Yöntemler Fibroblast Göç Yönetmeliği Mrp4 içeren makromoleküler kompleksler Eğitim için

MRP4 hücre göçü bir süre önce aydınlatılmamıştır rolü dahil olmak üzere çeşitli siklik nükleotid-bağımlı sinyal olaylarını düzenler. Biz fibroblast göçü ince ayar düzenlenmesinde önemli roller oynamaktadır benzersiz MRP4 interaktom belirlenmesi ile sonuçlanan MRP4 aşağısında moleküler hedeflerin çözülmeye doğrudan, ama çok yönlü bir yaklaşım açıklar.

Çoklu ilaç direnci proteini 4 (MRP4) membran taşıyıcılarının ATP-bağlayıcı kaset ailesinin bir üyesi olan ve siklik nükleotidin bir endojen akış taşıyıcıdır. intraselüler siklik nükleotid konsantrasyonunun modüle edilmesiyle, MRP4 hücre göçü de dahil olmak üzere birden fazla, siklik nükleotid-bağımlı hücresel olayları ayarlayabilir. Daha önce, MRP4 yokluğunda fibroblast hücreleri, hücre içi siklik nükleotidlerin yüksek seviyelerini ihtiva edebilmekte ve daha hızlı göç göstermiştir. Bu bulgunun altında yatan mekanizmaları anlamak için, biz doğrudan ama çok yönlü bir yaklaşım benimsemiştir. İlk olarak, kütle spektrometresi, ardından imüno kullanılarak MRP4 aşırı ifadesi hücre sistemi için MRP4 potansiyel etkileşimli protein kompleksleri izole edilmiştir. MRP4 interaktom benzersiz proteinleri tanımlamak sonra sinyal iletimi kapsamında bu protein-protein etkileşimlerinin rolünü araştırmak için Ingenuity Pathway Analizi (IPA) kullanılmıştır. Biz po aydınlatılamamıştırHücre göçü üzerinde MRP4 etkisinin önemli bir aracısı olarak hücre göçü MRP4 protein kompleksinin ve tespit edilen F-aktin aşamasında potansiyel rolü. Bu çalışma aynı zamanda göçmen olayların kilit oyuncular olarak cAMP ve cGMP rolünü vurguladı. yüksek içeriği mikroskobu kullanarak, hücre göçü deneyleri gerçekleştirilmiştir ve fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisi tamamen cAMP bağımlı kinaz A (PKA), aktin hücre iskeletinin veya inhibisyon bozulması sonucu yok olduğunu gözlemledik. Gerçek zamanlı bir göç hücrede modülasyon sinyal görselleştirmek için, biz PKA aktivitesini ölçmek için bir FRET tabanlı sensör kullanmış ve buldum, Mrp4 göç ön kenarına yakın daha kutuplaşmış PKA aktivitesinin varlığı ^{- / -} karşılaştırıldığında fibroblast, Mrp4 ^{+ /} fibroblastlar ^+. Bu da kortikal aktin oluşumunu artmış ve göç sürecini artar. Yaklaşımımız MRP4 için aşağı hareket proteinlerin tanımlanmasını sağlar ve bir over bize sunuyorfibroblast göçü MRP4 bağımlı düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmanın görünümü.

Hücre göçü karmaşık bir çoklu-aşamalı bir işlemdir. Çalışmalar göç hücreleri sırasında baştaki ve sondaki kenarları içine polarize olduğunu göstermiştir. hücre gövdesi ileriye taşımak için ekstraselüler matriks kalarak, öncü gerekli çekiş gücü sağlar. Son olarak, kenar serbest bırakır arka arka ekleri ve göç döngüsü ^1,2 tamamlar.

