أساليب لدراسة Mrp4 تحتوي على المجمعات ضخم في تنظيم الخلايا الليفية الهجرة

MRP4 ينظم العديد من الفعاليات الإشارات التي تعتمد على النوكليوتيدات دوري بما في ذلك دور توضيح مؤخرا في الهجرة الخلية. وصفنا نهج مباشرة، ولكن متعدد الأوجه لكشف أهداف جزيئية المصب MRP4 مما أدى إلى التعرف على interactome MRP4 الفريد الذي يلعب دورا رئيسيا في التنظيم صقل للهجرة الخلايا الليفية.

أدوية المتعددة المقاومة بروتين 4 (MRP4) هو عضو في الأسرة كاسيت ATP ملزم لنقل غشاء وهو نقل هروب رأس المال الذاتية من النيوكليوتيدات الحلقية. عن طريق تحوير تركيز النوكليوتيدات الحلقية داخل الخلايا، يمكن MRP4 تنظيم العديد من الأحداث الخلوية دوري تعتمد على النوكليوتيدات بما في ذلك الهجرة الخلية. في السابق، أثبتنا أن في غياب MRP4، والخلايا الليفية تحتوي على مستويات أعلى من النيوكليوتيدات الحلقية داخل الخلايا، ويمكن أن تهاجر أسرع. لفهم الآليات الكامنة وراء هذه النتيجة، واعتمدنا نهجا مباشرا بعد متعدد الأوجه. أولا، نحن عزل بروتين المجمعات المتفاعل المحتملة للMRP4 من الإفراط في التعبير نظام خلية MRP4 باستخدام مناعي تليها مطياف الكتلة. بعد تحديد البروتينات فريدة من نوعها في interactome MRP4، نحن تستخدم الإبداع تحليل المسار (IPA) لاستكشاف دور هذه التفاعلات البروتين البروتين في سياق نقل الإشارة. نحن توضيح على بودور tential من بروتين معقد MRP4 في هجرة الخلايا والتعرف F-الأكتين كوسيط رئيسي للتأثير MRP4 على الهجرة الخلية. وأكد هذه الدراسة أيضا دور المخيم والمركب، بوصفها عنصرا رئيسيا في ظاهرة الهجرة. باستخدام المجهر عالية المحتوى، أجرينا فحوصات الخلية الهجرة وأشار إلى أن تأثير MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية وألغيت تماما من اختلال الهيكل الخلوي الأكتين أو تثبيط المخيم التي تعتمد كينيز (PKA). لتصور يشير التحويرات في خلية المهاجرة في الوقت الحقيقي، ونحن تستخدم جهاز استشعار القائم على الحنق لقياس النشاط PKA وجدت، وجود نشاط PKA أكثر استقطابا بالقرب من الحافة الأمامية من الهجرة Mrp4 ^{- / -} الليفية، مقارنة Mrp4 ^{+ / +} الخلايا الليفية. وهذا بدوره زيادة تشكيل الأكتين القشرية وزيادته عملية الهجرة. نهجنا يمكن التعرف على البروتينات تعمل المصب إلى MRP4 ويوفر لنا مع علىنظرا لآلية المشاركة في التنظيم تعتمد-MRP4 للهجرة الخلايا الليفية.

هجرة الخلية هي عملية متعددة الخطوات المعقدة. وقد أظهرت الدراسات أنه خلال خلايا الهجرة والاستقطاب في البادئة والزائدة الحواف. من خلال الالتزام المصفوفة خارج الخلية، وتنص على حافة الرائدة في الجر ضرورية لخلايا الجسم للمضي قدما. وأخيرا، فإن وراء إطلاق حافة إرفاق ملفات الخلفية واكتمال ^1،2 دورة الهجرة.

