Методы исследования Mrp4 содержащих макромолекулярных комплексов в регуляции миграции фибробластов

MRP4 регулирует различные циклические нуклеотид-зависимой сигнализации событий, включая недавно выяснены роль в миграции клеток. Мы описываем прямой, но многогранный подход к распутать вниз по течению молекулярные мишени из MRP4 что приводит к идентификации уникального MRP4 интерактома, который играет ключевую роль в отлаженной регулирования миграции фибробластов.

Множественная лекарственная устойчивость белка 4 (MRP4) является членом АТФ-связывающего кассетного семейства мембранных транспортеров и является эндогенным Отток транспортировщик циклических нуклеотидов. Модулируя внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов, MRP4 может регулировать несколько циклических нуклеотидов-зависимых клеточных событий, включая миграцию клеток. Ранее мы показали, что при отсутствии MRP4, фибробласты содержат более высокие уровни внутриклеточного циклических нуклеотидов и могут мигрировать быстрее. Для того, чтобы понять основные механизмы этого факта, мы приняли непосредственное еще многосторонний подход. Во-первых, мы выделили потенциальные взаимодействующий белок комплексы MRP4 из MRP4 системы клеток избыточная экспрессия с использованием иммунопреципитации с последующим масс-спектрометрии. После идентификации уникальных белков в MRP4 интерактома, мы использовали изобретательности Pathway Analysis (IPA), чтобы исследовать роль этих белок-белковых взаимодействий в контексте передачи сигнала. Мы осветил роциальная роль белкового комплекса MRP4 в миграции клеток и идентифицировали F-актина как главный медиатор влияния MRP4 на миграцию клеток. В этом исследовании также была подчеркнута роль цАМФ и цГМФ в качестве ключевых игроков в миграционных явлений. Использование высокой содержанием микроскопии, мы проводили анализы клеточного миграции и наблюдали, что эффект MRP4 на миграцию фибробластов полностью отменена дезорганизацией цитоскелета или ингибирование цАМФ-зависимой киназы А (РКА). Для визуализации сигналов модуляций в мигрирующим камере в режиме реального времени, мы использовали датчик FRET на основе измерения активности РКА и обнаружили, наличие более поляризованным активности РКА вблизи передней кромки мигрирующего Mrp4 ^{- / -} фибробласты, по сравнению с Mrp4 ^{+ / +} фибробласты. Это, в свою очередь, увеличилась корковой актина образование и дополненное процесс миграции. Наш подход позволяет идентифицировать белки, действующие вниз по течению к MRP4 и дает нам чрезмерновид механизма, участвующего в MRP4-зависимой регуляции миграции фибробластов.

Миграция клеток представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Исследования показали, что во время миграции клеток поляризованы в передней и задней кромок. Присоединившись к внеклеточного матрикса, передний край обеспечивает тягу, необходимую для тела клетки, чтобы двигаться вперед. И, наконец, задняя кромка релизы в задние вложения и завершает ^1,2 цикла миграции.

Ячейка поляризации для эффективной миграции клеток регулируется пространственной сегрегации внутриклеточной сигнализации. Клеточные вторичные мессенджеры, такие как цАМФ, опосредуют обособления сигнальных событий , необходимых для отлаженной направленной миграции клеток ^3,4. Льготные скопления цАМФ и цАМФ-зависимой киназы РКА активности на переднем крае играют ключевую роль в направленной миграции клеток ^5,6. Фосфорилированием небольшие GTPases, такие как Рас-связанной С3 ботулинического токсина субстрата (Rac) и контроль клеточного деления белка 42 гомолога или Cdc42, PKАктивирует актин-родственный белок , 2/3 (Arp 2/3) на передней кромке и вызывает образование ламеллоподиях ^7-9. РКА также фосфорилирует анти укупорки агента, сосудорасширяющее стимулируется фосфопротеин (VASP), тем самым регулирует колебательные циклы расширения мембраны и втягивании ^10,11.