verimli hücre göçü için hücre polarizasyon hücre içi sinyal mekansal ayrışma ile düzenlenir. Böyle cAMP gibi hücresel ikinci haberciler, ince ayarlı yönlü hücre göçü ^3,4 için gerekli sinyal olaylarının compartmentalization aracılık eder. Lider kenarında cAMP ve cAMP bağımlı kinaz PKA aktivitesinin Tercihli birikimleri yönlü hücre migrasyonu ^5,6 anahtar rol oynarlar. ras ile ilgili C3 botulinum toksini alt-tabaka (rac) ve hücre bölünmesi kontrol proteini 42 homolog ya da Cdc42, PK küçük GTPazlar fosforilleyerekÖnde gelen kenarında aktin-ilişkili protein 2/3 (Arp 2/3) aktive eder ve lamellipodia ^7-9 oluşumunu uyarır. PKA, aynı zamanda, bir anti-başlık ajanı, fosforile, damar genişletici ve böylece membran uzatma ve geri çekme ^10,11 salınım döngüsü düzenler, fosfoprotein (VASP) uyarılır.

Zara-bağlı akış taşıyıcı ³ I) Sentez adenilat siklaz, fosfodiesterazlar II) bozulması ve iii) taşıma ile: hücrelerde, cAMP seviyelerinin üç ana işlemler ile düzenlenmektedir. Çoklu ilaç direnci proteini 4 (MRP4), siklik nükleotidlerin endojen akış taşıyıcısı olarak membran ileticileri, fonksiyonların ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesinin bir üyesidir. Bu nedenle, MRP4 hücre içi cAMP seviyelerini düzenleyen ve cAMP bağımlı hücre ^11-13 sinyal. ^{- / -,} Fibroblastlar, siklik nükleotidlerin göreceli olarak daha yüksek seviyede içeren ve hızlı c geçiş Daha önce Mrp4 göstermiştir kiMrp4 ^{+ / +} fibroblastlar ¹⁴ ompared. Biz de fibroblast göçü üzerinde döngüsel nükleotidlerin bifazik etki bildirdi. Önceki çalışmalara dayanarak ve Mrp4 bizim bulgu ^{- / -} fibroblastlar göç sırasında daha kutuplaşmış cAMP içeren fibroblast göçü bu MRP4 aracılı düzenleme cAMP bağımlı olduğunu varsaydık. aşağı mekanizmasını anlamak için, biz doğrudan ama çok yönlü bir yaklaşım aldı.

ilişkili ve MRP4 ile etkileşim içinde proteinleri tespit etmek, biz üzerinden MRP4 ifade HEK293 hücrelerinden MRP4 içeren makromoleküler kompleksleri immünopresipitasyon. kitle spektrometresi kullanarak, birden fazla MRP4-etkileşim proteinleri tespit ve Yaratıcılık Yolu Analizi (IPA) kullanarak birleştiricisi analiz edildi. IPA (yapısal ve fonksiyonel hem de), protein-protein etkileşimleri analiz ve özellikle fizyolojik ve patolojik olarak katkılarını araştırmak için bir araçtıredebiyat ve deneysel kanıtlara ^15,16 dayalı olaylar. IPA cAMP ve cGMP molekülleri ¹⁷ anahtar sinyal olduğu F-aktin hücre göçü bağlamında MRP4 önemli bir alt hedef olduğunu göstermiştir. Bu veriler ayrıca, yüksek içeriği mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Yüksek içerik mikroskopi yakalamak ve daha uygun, doğru ve yüksek verimli bir şekilde ¹⁸ gibi hücre göçü gibi hücre davranışlarını analiz edebilirsiniz. Yüksek içerik mikroskopi veri fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisi tamamen PKA ¹⁷ aktin hücre iskeletinin veya inhibisyon bozulması üzerine kaldırılmıştır olduğunu göstermiştir.

Ayrıca, bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) gerçek zamanlı olarak hücrelerin göç PKA dinamiklerini izlemek için PKA sensör tabanlı kullanılır. FRET tabanlı kinaz sensörleri genellikle CFP ve YFP fluorophores ^19-21 çevrili özel fosforilasyon substrat peptidler oluşur. pmAKAR3 geliştirilmiş ve bana olanmbrane forkhead ilişkili alan 1 (FHA1) ve PKA substrat sekansını LRRATLVD ^5,22 ihtiva FRET göre PKA sensörü hedef almıştır. PKA, katalitik alt birim artışlar pmAKAR3 fosforilasyonu CFP ve YFP ¹⁹ arasındaki sinyali FRET. Sensöre bir lipit modifikasyonu etki yerleştirilmesi özellikle zar bölmesi ^23, PKA dinamiklerini izlemek için plazma membran bunu hedefliyor.