وينظم الاستقطاب خلية للهجرة الخلايا كفاءة من خلال الفصل المكاني من الإشارات بين الخلايا. الخلوية رسل الثانية، مثل المخيم، توسط تجزئة الأحداث يشير اللازمة لضبطها غرامة الاتجاه ^3،4 الهجرة الخلية. تراكمات التفضيلية للمخيم والتي تعتمد على مخيم كيناز النشاط PKA على حافة الرائدة تلعب أدوارا رئيسية في الاتجاه خلية الهجرة ^5،6. بواسطة phosphorylating GTPases الصغيرة مثل الصلة رأس الركيزة C3 توكسين البوتولينوم (راك) والسيطرة على انقسام الخلايا بروتين 42 homolog أو Cdc42، PKوينشط المتعلقة الأكتين البروتين 2/3 (آرب 2/3) في طليعة والحث على تشكيل أقدام صفاحية ^7-9. PKA أيضا phosphorylates وكيلا لمكافحة السد، حفز عائي بروتين فسفوري؛ فسوبروتين (VASP)، وبالتالي ينظم دورات متذبذبة التمديد الغشاء وتراجع ^10،11.

في الخلايا، وينظم مستويات المخيم ثلاث عمليات رئيسية هي: ط) التوليفية التي محلقة محلقة، والثاني) التحلل بواسطة phosphodiesterases، وج) النقل عن طريق النقل هروب رأس المال بغشاء ^3. أدوية المتعددة البروتين المقاومة 4 (MRP4)، وهو عضو في ATP ملزم كاسيت (ABC) أسرة من النقل الغشاء، وظائف باعتبارها الناقل هروب رأس المال الذاتية من النيوكليوتيدات الحلقية. لذلك، يمكن MRP4 تنظيم مستويات مخيم داخل الخلايا والخلوية التي تعتمد على المخيم مما يشير ^11-13. لقد أظهرنا سابقا أن في Mrp4 ^{- / -} الليفية تحتوي على مستويات أعلى نسبيا من النيوكليوتيدات الحلقية وتهاجر أسرع جompared إلى Mrp4 ^{+ / +} الخلايا الليفية ^14. أبلغنا أيضا تأثير ثنائي الطور من النيوكليوتيدات الحلقية على الهجرة الليفية. وبناء على الدراسات السابقة وتقصي لدينا أن Mrp4 ^{- / -} الليفية تحتوي على المخيم أكثر استقطابا أثناء الهجرة، ونحن افترضنا أن هذا القانون بوساطة MRP4 للهجرة الخلايا الليفية هو المخيم التابعة. من أجل فهم آلية المصب، اتخذنا نهج مباشر حتى الآن على المتعدد الأوجه.

للتعرف على البروتينات المرتبطة بها وفي التفاعل مع MRP4، نحن immunoprecipitated المجمعات الجزيئات التي تحتوي على MRP4 من خلايا HEK293 التي تعبر عن مدى MRP4. باستخدام مطياف الكتلة، حددنا عدة بروتينات التفاعل MRP4 وتحليل الترابط الخاصة بهم باستخدام الإبداع تحليل المسار (IPA). IPA هو أداة مفيدة لتحليل التفاعلات البروتين البروتين (سواء الهيكلية والوظيفية) واستكشاف مساهماتها في الفسيولوجية والمرضية خاصةالأحداث على أساس الأدب والأدلة التجريبية ^15،16. وأشار IPA أن F-الأكتين هو الهدف المصب الرئيسي للMRP4 في سياق الهجرة الخلية حيث المخيم والمركب هي مفتاح الجزيئات مما يشير ^17. وقد تأكدت هذه المزيد من البيانات بواسطة المجهر عالية المحتوى. المجهر محتوى عال يمكن التقاط وتحليل سلوكيات الخلية مثل الهجرة خلية في أكثر ملاءمة ودقيقة وعالية الإنتاجية نحو ^{18 عاما.} أظهرت بيانات المجهر عالية المحتوى الذي أثر MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية وألغيت تماما على اختلال الهيكل الخلوي الأكتين أو تثبيط PKA ^17.

بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) القائم على استشعار PKA لمراقبة ديناميات PKA في الخلايا المهاجرة في الوقت الحقيقي. تتكون أجهزة الاستشعار كيناز القائم على الحنق عادة من الببتيدات الركيزة الفسفرة محددة يحيط بها CFP وfluorophores YFP ^19-21. pmAKAR3 ومحسنة ولياستهدفت mbrane استشعار PKA أساس الحنق الذي يحتوي المصاحب forkhead نطاق 1 (FHA1) وتسلسل PKA الركيزة LRRATLVD ^5،22. الفسفرة من pmAKAR3 من قبل PKA زيادات فرعية الحفازة الحنق إشارة بين CFP و YFP ^19. الإدراج في مجال الدهن تعديل في استشعار يستهدف لغشاء البلازما لرصد ديناميات PKA، وتحديدا في مقصورة غشاء ^23.