В клетках, уровни цАМФ регулируются тремя основными процессами: я) синтезом аденилатциклазы, II) деградации под действием фосфодиэстеразы и III) перевозки по мембраносвязанных эффлюксных транспортеров ^3. Множественная лекарственная устойчивость белка 4 (MRP4), член АТФ-связывающего кассетного семейства (ABC) мембранных транспортеров, функции как эндогенный эффлюксного переносчика циклических нуклеотидов. Поэтому MRP4 может регулировать уровни внутриклеточного цАМФ и цАМФ-зависимой клеточной сигнализации ^11-13. Ранее мы показали , что в Mrp4 ^{- / -} фибробласты содержат относительно более высокие уровни циклических нуклеотидов и мигрируют быстрее Compared к Mrp4 ^{+ / +} фибробластов ^14. Мы также сообщали, двухфазный эффект циклических нуклеотидов на миграцию фибробластов. На основе предыдущих исследований , и обнаружение того, что наша Mrp4 ^{- / -} фибробласты содержат более поляризованной цАМФ в процессе миграции, мы предположили , что этот MRP4-опосредованной регулирование миграции фибробластов является цАМФ зависимой. Для того чтобы понять механизм вниз по течению, мы приняли непосредственное еще многосторонний подход.

Для того, чтобы идентифицировать белки, связанные и во взаимодействии с MRP4, мы иммуноосажденного MRP4 содержащих высокомолекулярные комплексы из клеток НЕК293, что более выражающих MRP4. Использование масс-спектрометрии, мы идентифицировали несколько MRP4-взаимодействующих белков и анализировали их взаимосвязанности с помощью изобретательности Pathway Analysis (IPA). МПА является полезным инструментом для анализа белок-белковых взаимодействий (как структурные, так и функциональные) и исследовать их вклад в частности физиологических и патологическихсобытия , основанные на литературе и экспериментальных доказательств ^15,16. АПИ показали , что F-актин является основным объектом вниз по течению MRP4 в контексте миграции клеток , где цАМФ и цГМФ , являются ключевыми молекулами ¹⁷ передачи сигналов. Эти данные были подтверждены в дальнейшем высоким содержанием микроскопии. Высокое содержание-микроскопия может захватывать и анализировать поведение клеток , таких как миграция клеток в более удобной, точной и высокой пропускной способностью ¹⁸ образом. Данные высокомолекулярные содержания микроскопии показал , что влияние MRP4 на миграцию фибробластов полностью отменена после разрушения актинового цитоскелета или ингибирование ПКА ^17.

Кроме того, мы использовали Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) основе датчика РКА следить за динамикой рКа в миграции клеток в реальном времени. FRET на основе датчиков киназы , как правило , состоят из специфических субстратного фосфорилирования пептидов фланкированных CFP и YFP флуорофоров ^19-21. pmAKAR3 является улучшенной и меняmbrane целевой FRET основе датчика РКА , который содержит Forkhead-ассоциированный домен 1 (FHA1) и последовательность ПКА субстрат LRRATLVD ^5,22. Фосфорилирование pmAKAR3 каталитическими увеличивается субъединиц рКа FRET сигнала между CFP и YFP ^19. Вставка липидного домена модификации в датчике мишенях к плазматической мембране для мониторинга динамики рКа, в частности , в мембранном отсеке ^23.

Используя pmAKAR3, мы показали , что передний край миграции Mrp4 ^{- / -} фибробласты экспонируются более поляризованный активность РКА чем Mrp4 ^{+ / +} фибробласты, что в свою очередь увеличило корковой образование актина на передней кромке ¹⁷ ячейки. Вместе эти события привели к улучшению клеточной поляризации и миграции быстрее направленной клеток в отсутствие MRP4. Наш конкретный и прямой подход определил ключевые вниз по течению цели для MRP4 и обеспечивает важное, но, какдо сих пор неизученными механизм MRP4-зависимого регулирования миграции фибробластов.