PmAKAR3 kullanarak, göstermiştir ki Mrp4 göç öncü ^{- / -} sırayla hücrenin hücum kenarı ¹⁷ kortikal aktin oluşumunu artmış Mrp4 ^{+ / +} fibroblastlar, daha kutuplaşmış PKA aktivite sergiledi fibroblastlar. Birlikte, bu olaylar MRP4 yokluğunda daha iyi hücresel kutuplaşma ve daha hızlı yön hücre göçü sonuçlandı. Bizim özel ve doğrudan bir yaklaşım MRP4 için anahtar aşağı hedefler belirledik ve önemli bir sağlar, ancakfibroblast göçü MRP4 bağımlı düzenleme için henüz keşfedilmemiş bir mekanizma.

1. Yaratıcılık Yolu Analizi

1. Yükleme Protein interaktom Veri kümesi
   1. kendilerine özgü gen tanımlayıcıları (kütle spektrometresi verileri ile elde edilen, tercihen gen sembolleri ve gen tanımlayıcı numaraları) ile bir e-tabloda ilgi proteinler / genleri yerleştirin.
   2. Gen tanımlayıcı numarası için e-tabloda bir sütun ve gözlemsel değeri için bir sütun atayın (örn., Fold-değişim veya p-değeri). sütun başlıklarını görüntülemek için 'sütun başlığını içeren' seçeneğini seçin.
   3. Yükleme veri kümesi sekmesini tıklayıp yukarıda belirtilen e-tabloyu seçerek IPA veri kümesi yükleyin. Esnek biçim sekmesini seçin ve gen tanımlayıcı uygun kategoriyi seçin.
      Not: Veri kümesinin esnek biçim yüklemek için biçimlendirme spesifikasyonları üstesinden gelir.
   4. veri seti göründükten sonra, kimliği ve gözlem sütunları seçin. Emin olun kütle-sp tanımlanan proteinlerin (MRP4 interaktom tüm buectrometry) veri kümesi özeti sekmesinde kontrol ederek eşleştirilir. veri kümesi şimdi istenen analiz için hazırdır.
2. Veri analizi
   Not: Bu çalışma için kullanılmıştır IPA özelliklerinin kısmi kullanımları Açıklanan vardır.
   1. tek belirleyici olarak kendi gen isimleri ile MRP4 interaktom yükledikten sonra, yeni tıklayın ve IPA yazılımının sol üst menüde çekirdek analizini seçin.
   2. Deney türüne göre yoğunluğu için ifade cutoffs değerini ayarlayın (100 Yoğunluk değeri analizi için tavsiye edilir).
   3. kontrolü ve deneysel koşullar katılmaktadırlar ve bir karşılaştırma analizi yapılmalıdır gerekiyorsa kümesi dosyasının bir parçası olarak dahil ederseniz dataset hazırlanırken ifadesinde kat-değişim hesaplayın (1.5 kat değişim bir cut-off değeri genellikle analiz için tavsiye edilir ).
      Not: Çekirdek analiz tamamlandıktan sonra analiz birden çok bölüm elde edilebilir. İlk sekme th özetini gösterirE toplam analizler ve diğerleri arasında üst kanonik yollar, yukarı düzenleyicileri, moleküler ve hücresel fonksiyonları ve ağları önerir; Tüm güven düzeyi (p değeri) göre hesaplanır ve p değeri artan sırasına göre düzenlenmiş.
   4. resimsel örtüşen çapraz konuşma göstermek (açık yolu seçeneğini kullanarak) büyük kanonik yollar gibi büyük moleküler ağlar açın ve sinyal yolları etkilemiştir.
      Majorly p-değerine dayalı işin içinde olan kanonik yollar listesine bakmak (p <0.05 anlamlı olarak kabul edilir).
      Not: kanonik yollar için anlam değerleri sağ kuyruklu Fisher testi ile hesaplanmıştır. önemi yalnız rastgele tesadüfen kanonik yoluna ile dataset moleküllerin dernek olasılığını ifade etmektedir.
   5. Her yoluna katılan proteinlerin liste arasında giriş proteinleri (kütle spektrometresi ile tanımlanan MRP4 interaktom) kontrol edin.
      Not: Bu Optio kullanman, hücresel aktin hücre iskeleti sinyalizasyon ağ giriş proteinleri içine sığacak büyük etkilenen yolu ve nasıl (Şekil 1) olduğu gözlendi. Bu yaklaşım, moleküler ağlar yakından ilişkili ve test proteinleri etkilenecek hangi belirlemenize yardımcı olur.
   6. potansiyel odak moleküllerinin sayısına dayalı belirli bir protein ağı bağlı üst hastalıkları ve işlevleri tanımlamak için analizlerde ağ sekmesini kullanın.
      A skor değeri, bir ağ, örneğin bir parçası olarak belirlenir bilinen proteinlere göre verilen literatür bilgileri ve deneysel kanıtlara aracılığıyla hücresel montaj ve organizasyon ağı ve veri kümesinden tanımlanan molekülleri odaklanmak ve ağın parçası haline. Not . Bundan sonra, ağ, ağırlıklı moleküllerin sayısına göre, en başta, süzüldü alır.