باستخدام pmAKAR3، أثبتنا أن حافة الرائدة في مجال الهجرة Mrp4 ^{- / -} الليفية عرضت النشاط PKA أكثر استقطابا من Mrp4 ^{+ / +} الخلايا الليفية، والتي زادت بدورها تشكيل الأكتين القشرية على حافة الرائدة في الخلية ^17. معا، وأسفرت هذه الأحداث في أفضل الاستقطاب الخلوي وهجرة الخلايا أسرع الاتجاه في غياب MRP4. حددت لدينا نهج محدد ومباشر أهداف المصب الرئيسية للMRP4 ويوفر مهم، ولكن كمامن بعد آلية غير المكتشفة لتنظيم تعتمد-MRP4 للهجرة الخلايا الليفية.

1. الإبداع تحليل المسار

1. تحميل البروتين interactome الإدراجات
   1. إدراج البروتينات / الجينات من الاهتمام في جدول مع معرفات من الجينات فريدة من نوعها (ويفضل رموز الجينات وأرقام معرف الجين كما تم الحصول عليها مع البيانات الطيفي الشامل).
   2. تعيين عمود واحد في جدول البيانات عن عدد الجينات معرف وعمود واحد لقيمة الرصد (على سبيل المثال، أضعاف تغيير أو القيمة الاحتمالية). حدد 'يحتوي على رأس العمود "خيار لعرض عناوين الأعمدة.
   3. تحميل مجموعة البيانات على IPA عن طريق النقر على علامة التبويب تحميل مجموعة البيانات واختيار جدول البيانات المذكورة أعلاه. اختر علامة التبويب صيغة مرنة، واختيار الفئة المناسبة من معرف الجينات.
      ملاحظة: صيغة مرنة للبيانات يتغلب على مواصفات التنسيق للتحميل.
   4. بعد ظهور بيانات، تحديد الهوية والمراقبة الأعمدة. التأكد من أن جميع من البروتينات (MRP4 interactome كما حددها الشامل ليرة سوريةectrometry) يتم تعيينها عن طريق فحص على علامة التبويب ملخص البيانات. مجموعة البيانات هو الآن على استعداد لتحليل المطلوب.
2. تحليل البيانات
   ملاحظة: وصفت هي الاستخدامات جزئية من الميزات IPA التي استخدمت في هذه الدراسة.
   1. بعد تحميل MRP4 interactome مع أسماء الجينات، كما معرفات فريدة من نوعها، انقر على الجديد واختيار التحليل الأساسي في القائمة العلوية اليسرى من البرنامج IPA.
   2. تعيين قيمة انقطاع التعبير عن شدة وفقا لنوع التجربة (ينصح قيمة كثافة 100 لتحليلها).