1. Изобретательность Тропинка анализ

1. Выгрузка Белково-интерактом Dataset
   1. Вставьте белки / гены, представляющие интерес в электронной таблице с их уникальными идентификаторами генов (предпочтительно генных символов и чисел идентификаторов гена, полученных с помощью масс-спектрометрических данных).
   2. Назначают один столбец в таблице для идентификационный номер гена и один столбец для наблюдательной значения (например., Складывающиеся изменение или р-значение). Выберите 'содержит заголовок столбца' для просмотра заголовков столбцов.
   3. Загрузить набор данных на МПА, нажав на вкладке загрузки набора данных и выбора электронных таблиц, упомянутых выше. Выберите вкладку гибкий формат, и выберите соответствующую категорию идентификатора гена.
      Примечание: Гибкий формат набора данных преодолевает спецификации форматирования для загрузки.
   4. После того, как появится набор данных, выберите идентификатор и наблюдения столбцов. Убедитесь, что все белки (MRP4 интерактомных, как это определено с помощью масс-SPectrometry) отображаются путем проверки на вкладке Сводка набора данных. Набор данных готов к желаемого анализа.
2. Анализ данных
   Примечание: Описываются частичные виды использования функций АПИ, которые были использованы в этом исследовании.
   1. После загрузки MRP4 интерактомные с их именами генов в качестве уникальных идентификаторов, нажмите на новый и выбрать основной анализ в верхнем левом углу меню программного обеспечения ПНД.
   2. Установите значение выражения отсечек для интенсивности в соответствии с типом эксперимента (Intensity значение 100 рекомендуется для анализа).
   3. Вычислить загнутой изменение экспрессии при подготовке набора данных, если контрольные и экспериментальные условия участвуют и включить его в качестве части файла набора данных, если необходимо выполнить анализ сравнения (отсечка значение в 1,5 раза изменения обычно рекомендуется для анализа ).
      Примечание: После завершения анализа основного, можно получить несколько разделов анализов. Первая закладка показывает сводку гое общие анализы и предполагает верхние канонические пути, вверх по течению регуляторы, молекулярные и клеточные функции, а также сети среди других; все рассчитывается на основании уровня достоверности (р значение) и расположены в порядке возрастания значение р.
   4. Открыть основные канонические пути (с использованием опции открытый путь) в виде больших молекулярных сетей, которые изобразительно поперечные Talking, перекрывающийся, и затронутых сигнальных путей.
      Посмотрите на список канонических путей, которые вовлечены главно на основе значения р (р <0,05 считается значительным).
      Примечание: Значения значимости для канонических путей вычисляются путем точного критерия Фишера право хвостами. Значение указывает на вероятность объединения молекул из набора данных с каноническим пути одной только случайности.
   5. Проверьте входные белки (MRP4 интерактомные, как это определено с помощью масс-спектрометрии) среди списка белков, участвующих в каждом пути.
      Примечание: С помощью этого Optioп, было отмечено , что клеточная актин цитоскелета сети сигнализации является основным затрагиваемой путь и как входные белки вписываться в нее (рисунок 1). Такой подход позволяет определить, какие молекулярные сети будут тесно связаны и влияют испытания белков.
   6. Используйте вкладку сети в анализе выявления наиболее заболеваний и функции, которые потенциально связаны с конкретной белковой сети на основе числа молекул фокус.
      Примечание: Значение оценка дается на основе известных белков, которые определяются как часть сети , например, сотовой сборки и организации сети, с помощью литературы знаний и экспериментальных доказательств и сосредоточиться молекулы, которые определены из набора данных и стать частью сети. , В дальнейшем, сеть фильтруется в первую очередь на основе числа молекул фокус.