2. Yüksek içerik Mikroskopi

1. Hücrelerin Hazırlanması
   Not: Tüm hücre kültürü çalışmaları yatay akışlı hücre kültürü kaputu altında yapıldı.
   1. yara iyileştirici tahlili için 96 çukurlu mikrolevhaların kullanın.
   2. Ceket (PBS içinde yeniden)% 1 fibronektin çözeltisi ile mikroplaka, ve 2 saat boyunca 37 ° C'de standart bir _CO2 inkübatör plaka tutun.
   3. ^{- / -} Ve Mrp4 ^{+ / +} fare embriyosu akciğer fibroblast (MEF'ler) inkübatör 25 cm² hücre kültürü şişelerinde yetiştirilen 4x tripsin-EDTA çözeltisi, 1 ml ile 5 dakika boyunca hücreler, PBS ile 1 kez yıkayın ve trypsinize Mrp4 çıkarın.
   4. tam orta ve tam ortam 5 ml bunları tekrar süspansiyon (DMEM,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren) hücreler yıkanır.
   5. Kuyulardan fibronektin çözüm aspire. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve her kuyuya (hücre sayısı, hücre tipine göre optimize edilmesi gerekiyor) 30.000 hücreleri tohum.
   6. Bir standart% 100 izdiham hücreleri büyümekCO, 24 saat boyunca 37 ° C 'de ₂ inkübatör.
2. oluşturma Yara
   1. Tüm oyuklar çözeltisi ile doldurulur emin olun. Yara yapma aracı zarar görmesini önlemek için PBS ile kullanılmayan kuyu doldurun (örneğin., WoundMaker).
   2. % 100 hücre izdiham onayladıktan sonra, metal taban levhası üzerinde yara yapma aracı içinde 96-plaka yerleştirin ve aşağı 96-iyi pin bloğu basın.
   3. herhangi bir yerinden hücreleri çıkarmak ve tam orta 100 ul eklemek için PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
   4. Test bileşikleri ekleyin - lH-89 (50 uM; 1: Tüm ortam DMSO içinde 50 mM stok kullanılarak 1000 seyreltme) ya da Latrunculin B (1 uM, 1: DMSO içinde 1 mM stok kullanılarak komple ortam ile 1000 seyreltme), bu aşamada .
   5. 37 ° C'de okuyucu içinde deney plakasını ve deneysel dönem boyunca göç izlemek.
3. İzleme Hücre Göç
   Not: Hücre göç mikroskop ve yazılım pr kullanılarak izlenmiştiryüksek içerik mikroskobu sistemi ile ovided. yaralar otomatik olarak mikroskop tarafından izlenir ve yazılım tarafından tescil edilmesini sağlar 96 çukurlu mikrolevhaların kullanımı.
   1. program tarama sekmesini kullanarak göç deneyleri için deney plakası saatte tarama yazılımı olarak ayarlayın. En az 15 dakika görüntüleme önce dengeye izin okuyucu içinde tahlil plaka yerleştirdikten sonra bir başlangıç ​​zamanını seçin.
   2. kaseti seçin ve damar tipi (96 kuyu mikroplaka) ve deney türünü (Scratch Yara) seçin.
   3. 10X objektif seçmek ve faz-kontrast görüntüleme parametrelerini seçin. düzenlemek tarama deseni seçeneği kullanılarak taranması gereken kuyu seçin.
   4. özellikleri sekmesini seçip bir tabak haritası kurarak tedavileri grupları ve herhangi çoğaltır belirtin. Tarama deneysel durumuna göre herhangi bir anda durdurulabilir.
4. Veri analizi
   1. Tarama bittikten sonra, tahlil plaka için damar görüntüsü sekmesini seçin. Ganaliz iş programları ve seçin başlatmak yeni bir analiz işine o.
   2. iş türü olarak çizik yara ayarlayın ve analizi (24 saat zaman noktası 0 zaman noktası) için zaman aralığını seçin.
   3. Seçin kuyu kuyu üzerinde tek bir tıklama ile analiz için seçilmiş ve analizi başlatmak için 'Tamam' düğmesine tıklayın. Analiz yapıldıktan sonra, grafik grafik seçeneği ihracat kullanarak her zaman bir noktada her iyi için göreceli yara yoğunluğu (DWT) veri görselleştirmek.
   4. Her iyi görünüm görüntü sekmesini kullanarak farklı zaman noktalarında tekabül faz-kontrast görüntü setini görüntüleyin. Plaka harita üzerinde tıklayarak belirli bir kuyu seçin zaman aralığı sekmesinden belirli bir zaman noktası seçmek ve görüntülemek görüntü sekmesine tıklayın.

3. Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET)

1. Hücrelerin Hazırlanması
   1. (Bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi) ve saklayın% 1 fibronektin çözeltisi 100 ul ile kaplayın 35 mm cam tabanlı yemekler2 saat boyunca 37 ° C'de standart bir _CO2 inkübatör.
   2. tam bir ortamda HEK293 hücreleri plakaları ve tohum eşit sayıda gelen fibronektin solüsyonu (10,000 hücre / plaka) aspire.
   3. 24 saat boyunca 37 ° C'de standart bir _CO2 inkübatör fibronektin kaplı cam tabanlı tabaklar 60-70% konfluansa hücreleri büyütün.
2. transfeksiyon
   1. üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak, tüm geçici transfeksiyonları gerçekleştirin.
   2. Alikosu her 35 mm çanak için iki ayrı 1.5 ml steril santrifüj tüplerine tam ortam 250 ul.
   3. Bir tüp, 5 ul DNA (pmAKAR3 ya pmAKAR3-TA) 2 ug bir tüp içinde transfeksiyon reaktifi (2.5 DNA konsantrasyonu katı) ekleyin.
   4. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir tüp içine seyreltilmiş DNA transferi.
   5. İyice karıştırın ve 37 ° C'de inkübe30 dakika daha ° C.
   6. hücreler kapalı orta aspire ve PBS ile bir kez yıkayın. hücreler,% 10 FBS ihtiva eden antibiyotik içermeyen DMEM F-12 ortamı içinde 1 ml.
   7. Her plaka hücrelere ortam DNA-lipit eşleniği 507 ul ekle yavaşça karıştırın ve 48 saat boyunca 37 ° C'de _CO2 inkübatöründe tutun. Her bir plaka 10.000-50.000 hücrelerin DNA (1 ug / ml stok) ve 5 ul lipid 2 ug kullanın.
3. Canlı hücre Görüntüleme
   1. Transfeksiyondan 48 saat sonra, Hank Dengeli Tuz Çözeltisi ile 2 kez büyüme ortamı çıkarın ve hücreleri yıkamak (HBSS, 37 ° C'de önceden ısıtılmış ° C). ısmarlama bir 37 ° C içinde, FRET görüntüleme için bir ters geniş alan mikroskop sistemi ile yıkandı, hücreler 1.9 ml HBSS bir son hacim ekleyin ve montajını bölmeyi muhafaza.
      Bu sistemde, uyarma ışık% 50 ışık Telekomünikasyon, bir Nötr Yoğunluk filtresi ile zayıflatılmış bir 300 W Xenon lambası ile sağlanır: Notiyon.