   3. حساب التغير أضعاف في التعبير في حين تستعد مجموعة البيانات إذا الرقابة والتجريبية الظروف المعنية وإدراجه كجزء من ملف بيانات إذا كان تحليل مقارنة يحتاج إلى أن يقوم (ينصح عادة قيمة قطع من 1.5 تغيير أضعاف للتحليل ).
      ملاحظة: بعد الانتهاء من التحليل الأساسي، مقاطع متعددة من التحليلات ويمكن الحصول على. تعرض علامة التبويب الأول ملخص عشره مجموع التحليلات ويقترح أعلى الممرات الكنسي، والمنظمين المنبع، وظائف الجزيئية والخلوية وشبكات وغيرها. كل محسوبة على أساس مستوى الثقة (القيمة ع) ومرتبة في ترتيب تصاعدي من قيمة ص.
   4. فتح الممرات الرئيسية الكنسي (باستخدام الخيار مسار مفتوح) شبكات الجزيئية الكبيرة والتي تظهر بالصور عبر الحديث، والتداخل، وأثرت على مسارات إشارات.
      نظرة على قائمة مسارات الكنسي التي مجورلي المعنية على أساس القيمة الاحتمالية (ع <يعتبر 0.05 بالمهم).
      ملاحظة: يتم حساب القيم أهمية لمسارات الكنسي بواسطة اختبار فيشر بالضبط الذيل بزر الماوس الأيمن. وتشير إلى أهمية احتمال ارتباط جزيئات من بيانات مع المسار الكنسي عن طريق الصدفة العشوائية وحدها.
   5. تأكيد البروتينات الإدخال (MRP4 interactome كما حددها مطياف الكتلة) ضمن قائمة من البروتينات المشاركة في كل مسار.
      ملاحظة: استخدام هذا OPTIOن، لوحظ أن الهيكل الخلوي أكتين شبكة الإشارات الخلوية هي مسار المتضررين الرئيسيين وكيف البروتينات المدخلات تنسجم مع ذلك (الشكل 1). هذا النهج يساعد على تحديد الشبكات التي الجزيئية شأنها أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا وتتأثر البروتينات الاختبار.
   6. استخدم علامة التبويب الشبكة في التحاليل للتعرف على أهم الأمراض والوظائف التي يحتمل أن تكون مرتبطة بشبكة البروتين معينة استنادا إلى عدد من الجزيئات التركيز.
      ملاحظة: يتم إعطاء قيمة النتيجة على أساس البروتينات المعروفة التي يتم تحديدها في إطار مثل الشبكة، والتجمع الخلوي وشبكة منظمة، من خلال المعرفة والأدب والأدلة التجريبية وتركز الجزيئات التي يتم تحديدها من مجموعة البيانات وتصبح جزءا من الشبكة. . من الآن فصاعدا، ويحصل على تصفية الشبكة في المقام الأول على أساس عدد من الجزيئات التركيز.