2. Высоковольтный содержание Микроскопия

1. Получение клеток
   Примечание: Вся культура клеток работа была выполнена под горизонтальным потоком капот культуре клеток.
   1. Использование 96-луночного микропланшета для заживления ран анализа.
   2. Покрыть микропланшет с 1% -ным раствором фибронектина (восстанавливали в PBS), и держать пластину в стандартной СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
   3. Удалить Mrp4 ^{- / -} и Mrp4 ^{+ / +} мышь эмбриональных фибробластов (МЭФ) выращивали в 25 кв.см колбах для культивирования клеток из инкубатора, мыть 1 раз с PBS и Trypsinize клетки в течение 5 мин с использованием 1 мл 4 - кратным раствором трипсин-ЭДТА.
   4. Промывают клетки с полной средой Игла (DMEM, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина) и ресуспендируют их в 5 мл полной среды.
   5. Аспирируйте фибронектина раствора из лунок. Граф клеток с использованием гемоцитометра и семян 30000 клеток (количество клеток должна быть оптимизирована в зависимости от типа клеток) в каждую лунку.
   6. Grow клетки до 100% слияния в стандартномСО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 24 ч.
2. Создание Рана
   1. Убедитесь, что все лунки заполняют раствором. Заполните неиспользованные лунки с PBS , чтобы предотвратить повреждение инструмента раны решений (например., WoundMaker).
   2. После подтверждения 100% слияния клеток, поместите 96-луночного планшета внутри инструмента раневой делая на опорной плите металла и нажмите контактный блок 96-луночного вниз.
   3. Вымойте клетки три раза PBS, чтобы удалить любые освобожденные клетки и добавить 100 мкл полной среды.
   4. Добавьте тестируемые соединения - Н-89 (50 мкМ; 1: 1000 разбавление полной среды с использованием 50 мМ акции в ДМСО) или латрункулин B (1 мкМ; 1: 1000 разбавление полной среды с использованием 1 мМ акции в ДМСО) на данном этапе ,
   5. Поместите планшет для анализа внутри считывателя при 37 ° С и контролировать миграцию в течение экспериментального периода.
3. Мониторинг миграции клеток
   Примечание: Миграция клеток контролировали с помощью микроскопа и программного обеспечения прovided с системой микроскопии высокого содержания. Использование 96-луночных микропланшетов гарантирует, что раны автоматически контролируется микроскопом и регистрируется с помощью программного обеспечения.
   1. Установите программное обеспечение для сканирования планшета для анализа каждый час для миграции анализов с помощью вкладки Расписание сканирования. Выберите время начала, по крайней мере 15 минут после размещения планшета для анализа внутри читателя, чтобы позволить уравновешивание до начала съемки.
   2. Выберите лоток и выбрать тип судна (96-луночный микропланшет) и тип эксперимента (Царапина Wound).
   3. Выберите цель 10X и выбрать параметры изображения фазового контраста. Выберите лунки, которые должны быть отсканированы с помощью опции редактирования шаблона сканирования.
   4. Укажите обработок групп и любых повторах, выбрав вкладку Свойства и настройки карты пластины. Сканирование может быть остановлена ​​в любой момент на основе экспериментальных условиях.
4. Анализ данных
   1. После того, как сканирование будет сделано, выберите вкладку просмотра сосуд для анализа пластины. гO для утилит заданий анализа и выбора запуска нового анализа работы.
   2. Установить царапанию рану как тип задания и выберите диапазон времени для (временной точки от 0 до 24 час момент времени) анализ.
   3. Выберите ячейки, которые будут выбраны для анализа с помощью одного нажатия на лунку и нажмите кнопку "OK", чтобы начать анализ. После того, как анализ делается, графически визуализировать данные относительной плотности Рана (RWD) для каждой лунки в каждый момент времени с помощью экспорта в опции графа.
   4. Просмотр фазового контраста набор изображений каждой лунки, соответствующие различные промежутки времени, используя вкладку Вид изображения. Выберите конкретной скважины, нажав на карте пластины, выберите конкретный момент времени на вкладке временного диапазона и нажмите на вкладку Вид изображения.

3. Ферстер-резонансная передача энергии (FRET)