   2. 60X objektif kullanın. El ile hücrelere odaklanmak ve mikroskop kullanılarak görüş optimal alanını ayarlayın. Yazılımın odaklanın "F" seçeneğini kullanarak bilgisayar ekranında görüş seçilen alanı etkinleştirin. FRET ölçümler yapmak için, uygun filtre seti (bir 430/25 nm uyarma filtresi, bir çift dikroik ışın ayırıcı ile set OBP / YFP filtresi ve iki emisyon filtreleri FRET için (470/30 nm için OBP ve 535/30 nm) seçin manuel.
   3. ilk açık flor sekmesini tıklatarak ve ardından kanal seçeneği OBP / YFP / FRET üzerinde kontrol ederek floresan gözünüzde canlandırın. Kamera sekmesinde yoğunlaşması aracını kullanarak sinyal yoğunluğu geliştirin.
   4. sinyal yoğunluğu doygunluğunu kaçınarak pmAKAR3 veya pmAKAR3-TA ifade hücreleri seçin. FRET ölçümünü başlatmak için yakalama penceresini kullanın.
   5. time-lapse seçeneği ve kurulumu 30 sn aralıklarla 30 dakika süreyle bir zaman tarama seçin. FRET seçeneğini işaretleyin ve 100 milisaniye olarak poz süresini ayarlayın. görüntü etiketin girind basın ölçümünü başlatmak başlar.
   6. Beş zaman noktalarında ve taban kurulduktan sonra, 30 dakikalık bir toplam, hücreler plaka bozmadan hücrelere forskolin 25 uM (HBSS, 100 ul seyreltilmiş etanol içinde 10 uM stoklar, 5 ul) ekleyin ve monitör.
4. Veri analizi
   Not: Veri analizi için kullanın oranlı metrik hesaplama modülü.
   1. Görüntü penceresinin sol taraftaki seçim aracı tıklayın ve açılan menüden katı bir dikdörtgen seçin. Bir hücre serbest alanda görüntü alanında dikdörtgen sürükleyin ve sağ arka plan çıkarma amacıyla arka plan olarak ayarlamak için üzerine tıklayın.
   2. maske gidin ve seçeneği 'yeni bir maske oluşturmak kullanabilirsiniz. seçim aracı gidin ve elle ölçüm için seçmek için hücrenin etrafına bir maske çizmek için açılır menüden bir kalem seçin. durum başına en az 4-6 hücreleri seçin.
   3. Maske sekmesini seçin ve maske istatistiklerini gerçekleştirin.
   4. 'Bütün maske' kontrol çapraz kanal seçeneği seçin donör normalize FRET (N-FRET) (FRET / OBP) genişletin. N-FRET değeri plazma membranında PKA aktivitesi temsilcisidir.
   5. look-up tablosu ve ölçek çubuğu ek açıklamaları kullanarak, zaman damgalarını ekleyin.

Fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisini araştırmak için, biz yüksek içerik mikroskopisi ¹⁴ kullanan bir yara iyileştirici deneyi kullanıldı. Kesin yaralar izole MEF'lerin birleşik tekli katmanları üzerinde yapılmıştır ya Mrp4 ^{- / -} ya Mrp4 ^{+ / +} fareleri, ve görüntüleri 24 saat sonra 1 saatlik aralıklarla alındı. Mrp4 ^{+ / +} MEF'ler (Şekil 2) göre MEF'ler ^{- / -} Bu Mrp4 için daha yüksek bir geçiş ücreti görülmektedir. Mrp4 ^{+ / +} MEFS yaraları kapatmak için neredeyse 20 saat gerekli ise, MEFS ^{- / -} yaralar tamamen Mrp4 için en az 15 saat içinde iyileşti.

hücrelerin göç öncü PKA aktivitesinin Polarize birikimi yönlü göç için önemli bir erken olaydır. PKA aktivitesi Anlık usin olarak izlenebilirg PKA ^5,17 için pmAKAR3 FRET tabanlı sensör. PKA aktivitesi için pmAKAR3 özgüllüğünü kontrol etmek için, pKa'sı için alt-tabaka bölgesinde bir treonin-alanine-mutasyon içerir ve bu nedenle 25 uM forskolin ile PKA fosforilasyonuna yanıtsız olan pmAKAR3 veya nokta mutantı pmAKAR3-ta, aşın ifade eden HEK293 hücreleri tedavi , bir cAMP-indükleme ajanı ^14. Bu pmAKAR3 aşırı eksprese eden hücrelere FRET sinyali bir artış olduğunu, ancak pmAKAR3-TA aşırı eksprese eden hücrelere (Şekil 3) aynı kaldı. bazal seviyesi, aynı zamanda pmAKAR3-ta ifade eden hücrelere kıyasla pmAKAR3 eksprese eden hücreler daha yüksek olduğu FRET. Bu veriler pmAKAR3 PKA aktivitesi için çok spesifik olduğunu göstermektedir.

Özet olarak, iletişim kuralı bölümünde tarif edilen yöntemler, belirli bir hücre olayla ilişkili moleküler mekanizmanın çalışma için yararlı araçlardır.

Şekil 1:. MRP4 interaktom marifet Yolu Analizi (IPA) kullanarak IPA aktin hücre iskeleti yolu MRP4 interaktom etkilenen önemli kanonik yollarının biri olarak tespit edilmiştir. Sunulan aktin sinyal ağı bağlı proteinler (beyaz) ve edebiyat ve deneysel kanıtlara olayla MRP4 interaktom (pembe) tanımlanan proteinler ile çapraz iletişimi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 2: Yara iyileşmesi yüksek içerik Mikroskopisi kullanılarak Deneyi Mrp4 ^{+ / + ve} Mrp4 ^{- / -} fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) fibrone üzerinde büyütülmüştür96 oyuklu tabaklara CTIN kaplı ve mono tabakaları yaralar 96 iğneli yara makinesi kullanılarak tam olarak yapılmıştır. Farklı zaman noktalarında Temsilcisi görüntüler 10X büyütme ile gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) pmAKAR3 Sensörler kullanarak PKA Faaliyet Ölçümü tabanlı N-FRET Temsilcisi sözde renkli görüntüler 60X büyütme ile önce ve forskolin tedavi sonrası pmAKAR3 sensörü ve pmAKAR3-TA sensörü ile transfekte HEK293 hücreler için. gösterilir (üst paneller). Her paneldeki Görüntüler aynı görüş alanından ele geçirildi. Renk çubuğu N-FRET büyüklüğünü gösterir. çizgi grafiği (alt panel) Terbiyede sonra N-FRET seviyelerinde değişimi temsilforskolin ile t. Veriler, en az üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil (± SEM ortalama n = 3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing^1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis^24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.

Using high-content microscopy¹⁸, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts¹⁴. In contrast to the conventional scratch wound assay, the microscopy here conducts the wound healing assay in an automated convenient, consistent and high-throughput manner. The software analyzes the cell migration rate based on three separate metrics: i) change in wound width, ii) change in cell confluence within the wound region, and iii) relative wound density (RWD). RWD is a self-normalized metric that measures the spatial cell density inside the wound area relative to the spatial cell density outside of the wound area. Therefore, it is not affected by changes in cell density due to cell proliferation and provides very specific information regarding cell migration which is otherwise difficult to be obtained by the conventional scratch wound assay²⁶. Initially, at the 0 time point, the RWD will be 0% and upon complete wound healing, the RWD will be 100%. All of these metrics are calculated by custom-made software with inbuilt algorithms and the migration information is automatically generated for every time point. The assay is easy to perform but proper washing (70% ethanol) and handling (inside the hood) of the wound-maker is important to prevent contamination. Our data suggested that the RWD kinetics for Mrp4^-/- MEFs are significantly higher compared to Mrp4^+/+ MEFs.