المجهر 2. المحتوى العالي

1. إعداد الخلايا
   ملاحظة: تم إجراء جميع أعمال زراعة الخلايا تحت الأفقي تدفق الخلية هود الثقافة.
   1. استخدام 96-جيدا microplates للمقايسة التئام الجروح.
   2. معطف صفيحة مع 1٪ محلول فبرونيكتين (تشكيلها في برنامج تلفزيوني)، والحفاظ على لوحة في القياسية CO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   3. إزالة Mrp4 ^{- / -} وMrp4 ^{+ / +} ماوس الليفية الجنينية (MEFS) التي تزرع في 25 سم ² قوارير ثقافة خلية من الحاضنة، وغسل 1 مرة مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين الخلايا لمدة 5 دقائق باستخدام 1 مل من 4X حل التربسين-EDTA.
   4. غسل الخلايا مع المتوسطة كاملة (DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) و resuspend منهم في 5 مل من المتوسط ​​الشامل.
   5. نضح الحل فبرونيكتين من الآبار. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور 30000 الخلايا (يحتاج عدد الخلايا إلى أن يكون الأمثل على أساس نوع من الخلايا) في كل بئر.
   6. تنمو الخلايا إلى 100٪ التقاء في مستوىCO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
2. خلق الجرح
   1. ضمان تمتلئ جميع الآبار مع الحل. ملء الآبار غير المستخدمة مع برنامج تلفزيوني لمنع الأضرار التي لحقت أداة جعل الجرح (على سبيل المثال، WoundMaker).
   2. بعد التأكد 100٪ خلية التقاء، وضع لوحة 96-جيدا داخل أداة جعل الجرح على قاعدة لوحة معدنية والضغط على كتلة دبوس 96-جيدا أسفل.
   3. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي خلايا فكها وإضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة.
   4. إضافة مركبات اختبار - H-89 (50 ميكرومتر، 1: 1000 تخفيف مع وسائل الإعلام كاملة باستخدام 50 الاسهم ملم في DMSO) أو Latrunculin ب (1 ميكرومتر، 1: 1000 تخفيف مع وسائل الإعلام كاملة باستخدام 1 الأسهم ملم في DMSO) في هذه المرحلة .
   5. وضع لوحة فحص داخل القارئ عند 37 درجة مئوية ومراقبة الهجرة خلال الفترة التجريبية.
3. الهجرة خلية المراقبة
   ملاحظة: تم رصد هجرة الخلية باستخدام المجهر وبرامج العلاقات العامةovided مع نظام المجهر عالية المحتوى. استخدام 96-جيدا microplates يضمن أن الجروح تتم مراقبتها تلقائيا بواسطة المجهر وسجلت من قبل البرنامج.
   1. تعيين البرنامج لمسح لوحة فحص كل ساعة لفحوصات الترحيل باستخدام علامة التبويب جدول الفحص. تحديد وقت البدء لا يقل عن 15 دقيقة بعد وضع لوحة فحص داخل القارئ للسماح للموازنة قبل التصوير.
   2. حدد علبة واختيار نوع السفينة (96 جيدا صفيحة) ونوع التجربة (خدش الجرح).
   3. حدد الهدف 10X واختيار المعلمات التصوير على النقيض من المرحلة. حدد الآبار التي تحتاج إلى أن تفحص باستخدام الخيار تحرير مسح نمط.
   4. تحديد مجموعة من العلاجات وأي مكررات عن طريق اختيار علامة التبويب خصائص ووضع خريطة لوحة. المسح يمكن وقفها في أي وقت بناء على حالة تجريبية.
4. تحليل البيانات
   1. بعد الانتهاء من المسح الضوئي، وحدد علامة التبويب عرض السفينة لوحة الفحص. Gس لتحليل المرافق المهمة وحدد إطلاق تحليل جديد وظيفة.
   2. تعيين الجرح الصفر كنوع العمل وتحديد النطاق الزمني ل(نقطة زمنية 0 إلى نقطة زمنية 24 ساعة) تحليل.
   3. حدد الآبار التي سيتم اختيارها لتحليلها من قبل بنقرة واحدة على البئر وانقر فوق "موافق" لبدء تحليل. وبمجرد الانتهاء من التحليل، بوضوح تصور البيانات النسبي كثافة الجرح (RWD) لكل بئر في كل نقطة زمنية باستخدام التصدير إلى الخيار الرسم البياني.
   4. عرض مجموعة الصور على النقيض من المرحلة من كل المقابلة بشكل جيد لمختلف نقاط وقت باستخدام علامة التبويب عرض صورة. اختر بئر معين عن طريق النقر على الخريطة لوحة، وتحديد نقطة زمنية محددة من علامة التبويب نطاق الوقت وانقر فوق علامة التبويب عرض صورة.

3. نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق)