1. Получение клеток
   1. Coat 35 мм со стеклянным дном посуды с 100 мкл 1% -ного раствора фибронектина (как описано в разделе 2.1) и держать их встандартный СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
   2. Аспирируйте фибронектин раствор из пластин и семенных равное число клеток НЕК293 (10000 клеток / планшет) в полной среде.
   3. Grow клетки до 60-70% слияния в фибронектина покрытием со стеклянным дном блюда в стандартной СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 24 ч.
2. трансфекция
   1. Выполнение всех временных трансфекций с использованием коммерческого реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя.
   2. Аликвоты в 250 мкл полной среды в двух отдельных 1,5 мл стерильного центрифужные пробирки для каждого 35 мм блюдо.
   3. Добавить 2 мкг ДНК (pmAKAR3 или pmAKAR3-TA) в одной пробирке и 5 мкл (2,5 раза концентрацию ДНК) реагента трансфекции в другую пробирку.
   4. Инкубировать пробирки в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем передать разбавленный ДНК в реагент, содержащей трубку трансфекции.
   5. Тщательно перемешать и инкубировать при температуре 37° С в течение еще 30 мин.
   6. Аспирируйте среду выключения клеток и мыть их один раз PBS. Добавить 1 мл DMEM антибиотика свободной F-12 среды, содержащей 10% FBS к клеткам.
   7. Добавьте 507 мкл ДНК-липидных конъюгата со средой к клеткам в каждую тарелку, осторожно перемешать и хранить в СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 48 часов. С помощью 2 мкг ДНК (1 мкг / мкл) и наличии 5 мкл липидного для 10000-50000 клеток в каждой чашке.
3. Live-ячейки изображения
   1. После 48 ч трансфекции, удалить ростовой среды и промыть клетки 2 раза с Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS, предварительно нагретого до 37 ° С). Добавьте конечный объем 1,9 мл HBSS к промытым клеткам и смонтировать их на инвертированный микроскоп систему широкого поля для визуализации FRET внутри выполненного на заказ 37 ° С поддерживается камеру.
      Примечание: В этой системе свет возбуждения обеспечивается лампой 300 Вт ксеноновой ослабляется с нейтральным фильтром плотности с 50% света ступиона.
   2. Используйте цель 60X. Вручную сосредоточиться на клетки и установить оптимальное поле зрения с помощью микроскопа. Активировать выбранное поле зрения на экране компьютера с помощью опции Фокус "F" на программное обеспечение. Для выполнения измерений FRET, выбрать правильный набор фильтров (CFP / YFP набор фильтров с 430/25 нм возбуждения фильтр, двойной сплиттер дихроичная луча и два фильтра выбросов (470/30 нм для CFP и 535/30 нм для FRET) вручную.
   3. Визуализируйте флуоресценции сначала проверить на опции канала CFP / YFP / FRET затем нажав открытую вкладку фтористой. Повышение интенсивности сигнала с помощью инструмента интенсификации на вкладке камеры.
   4. Выделите ячейки, выражающие pmAKAR3 или pmAKAR3-TA избежать насыщения интенсивности сигнала. Используйте окно захвата, чтобы начать измерение ладу.
   5. Выберите опцию покадровой и настройка по времени сканирования в течение 30 мин с интервалом 30 сек. Отметьте опцию FRET и установить время экспозиции в 100 мс. Введите метку изображения апd Нажмите кнопку Старт, чтобы начать измерение.
   6. После пяти временных точек и установления базовой линии, добавить 25 мкМ форсколина (5 мкл 10 мкМ запаса в этаноле, разбавляют 100 мкл HBSS) к клеткам, не нарушая пластины и контролировать клетки в течение в общей сложности 30 мин.
4. Анализ данных
   Примечание: Используйте радиометрический модуль расчета для анализа данных.
   1. Нажмите на инструмент выбора на левой стороне окна изображения и выберите сплошной прямоугольник из выпадающего меню. Перетащите прямоугольник на поле изображения в свободной области ячеек и щелкните правой кнопкой мыши на нем, чтобы установить его в качестве фона для целей вычитания фона.
   2. Перейти к маске и использовать "создать новую маску" вариант. Перейти к выберите инструмент и выбрать перо из выпадающего меню, чтобы вручную сделать маску вокруг ячейки, чтобы выбрать его для измерения. Выберите по крайней мере 4-6 клеток в состоянии.
   3. Выберите вкладку Mask и выполнять статистические маски.
   4. Проверьте "Весь маска", разверните вариант кросс-канал и выбрать донора нормализованное FRET (N-FRET) (FRET / СФП). Значение N ладов является представителем активности РКА на плазматической мембране.
   5. Добавьте временные отметки, справочную таблицу и масштабную линейку с помощью аннотаций.