During migration, cells polarize into leading and trailing edges that ultimately pull the cell body toward the direction of migration^1,27. Distinct and segregated signaling events at different regions of a moving cell ensure the polarization process. Polarized accumulation of cAMP and subsequent activation of PKA at the leading edge is a key early step in directional cell migration⁵. Since MRP4 has very high affinity for cAMP (Km = 45 µM)¹², we hypothesize that the effect of MRP4 on cell migration is cAMP-dependent. To identify the proteins acting downstream of MRP4 and simultaneously interacting with MRP4, we characterized MRP4-containing macromolecular complexes by mass-spectrometry. The MRP4 interactome was subjected to multiple analyses including generation of protein networks, path maps, and functional integration to the canonical pathways of the cellular signaling and their respective pictorial representation through the use of IPA. In general, IPA allows scientific users to recognize the molecular and physiological contexts of their genes and proteins of interest. However the analysis is completely based on the literature and experimental evidences. Novel interactions cannot be suggested by IPA. But it can identify which network, the proteins of interest, can potentially form. Additionally users can identify the top diseases and functions that are potentially linked to a particular protein network based on the confidence level (P value). Of interest to our study, the actin cytoskeleton pathway was a major affected pathway with a P value of 6.75 x 10^-4. This comprehensive approach also revealed that F-actin is a major protein target for MRP4 and cAMP is the key mediator¹⁷. Based on these data, we further studied the underlying molecular mechanisms.

To understand the effect of MRP4 on cAMP dynamics and PKA activity during the course of cell migration, we used FRET-based live-cell imaging techniques. Using FRET-based sensors for cAMP and PKA activity, we confirmed higher cAMP accumulation and higher PKA activity at the leading edge of migrating and polarized fibroblasts^22,28. We further demonstrated that in the absence of MRP4, MEFs have more polarized cAMP and PKA activity, which in turn facilitates cortical actin formation and cell migration. The high-content microscopy-based wound-healing assay showed that the effect of MRP4 on cell migration is completely abolished by PKA inhibition or actin disruption, which indicates a direct role of PKA and actin as downstream targets¹⁷. Unlike conventional cell population-based assays such as ELISA, use of a FRET-based sensor allows us to identify the downstream effector kinases that regulate various signaling processes and detect the correlation between cyclic nucleotide dynamics and their corresponding kinase activity in real time and space. Additionally it can discriminate intracellular and intercellular heterogeneity during the signaling events. For example it can detect the difference in PKA dynamics in the cells at the wound edge compared to the cells inside the monolayer and away from the wound edge⁵, whereas ELISA based assays can only detect total intracellular cyclic nucleotide or PKA level in a sample^14,17. However the transfection efficacy of particular cell types can be a limiting factor for conducting FRET based assays but the highly efficient transfection reagents can overcome this problem.

Together, our results indicate that in addition to conferring drug resistance, MRP4 also plays important physiological roles by modulating intracellular cAMP dynamics. Using three unique approaches, i) high-content microscopy¹⁸, ii) IPA¹⁵, and iii) FRET^5,28, we have begun to unravel the previously undefined role of MRP4 in cell migration. In general, these useful scientific techniques will allow us to identify new downstream targets of any protein of interest and explore novel molecular mechanisms involved in particular pathological or physiological cell responses. Where IPA provides useful information regarding downstream effectors of the protein of interest and potential regulatory networks; FRET-based live imaging can monitor compartmentalized signaling in real time. High-content microscopy is a convenient high-throughput screening tool to monitor and analyze physiological events, such as cell migration and cell proliferation, over a period of time as a final readout.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.