1. إعداد الخلايا
   1. معطف 35 ملم أطباق ذات قاع زجاجي مع 100 ميكرولتر من 1٪ محلول فبرونيكتين (كما هو موضح في القسم 2.1) والاحتفاظ بها فيمعيار CO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   2. نضح الحل فبرونيكتين من لوحات وبأعداد متساوية البذور من خلايا HEK293 (10000 خلية / لوحة) في المتوسط ​​كاملة.
   3. تنمو الخلايا إلى 60-70٪ التقاء في الفيبرونكتين أطباق ذات قاع الزجاج المطلي في معيار CO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
2. ترنسفكأيشن
   1. أداء جميع تعداء عابرة باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   2. قسامة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة إلى قسمين 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي معقمة منفصلة لكل طبق 35 ملم.
   3. إضافة 2 ميكروغرام من الحمض النووي (pmAKAR3 أو pmAKAR3-TA) في أنبوب واحد و 5 ميكرولتر (2.5 أضعاف تركيز الحمض النووي) من كاشف ترنسفكأيشن في أنبوب آخر.
   4. احتضان الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم نقل الحمض النووي المخفف في ترنسفكأيشن أنبوب التي تحتوي على كاشف.
   5. تخلط جيدا واحتضان عند 37° مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
   6. نضح المتوسط ​​قبالة الخلايا وغسلها مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من خالية من المضادات الحيوية DMEM F-12 متوسطة تحتوي على 10٪ FBS إلى الخلايا.
   7. إضافة 507 ميكرولتر من المكورات الحمض النووي الدهون مع وسائل الإعلام إلى الخلايا في كل لوحة، وتخلط بلطف، والحفاظ في الحاضنة CO ₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي (1 ميكروغرام / الأسهم ميكرولتر) والدهون 5 ميكرولتر ل10،000-50،000 الخلايا في كل لوحة.
3. التصوير الخلية الحية
   1. بعد 48 ساعة من ترنسفكأيشن، وإزالة المتوسطة النمو وغسل الخلايا 2 مرات مع محلول ملحي متوازن هانك (HBSS، قبل تحسنت في 37 ° C). إضافة الحجم النهائي من 1.9 مل HBSS إلى خلايا غسلها وجبل لهم على نظام المجهر واسعة المجال المقلوب للتصوير الحنق داخل حسب الطلب 37 ° C حافظ غرفة.
      ملاحظة: في هذا النظام، يتم توفير ضوء الإثارة بواسطة مصباح 300 واط زينون الموهن مع مرشح الكثافة المحايدة مع 50٪ ضوء transmissأيون.
   2. استخدام الهدف 60X. التركيز يدويا على الخلايا وتحديد حقل الأمثل للعرض باستخدام المجهر. تنشيط الحقل المحدد للعرض على شاشة الكمبيوتر باستخدام خيار التركيز "F" على البرنامج. لأداء قياسات الحنق، حدد مجموعة السليم فلتر (CFP / YFP مرشح مع مجموعة 430/25 نانومتر تصفية الإثارة، مزدوج مزدوج اللون شعاع الخائن، والمرشحات الانبعاثات اثنين (470/30 نانومتر لCFP و535/30 نانومتر لالحنق) يدويا.
   3. تصور مضان عن طريق فحص أولا على الخيار قناة CFP / YFP / الحنق تليها النقر التبويب فلور مفتوحة. تحسين كثافة إشارة باستخدام أداة تكثيف في علامة التبويب الكاميرا.
   4. حدد الخلايا معربا عن pmAKAR3 أو pmAKAR3-TA تجنب تشبع من شدة إشارة. استخدام إطار القبض على الشروع في قياس الحنق.
   5. حدد الخيار مرور الزمن والإعداد وقت المسح لمدة 30 دقيقة مع فاصل زمني 30 ثانية. التحقق من الخيار الحنق وضبط الوقت التعرض في 100 مللي ثانية. أدخل تسمية صورةد الصحافة تبدأ لبدء القياس.
   6. بعد خمس نقاط من الوقت وإنشاء خط الأساس، إضافة 25 ميكرومتر من forskolin (5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر الأسهم في الإيثانول، المخفف مع 100 ميكرولتر من HBSS) إلى الخلايا دون إزعاج لوحة ومراقبة الخلايا ليصبح المجموع 30 دقيقة.
4. تحليل البيانات
   ملاحظة: استخدام وحدة حساب ratiometric لتحليل البيانات.
   1. انقر على أداة مختارة على الجانب الأيسر من نافذة الصورة واختيار مستطيل الصلبة من القائمة المنسدلة. اسحب مستطيل على حقل صورة في منطقة خالية من خلية وانقر على الحق في ذلك لأنها مجموعة كخلفية لغرض الطرح الخلفية.
   2. انتقل إلى قناع واستخدام 'إنشاء جديد قناع' الخيار. انتقل إلى أداة اختيار واختيار القلم من القائمة المنسدلة لوضع قناع حول الخلية يدويا لتحديده لقياس. حدد على الأقل 4-6 خلايا لكل حالة.
   3. حدد علامة التبويب قناع وإجراء إحصاءات قناع.
   4. تحقق "قناع كامل، وتوسيع الخيار عبر قناة وحدد المانحة الحنق تطبيع (N-الحنق) (الحنق / CFP). قيمة N-الحنق هو ممثل النشاط PKA في غشاء البلازما.
   5. إضافة طوابع الوقت، ننظر متابعة الجدول وحجم شريط باستخدام شروحه.