Для изучения влияния MRP4 на миграцию фибробластов, мы использовали ранозаживляющим анализа с использованием высокого содержания микроскопии ^14. Точные раны были сделаны на сливных монослоев MEFs , выделенных из либо Mrp4 ^{- / -} или Mrp4 ^{+ / +} мышей, и изображения были взяты через 1 час с интервалом в течение 24 часов. Мы наблюдали более высокую скорость миграции для Mrp4 ^{- / -} MEFs по сравнению с Mrp4 ^{+ / +} МЭФ (рисунок 2). Раны полностью зажила менее чем за 15 часов работы, для Mrp4 ^{- / -} MEFs, в то время как Mrp4 ^{+ / +} МЭФ требуется почти 20 часов , чтобы покрыть раны.

Поляризованные накопление активности РКА на переднем крае мигрирующих клеток является ключевым событием в начале для направленной миграции. активность ПКА можно отслеживать в режиме реального времени USINг датчик pmAKAR3 FRET на основе ПВА для ^5,17. Для проверки специфичности pmAKAR3 для деятельности РКА, мы относились к НЕК293 с гиперэкспрессией pmAKAR3 или точку мутант pmAKAR3-ТА, который содержит мутацию треонина в аланин в области подложки для ПКА и, следовательно, не реагирующий на РКА фосфорилирования с 25 мкМ форсколина , палаточный лагерь-индуцирующий агент ^14. Мы обнаружили увеличение сигнала FRET в клетках с гиперэкспрессией pmAKAR3, но клетки сверхэкспрессией pmAKAR3-TA осталась неизменной (рисунок 3). Базальная FRET уровни были также выше для клеток, экспрессирующих pmAKAR3 по сравнению с клетками, экспрессирующими pmAKAR3-TA. Эти данные указывают на то, что pmAKAR3 очень специфична для деятельности РКА.

Таким образом, методы, описанные в разделе протокола являются полезными инструментами для изучения молекулярного механизма, связанного с конкретным событием клеточного.

Рисунок 1:. Изобретательность Тропинка анализ (МПА) из MRP4 интерактомные Использование IPA актина цитоскелета путь был определен в качестве одного из основных канонических путей , затронутых MRP4 интерактома. Представленные сети сигнализации актина указывает на подключенные белки (белый) и их кросс - связь с белками , идентифицированных в MRP4 интерактома (розовый) выведенного из литературных и экспериментальных доказательств. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

. Рисунок 2: ранозаживляющие Пробирной с использованием высокого содержания микроскопии Mrp4 ^{+ / + и} Mrp4 ^{- / -} мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) выращивали на fibroneCTIN покрытием 96-луночных планшетах, и раны в монослоев были сделаны именно с использованием 96-контактный разъем раной производителя. Представитель изображений в различные моменты времени показаны с 10 - кратным увеличением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Ферстер - резонансная передача энергии (FRET) основе измерения РКА активности с использованием pmAKAR3 датчиков Представительные псевдо-цветных изображений N-FRET с 60X увеличением для НЕК293 клеток , трансфецированных с датчиком pmAKAR3 и датчиком pmAKAR3-TA до и после форсколина лечения. показанные (верхние панели). Изображения в каждой панели были захвачены из того же поля зрения. Цвет полоса указывает на величину N-ладу. На линейном графике (нижняя панель) представляет собой изменение уровней N-FRET после ЛЕЧЕНИИт с форсколина. Данные представляют собой среднее по меньшей мере трех независимых экспериментов (среднее значение ± SEM, п = 3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing^1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis^24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.

Using high-content microscopy¹⁸, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts¹⁴. In contrast to the conventional scratch wound assay, the microscopy here conducts the wound healing assay in an automated convenient, consistent and high-throughput manner. The software analyzes the cell migration rate based on three separate metrics: i) change in wound width, ii) change in cell confluence within the wound region, and iii) relative wound density (RWD). RWD is a self-normalized metric that measures the spatial cell density inside the wound area relative to the spatial cell density outside of the wound area. Therefore, it is not affected by changes in cell density due to cell proliferation and provides very specific information regarding cell migration which is otherwise difficult to be obtained by the conventional scratch wound assay²⁶. Initially, at the 0 time point, the RWD will be 0% and upon complete wound healing, the RWD will be 100%. All of these metrics are calculated by custom-made software with inbuilt algorithms and the migration information is automatically generated for every time point. The assay is easy to perform but proper washing (70% ethanol) and handling (inside the hood) of the wound-maker is important to prevent contamination. Our data suggested that the RWD kinetics for Mrp4^-/- MEFs are significantly higher compared to Mrp4^+/+ MEFs.

