 150 mm. Imprimir la plantilla sobre una hoja de papel blanco A4.
2. Pipetear 10 ml de cloruro de metileno (diclorometano) en un plato de vidrio de 150 mm de Petri. Es crítico que el plato es de cristal y no de poliestireno (u otro plástico de vinilo), como cloruro de metileno solubiliza mayoría de los plásticos y se utiliza aquí para unirse a los componentes de plástico.
   PRECAUCIÓN: Use guantes para todas las construcciones con campana de ventilación adecuada. El cloruro de metileno es un irritante de contacto y es hepatotóxico.
3. Alinear un plato de 150 mm de Petri de plástico en la plantilla de cizalla anular exterior.
4. Perforar un agujero de 3 mm en el centro de un plato de 100 mm utilizando una herramienta rotativa. Quitar cualesquiera virutas de plástico producidos a partir de la perforación.
5. Mientras sostiene con una mano enguantada, invertir y sumergir el borde superior de la placa de Petri de 100 mm de la etapa anterior en la piscina de cloruro de metileno durante aproximadamente 3 seg.
6. Transfer la "humedecida" 100 mm plato de borde hacia abajo en el centro de un plato de 150 mm, alineando cuidadosamente el plato 100 mm en la plantilla marcada. El cloruro de metileno se fundir el plástico, uniéndose a los platos de 100 mm y 150 mm. girar suavemente el 100 mm placa de las agujas del reloj y en sentido contrario varias veces para asegurar una buena adhesión a la placa de 150 mm.
   NOTA: Tenga mucho cuidado para asegurar una alineación correcta de la antena interior al centro de la placa exterior. alineación excéntrica puede dar lugar a variaciones de la tensión de corte en diferentes ubicaciones en el anillo de corte. Tener cuidado de no permitir que el cloruro de metileno a gotear accidentalmente sobre la parte de pista exterior de la placa de Petri de 150 mm durante la colocación de la placa de 100 mm. Esto fundir el plástico en la superficie inferior donde las células se crecen, creando una superficie irregular que puede causar perturbaciones del flujo.
7. Una vez que el cloruro de metileno se haya secado, voltear los platos de Petri recién unidas sobre e inspeccione cuidadosamente los puntos de contacto para asegurar queun sello hermético que se ha formado entre las dos placas de Petri.
8. Si un sello hermético no se ha formado completamente, inyectar 0,5 ml de cloruro de metileno a través del agujero 3 mm con una pipeta de transferencia. Recoger el plato y gire suavemente para permitir que el cloruro de metileno, para llegar a la orilla.
   NOTA: Si gira demasiado rápido, el cloruro de metileno puede derramarse en la parte exterior del plato 150 mm, la deformación de la superficie en la que crecen las células y arruinar el anillo de corte. Las fugas en los anillos de corte deben ser desechados.
9. Sellar el agujero en la placa de 100 mm mediante la aplicación de un 3 mm capa de sellador de caucho de silicona.
10. El uso de una herramienta rotativa equipada con un cabezal de corte plana, cortar la parte superior de 3 cm de un tubo de cultivo de tejidos de poliestireno cónico de 15 ml, dejando al menos 1 cm del tubo por debajo de la tapa. Pulir el borde del tubo de corte hasta que quede suave y plana con el lado plano de la cabeza de corte. Quitar cualesquiera virutas de plástico producidos por molienda.
11. Rastrear el punto de corte de 15 ml tubo cónico en eltapa de la placa 150 mm con un marcador, de aproximadamente 0,5 cm de distancia del borde del plato. Perforar un agujero en el interior del círculo dibujado, dejando un margen de aproximadamente 1-2 mm del borde del círculo.
12. Coloque la parte superior del tubo cónico de corte sobre el agujero perforado. Usando una pipeta de transferencia, se aplican aproximadamente 250 l de cloruro de metileno a los bordes cortados del tubo cónico para unir el tubo cónico a la tapa de 150 mm.
13. Sellar el 150 mm tapa sobre el plato de 150 mm mediante la aplicación de un cordón grueso 1 mm de sellador de caucho de silicona alrededor del borde interior de la parte superior plato Petri.

2. Esterilización de los anillos de cizallamiento

1. Pipet aproximadamente 10 ml de solución salina tamponada con fosfato en el anillo de corte recién formada a través del puerto de tubo cónico de 15 ml. Girando en torno a eliminar cualquier residuo en el interior del anillo de corte. Retire el PBS con un aspirador de pipeta / vacío Pasteur.
2. Repita el paso anterior hasta que se retire escombros.
3. para Sterilize el anillo de corte, utilice una combinación de un enjuague de etanol 70% con irradiación UV.
   1. Desenroscar la tapa ventilada, pipeta de aproximadamente 10 ml de etanol al 70% a través del puerto de acceso, y el tornillo de la tapa. Rotar y voltear sobre el anillo de cizallamiento varias veces, lo que garantiza que el interior del anillo de corte se lava a fondo.
   2. Bajo una campana extractora, aspirar el exceso de etanol al 70%. Con una botella de spray, rocíe completamente el orificio de la tapa y el acceso con un 70% de etanol.
   3. Coloque el anillo de corte y la tapa bajo radiación UV dentro de la campana de cultivo de tejidos hasta que esté completamente seco.
4. Una vez seco, el tornillo de la tapa en las tiendas y esterilizada anillos de cizallamiento a temperatura ambiente hasta su utilización en el enchapado de cultivo celular.