لدراسة تأثير MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية، استخدمنا فحص التئام الجروح باستخدام عالية المحتوى المجهري ^14. وقدمت الجروح دقيقة عن الطبقات الوحيدة متموجة من MEFS معزولة عن أي Mrp4 ^{- / -} أو اتخذت Mrp4 ^{+ / +} الفئران، وصور في 1 فترات ساعة لمدة 24 ساعة. لاحظنا معدل الهجرة العالي للMrp4 ^{- / -} MEFS مقارنة Mrp4 ^{+ / +} MEFS (الشكل 2). وتلتئم الجروح تماما في أقل من 15 ساعة لMrp4 ^{- / -} MEFS، في حين أن Mrp4 ^{+ / +} MEFS يتطلب ما يقرب من 20 ساعة لتغطية الجروح.

تراكم الاستقطاب النشاط PKA في طليعة من الخلايا المهاجرة هو حدث في وقت مبكر رئيسيا للهجرة الاتجاه. يمكن رصد النشاط PKA في النقيب في الوقت الحقيقيز استشعار تستند الحنق-pmAKAR3 لPKA ^5،17. للتحقق من خصوصية pmAKAR3 للنشاط PKA، كنا نعامل HEK293 الخلايا overexpressing pmAKAR3 أو نقطة متحولة pmAKAR3-TA، والذي يحتوي على طفرة ثريونين إلى ألانين في المنطقة الركيزة لPKA وبالتالي فهو لا يستجيب لPKA الفسفرة مع 25 ميكرومتر forskolin ، وكيل يحفز المخيم ^14. لقد وجدنا زيادة في إشارة الحنق في خلايا overexpressing pmAKAR3، ولكن ظلت خلايا overexpressing pmAKAR3-TA دون تغيير (الشكل 3). القاعدية الحنق وكانت مستويات أعلى أيضا لخلايا معربا عن pmAKAR3 مقارنة مع الخلايا معربا عن pmAKAR3-TA. وأشارت هذه البيانات إلى أن pmAKAR3 غير محددة جدا للنشاط PKA.

وباختصار، فإن الطرق الموضحة في قسم البروتوكول هي أدوات مفيدة لدراسة الآلية الجزيئية المرتبطة مع الحدث الخلوي معين.

تم التعرف الإبداع تحليل المسار (IPA) من MRP4 Interactome عن طريق IPA الهيكل الخلوي الأكتين المسار باعتباره واحدا من الممرات الكنسي الرئيسية تتأثر interactome MRP4: الشكل 1. تشير قدمت شبكة الأكتين إشارات بروتينات متصلة (أبيض) وعبر تواصلهم مع البروتينات التي تم تحديدها في interactome MRP4 (الوردي) يستدل من الأدب والتجريبية الأدلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. الشكل 2: الفحص باستخدام الميكروسكوب نسبة عالية التئام الجروح Mrp4 ^{+ / + وMrp4 - / -} كانت تزرع الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) على fibronectin المغلفة أطباق 96-جيدا، وقدمت الجروح في الطبقات الوحيدة على وجه التحديد باستخدام 96-دبوس الجرح صانع. وتظهر الصور التمثيلية في نقاط زمنية مختلفة مع التكبير 10x. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): فورستر الرنين نقل الطاقة (الحنق) القائم على قياس آخر PKA باستخدام pmAKAR3 مجسات التمثيلية الصور الزائفة لون N-الحنق مع 60X التكبير لHEK293 الخلايا transfected مع جهاز استشعار pmAKAR3 وأجهزة الاستشعار pmAKAR3-TA قبل وبعد العلاج forskolin هي. عرض (لوحات العليا). تم التقاط الصور في كل لوحة من نفس مجال الرؤية. يشير شريط اللون حجم N-الحنق. الرسم البياني خط (اللوحة السفلية) يمثل التغير في مستويات N-الحنق بعد المعاملهر مع forskolin. تمثل البيانات بمعدل لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة (يعني ± SEM، ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing^1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis^24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.