During migration, cells polarize into leading and trailing edges that ultimately pull the cell body toward the direction of migration^1,27. Distinct and segregated signaling events at different regions of a moving cell ensure the polarization process. Polarized accumulation of cAMP and subsequent activation of PKA at the leading edge is a key early step in directional cell migration⁵. Since MRP4 has very high affinity for cAMP (Km = 45 µM)¹², we hypothesize that the effect of MRP4 on cell migration is cAMP-dependent. To identify the proteins acting downstream of MRP4 and simultaneously interacting with MRP4, we characterized MRP4-containing macromolecular complexes by mass-spectrometry. The MRP4 interactome was subjected to multiple analyses including generation of protein networks, path maps, and functional integration to the canonical pathways of the cellular signaling and their respective pictorial representation through the use of IPA. In general, IPA allows scientific users to recognize the molecular and physiological contexts of their genes and proteins of interest. However the analysis is completely based on the literature and experimental evidences. Novel interactions cannot be suggested by IPA. But it can identify which network, the proteins of interest, can potentially form. Additionally users can identify the top diseases and functions that are potentially linked to a particular protein network based on the confidence level (P value). Of interest to our study, the actin cytoskeleton pathway was a major affected pathway with a P value of 6.75 x 10^-4. This comprehensive approach also revealed that F-actin is a major protein target for MRP4 and cAMP is the key mediator¹⁷. Based on these data, we further studied the underlying molecular mechanisms.

To understand the effect of MRP4 on cAMP dynamics and PKA activity during the course of cell migration, we used FRET-based live-cell imaging techniques. Using FRET-based sensors for cAMP and PKA activity, we confirmed higher cAMP accumulation and higher PKA activity at the leading edge of migrating and polarized fibroblasts^22,28. We further demonstrated that in the absence of MRP4, MEFs have more polarized cAMP and PKA activity, which in turn facilitates cortical actin formation and cell migration. The high-content microscopy-based wound-healing assay showed that the effect of MRP4 on cell migration is completely abolished by PKA inhibition or actin disruption, which indicates a direct role of PKA and actin as downstream targets¹⁷. Unlike conventional cell population-based assays such as ELISA, use of a FRET-based sensor allows us to identify the downstream effector kinases that regulate various signaling processes and detect the correlation between cyclic nucleotide dynamics and their corresponding kinase activity in real time and space. Additionally it can discriminate intracellular and intercellular heterogeneity during the signaling events. For example it can detect the difference in PKA dynamics in the cells at the wound edge compared to the cells inside the monolayer and away from the wound edge⁵, whereas ELISA based assays can only detect total intracellular cyclic nucleotide or PKA level in a sample^14,17. However the transfection efficacy of particular cell types can be a limiting factor for conducting FRET based assays but the highly efficient transfection reagents can overcome this problem.

Together, our results indicate that in addition to conferring drug resistance, MRP4 also plays important physiological roles by modulating intracellular cAMP dynamics. Using three unique approaches, i) high-content microscopy¹⁸, ii) IPA¹⁵, and iii) FRET^5,28, we have begun to unravel the previously undefined role of MRP4 in cell migration. In general, these useful scientific techniques will allow us to identify new downstream targets of any protein of interest and explore novel molecular mechanisms involved in particular pathological or physiological cell responses. Where IPA provides useful information regarding downstream effectors of the protein of interest and potential regulatory networks; FRET-based live imaging can monitor compartmentalized signaling in real time. High-content microscopy is a convenient high-throughput screening tool to monitor and analyze physiological events, such as cell migration and cell proliferation, over a period of time as a final readout.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.