3. Shear Estudios sobre el Estrés

1. Placa de las células endoteliales en los anillos de cizallamiento esterilizados siguiendo el protocolo estándar de cultivo celular usando típicamente una relación 1: 4 de división para las líneas de células endoteliales transformadas.
   NOTA: microV retinal RatSe obtuvieron células endoteliales ascular comercialmente. Se proporcionaron las células endoteliales de cerebro humano (hCMEC / D3) las células como un generoso regalo del Dr. Pierre-Oliver Couraud (INSERM, Francia) y se cultivaron en medio basal endotelial completa (MBE).
2. Permitir a las culturas alcanzan la confluencia antes del inicio de los estudios de flujo. Usar 30 ml de medios de cultivo de tejido (suero de ternero fetal al 10%, medio de Eagle modificado de Dulbecco con 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina). Cambiar medio de cultivo celular cada 3 días y mantener las células a 37 ° C con 7,5% de _CO2 y aire de la habitación 92,5%.
3. Coloque el agitador orbital en la incubadora.
   Nota: Agitadores orbitales son típicamente pesada (> 10 kg). Coloque el agitador orbital en el estante inferior de la incubadora para minimizar el estrés estante y vibraciones.
4. Coloque los anillos de corte experimental en el agitador orbital. Coloque los anillos de grupo de control de cizalladura tanto estáticos dentro de la misma incubadora.
5. Estimar el esfuerzo cortante máximo en el shanillo de oído con la ecuación dónde es el radio de rotación para el agitador orbital (en cm), es la viscosidad del medio (en poise), es la densidad del medio (en g / ml), y es la frecuencia de rotación (en rotación / sec) ^24.
6. Iniciar la configuración de rotación en el agitador orbital a la rpm deseado (por ejemplo, 90 rpm), dejando a los anillos de cizallamiento en el agitador durante la duración deseada de la aplicación de tensión de cizallamiento (por ejemplo, 72 h).
   NOTA: Agitadores orbitales pueden producir calor, por lo que la temperatura de la incubadora se debe supervisar para asegurar inicialmente 37 ° C se mantiene durante toda la duración del experimento. Alternativamente, sanillos HEAR pueden ser transferidas en cámaras ambientales (por ejemplo, cámara de la incubadora modular) y luego se colocan dentro de un incubador giratorio.
7. Después de capas de células han sido expuestas a la cizalla para el período de tiempo deseado, quitar los anillos de corte de la incubadora. Retirar la tapa anillo de corte y recuperar las células y / o medios para el examen de los análisis de punto final deseado (por ejemplo, transferencia Western, activado por fluorescencia la clasificación de células, etc.) ^25.

A continuación se presentan los resultados representativos tanto de las células endoteliales del cerebro hCMEC / D3 y de rata monocapas de células endoteliales microvasculares de la retina, se cultivaron en anillos cortantes.

Después de permitir que hCMEC / D3 monocapas de células endoteliales del cerebro para crecer hasta la confluencia en EBM completo, los anillos de cizallamiento se colocaron en un agitador orbital durante 72 horas. Usando la ecuación de la etapa 3.5, la tensión máxima de cizallamiento calculada fue de aproximadamente 2,8 dinas / cm ² (con parámetros = 0,95 cm, = 0,0101 aplomo, = 0,9973 g / ml ^24, = 1,5 rotaciones / segundo ). Hemos encontrado que estas monocapas de células endoteliales a veces exhiben alineación en paralelo con la dirección del flujo de periódico (figura 3), aunque esto no se observa de manera uniforme debido a las capas de células por lo general tienen una excelente adhesión a la superficie de anillo de corte durante todo el estudio.

Después de permitir que las monocapas de células de la retina de rata endoteliales microvasculares para crecer hasta la confluencia en medio completo de células endoteliales de rata, incluyendo suplementos de factores de crecimiento EGF / VEGF, los anillos de cizallamiento se colocaron en un agitador orbital durante 72 horas. Usando la ecuación de la etapa 3.5, la tensión máxima de cizallamiento calculada fue de aproximadamente 12 dinas / cm ² (con parámetros = 0,95 cm, = 0,0101 aplomo,iles / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0,9973 g / ml ^24, = 4 rotaciones / segundo). La Figura 4 muestra que en comparación con el control de carga de β-actina, hubo una pérdida grande y significativo de la molécula de plaquetas endoteliales de adhesión celular (PECAM-1 / CD31) de la superficie de las células endoteliales.