Using high-content microscopy¹⁸, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts¹⁴. In contrast to the conventional scratch wound assay, the microscopy here conducts the wound healing assay in an automated convenient, consistent and high-throughput manner. The software analyzes the cell migration rate based on three separate metrics: i) change in wound width, ii) change in cell confluence within the wound region, and iii) relative wound density (RWD). RWD is a self-normalized metric that measures the spatial cell density inside the wound area relative to the spatial cell density outside of the wound area. Therefore, it is not affected by changes in cell density due to cell proliferation and provides very specific information regarding cell migration which is otherwise difficult to be obtained by the conventional scratch wound assay²⁶. Initially, at the 0 time point, the RWD will be 0% and upon complete wound healing, the RWD will be 100%. All of these metrics are calculated by custom-made software with inbuilt algorithms and the migration information is automatically generated for every time point. The assay is easy to perform but proper washing (70% ethanol) and handling (inside the hood) of the wound-maker is important to prevent contamination. Our data suggested that the RWD kinetics for Mrp4^-/- MEFs are significantly higher compared to Mrp4^+/+ MEFs.

During migration, cells polarize into leading and trailing edges that ultimately pull the cell body toward the direction of migration^1,27. Distinct and segregated signaling events at different regions of a moving cell ensure the polarization process. Polarized accumulation of cAMP and subsequent activation of PKA at the leading edge is a key early step in directional cell migration⁵. Since MRP4 has very high affinity for cAMP (Km = 45 µM)¹², we hypothesize that the effect of MRP4 on cell migration is cAMP-dependent. To identify the proteins acting downstream of MRP4 and simultaneously interacting with MRP4, we characterized MRP4-containing macromolecular complexes by mass-spectrometry. The MRP4 interactome was subjected to multiple analyses including generation of protein networks, path maps, and functional integration to the canonical pathways of the cellular signaling and their respective pictorial representation through the use of IPA. In general, IPA allows scientific users to recognize the molecular and physiological contexts of their genes and proteins of interest. However the analysis is completely based on the literature and experimental evidences. Novel interactions cannot be suggested by IPA. But it can identify which network, the proteins of interest, can potentially form. Additionally users can identify the top diseases and functions that are potentially linked to a particular protein network based on the confidence level (P value). Of interest to our study, the actin cytoskeleton pathway was a major affected pathway with a P value of 6.75 x 10^-4. This comprehensive approach also revealed that F-actin is a major protein target for MRP4 and cAMP is the key mediator¹⁷. Based on these data, we further studied the underlying molecular mechanisms.

To understand the effect of MRP4 on cAMP dynamics and PKA activity during the course of cell migration, we used FRET-based live-cell imaging techniques. Using FRET-based sensors for cAMP and PKA activity, we confirmed higher cAMP accumulation and higher PKA activity at the leading edge of migrating and polarized fibroblasts^22,28. We further demonstrated that in the absence of MRP4, MEFs have more polarized cAMP and PKA activity, which in turn facilitates cortical actin formation and cell migration. The high-content microscopy-based wound-healing assay showed that the effect of MRP4 on cell migration is completely abolished by PKA inhibition or actin disruption, which indicates a direct role of PKA and actin as downstream targets¹⁷. Unlike conventional cell population-based assays such as ELISA, use of a FRET-based sensor allows us to identify the downstream effector kinases that regulate various signaling processes and detect the correlation between cyclic nucleotide dynamics and their corresponding kinase activity in real time and space. Additionally it can discriminate intracellular and intercellular heterogeneity during the signaling events. For example it can detect the difference in PKA dynamics in the cells at the wound edge compared to the cells inside the monolayer and away from the wound edge⁵, whereas ELISA based assays can only detect total intracellular cyclic nucleotide or PKA level in a sample^14,17. However the transfection efficacy of particular cell types can be a limiting factor for conducting FRET based assays but the highly efficient transfection reagents can overcome this problem.

Together, our results indicate that in addition to conferring drug resistance, MRP4 also plays important physiological roles by modulating intracellular cAMP dynamics. Using three unique approaches, i) high-content microscopy¹⁸, ii) IPA¹⁵, and iii) FRET^5,28, we have begun to unravel the previously undefined role of MRP4 in cell migration. In general, these useful scientific techniques will allow us to identify new downstream targets of any protein of interest and explore novel molecular mechanisms involved in particular pathological or physiological cell responses. Where IPA provides useful information regarding downstream effectors of the protein of interest and potential regulatory networks; FRET-based live imaging can monitor compartmentalized signaling in real time. High-content microscopy is a convenient high-throughput screening tool to monitor and analyze physiological events, such as cell migration and cell proliferation, over a period of time as a final readout.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.