PECAM-1 es una proteína integral de membrana que es un miembro de la inmunoglobulina (Ig) -superfamily que contiene un motivo inhibidor de tirosina dependiente de inmunoreceptor o "ITIM ^'26. PECAM-1 no sólo se expresa en células endoteliales pero también se encuentra en las células hematopoyéticas. PECAM-1 juega un papel importante en la adhesión célula-célula endotelial, la transmigración de leucocitos de la unión, la señalización celular, y esto es importante, mecano-transducción de tensión de corte. el papel de PECAM-1 en la detección de la tensión de cizallamiento es crítica para las funciones de endotheli vascular las células de Al y la homeostasis de ^17. Cuando las monocapas endoteliales se exponen a tensión de corte, PECAM-1 responde directamente a la fuerza mecánica ejercida sobre el mismo mediante la alteración de su fosforilación de tirosina, y la posterior activación de la ERK1 / 2 en cascada ²⁷ de señalización. Por otra parte, el PECAM-1-eNOS asociación compleja se interrumpe por alteraciones en la tensión de cizallamiento ^28. Por lo tanto, PECAM-1 permite a las células endoteliales vasculares para detectar cambios en las fuerzas de tensión de cizallamiento de fluido que puede dar lugar a la dilatación reactiva de la pared del vaso ^29.

Estos datos apoyan este modelo muestra que las células endoteliales responden a la exposición a la fricción fluida periódica, unidireccional por abajo de la regulación de una unión importante y determinante adhesiva, que media el contacto intercelular, así como el intercambio de células transvascular.

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Figura 3. Cerebro morfología de las células endoteliales en un anillo de corte. La aparición de monocapas de células hCMEC / D3endothelial en los anillos de corte tras 48 horas de fricción fluida periódica o la exposición estática. La alineación de las culturas no siempre se observa en paralelo a la dirección del flujo (que se muestra por la flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. respuestas celulares a la cizalladura periódica. Microvasculares de la retina de rata monocapas de células endoteliales cultivadas en los anillos de cizallamiento mostró una reducción en PECAM1 / CD31 en relación con ß-actina (n = 3 cada uno, prueba t de Student no pareada, * p <0,05, barras de error se refieren a la desviación estándar), después de 72 horas de karité fluido periódicar en los anillos de cizallamiento.

La construcción del sistema de anillo de corte para la exposición de células endoteliales a la cizalla es un método simple para la realización de estudios de estrés de cizallamiento. Sin embargo, hay algunos pasos que son críticos para la obtención de los anillos de corte superiores y mejores resultados. Un sello completo debe hacerse entre el anillo interior y exterior para evitar que el material de filtración que podría crear tensión de corte varía entre las distintas muestras. Si un sello completo no se hace, una cantidad mínima de cloruro de metileno, debe añadirse a la arista entre el plato interior y exterior con una pipeta de transferencia a través del agujero en el anillo interior. girando suavemente el anillo debe permitir el cloruro de metileno para formar un sellado completo. Además, virutas de plástico producidos inadvertidamente de corte pueden estar presentes en la pista anillo de corte, por lo enjuagar el anillo de corte después de la construcción debería eliminar cualquier residuo que pudiera afectar negativamente el crecimiento celular y dar a la aplicación de tensión de cizalla inconsistente.

los sanillos HEAR descritos en el artículo son de tamaño relativamente grande, lo que lleva a un alto volumen de producción por muestra. Sin embargo, versiones más pequeñas podrían ser construidos usando platos más pequeños de Petri (por ejemplo, 100 mm placa de Petri con un inserto de 60 mm). La construcción de múltiples anillos de corte más pequeñas podrían permitir un mayor número de estudio replica mientras que todavía mantiene relativamente grandes volúmenes de fluido y áreas de superficie por muestra, en comparación con otros métodos.

Tenía unos cuantos problemas se han observado cuando se utilizan anillos de corte. En primer lugar, algunos agitadores orbitales producen cantidades excesivas de calor, y algunas incubadoras no logran controlar este aumento de temperatura. Esto se puede evitar por la selección apropiada de los rotadores y el uso de incubadoras con camisa no de agua, que el intercambio de calor mucho más fácilmente. contaminación del cultivo es otro problema potencial cuando se utilizan anillos de corte, sobre todo después del montaje en un entorno al aire libre. anillos de cizallamiento deben ser esterilizados antes de usar.

J. Winny Yun tiene una beca de investigación de la fundación Annette Funicello. J. Steven Alexander cuenta con el apoyo de investigadores del Departamento de Neurología, LSUHSC-S.

Los autores desean agradecer la asistencia del Sr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter y el enlace personalizado Shreveport, SMART, y programas de formación biostart, así como el departamento de Centenary College of Louisiana de Biofísica, Shreveport, LA.