Bölünme Fragmentlerin Algılama ile Akım Ölçümleri birleştiren tarafından Epitel Sodyum Kanalı (ENaC) proteolitik Aktivasyonunun gösteri

Xenopus oocytes içerisinde heterolog olarak ifade epitelyal sodyum kanal (ENaC) proteolitik aktivasyon oosit hücre yüzeyinde iyon kanal bölünme ürünlerinin görünümünü araştırmak için bir biyotinilasyon yaklaşımla akım ölçümleri birleştirerek gösterilebilir laevis. Fonksiyonel olarak önemli bölünme mevkilerinin yer yönlendirmeli mutajenezi kullanarak tespit edilebilir.

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔI_ami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Proteazlar, karmaşık bir düzenleyici sinyal yollarıyla ilgili son derece gelişmiş proteaz cascades, sindirim bağlamında, proteinlerin bilinen proteolitik bozulması kadar çeşitli fizyolojik reaksiyonların katılan enzimlerdir. Proteazlar katalitik aktif sitesine göre, yedi gruba ayrılır: aspartat, asparagin, sistein, glutamik asit, metalo, serin, treonin ve proteazlardır. Farklı proteazlar, her bir proteinin birincil yapısı tahmin etmek kolay değildir ayrı bölünme mevkilerini hedef. MEROPS veritabanı ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) Proteazlarla ve tercihli bölünme sitelerinin geniş bir yelpazede ayrıntılı bilgi sağlar. Fonksiyonel olarak, ilgili bölünme mevkilerinin yer yönlendirmeli mutagenez kullanılarak tespit edilebilir.

İyi ENaC'nın proteolitik işleme th aktivasyonu önemli bir mekanizmadır olduğu saptanmıştırÖzellikle iyon kanalı ^1,2 olduğunu. İlginç bir şekilde, ilgili aside duyarlı iyon kanalı 1a (ASIC1a) fonksiyonu da proteazlar ^3-5 ile modifiye edilebilir ki bir kanıt yoktur. Şu anda bu proteolitik kanal bölünme diğer iyon kanalları ya da taşıyıcıları aktivitesini düzenleyen bir ilgili fizyolojik bir rolü olup olmadığını açık bir soru kalır. Bununla birlikte, iyi proteolitik bölünme G-protein bağlı reseptörler, proteaz tarafından aktive edilen reseptör (PAR) bir grup aktive olduğu saptanmıştır ^6. Çeşitli serin proteazları (örneğin, kanal aktive edici proteazların (cap1-3), kimotripsin, tripsin, furin, plasmin, nötrofil elastaz ve kallikrein) proteolitik ENaC ² etkinleştirmek için gösterilmiştir. Serin proteazlara ilave olarak, proteaz diğer gruplar proteolitik ENaC aktivasyonu dahil olabilir. Gerçekten de, son veriler göstermektedir ki metaloproteinaz meprin-β ⁷ ve sistein proteaz, katepsin ^S-8 Ayrıca, Activate ENaC. Bununla birlikte, aktivasyon için ENaC (pato-) fizyolojik olarak uygun proteazlar, belirlenecek kalır ve dokuya dokudan farklı olabilir.

Proteazlar, tercihen, amino asit sekansında belirli bölgelerindeki parçalamak için bilinir. Örneğin, serin proteaz kimotripsin, aromatik amino asit, fenilalanin ve tirozin kalıntıları sonra yaran belirli bir yarılma modelini göstermektedir. Temel kalıntılar, lisin ya da arginin sonra aksine, serin proteaz tripsin tercihli olarak böler. , Alana-yönelik mutagenez ile üretilen mutasyona uğramış insan γENaC yapıları kullanılarak, heterolog oosit ekspresyon sistemi içinde eksprese ENaC'nın işlevsel olarak ilgili bölünme mevkilerinin ^8-13 tespit edilebilir.

Izole oositlerine ENaC üç birimden (αβγ) için cRNA ile enjekte, ENaC işlevsel olarak bu hücrelerde ifade edilebilir ve plazma membranında mevcut kanallarının aktivitesi ile ölçülebiliriki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği kullanılarak üretilebilir. Diüretik amilorit, belirli bir ENaC inhibitörü, amiloride duyarlı ENaC aracılı bütün hücre akımı bileşen (ΔI _ami) kullanılarak spesifik olmayan kaçak akımlar ya da başka iyon kanalları tarafından yürütülen akımlarından ayrılabilir. Bu nedenle, ΔI _ami değerler genel ENaC aktivitesini yansıtır ve amilorid yokluğunda kaydedilen ilgili bütün hücre akımlardan amilorid varlığında ölçülen bütün hücre akımları çıkarılması ile tespit edilebilir. Bir proteaz ENaC'nın üzerinde uyarıcı bir etkiye sahip olup olmadığını test etmek için, ΔI _ami yani önce ve bir proteaz içeren bir çözelti içinde, oositin inkübasyonundan sonra, aynı oosit iki kez ölçülür. Ikinci ölçüm birinci ΔI _ami bir artış proteolitik ENaC aktivasyonunu gösterir. Kimotripsin ne de tripsin maksimum oosit ekspresyon sistemi içinde ^2,14 ENaC uyarmak için bilinmektedir ve emin olmalarına kullanılabilirrm proteolitik harekete geçirme ENaC oosit belirli bir yığını olarak tespit edilebilir.

Bütün hücre akım ölçümleri paralel olarak, biyotinilasyon yaklaşım ⁹ ENaC'nın görünümü ile ilişkilidir hücre yüzeyinde fragmanları bölünmeye ΔI _ami artış proteazlara maruz kaldığında oosit tespit olup olmadığını araştırmak için kullanıldı. Hücre yüzeyindeki proteinler biotin ile etiketlendi ve Neutravidin etiketli agaroz tanelerine biyotinile edilmiş proteinlerin bağlanması ile hücre içi proteinlerin ayrılabilir. Biyotinlenmiş proteinler western blot ile analiz edilebilir. Hücre yüzeyinde γENaC bölünme fragmanları, γENaC C-terminalinde bir epitopa karşı yönlendirilen özel bir antikor kullanılarak tespit edilebilir. Işlevsel olarak ilgili bölünme sitesi (ler) i tespit etmek için, bölünme mevkilerinin yer yönelimli mutagenez kullanılarak mutasyona uğratılabilir öngördü. Vahşi tipli ve mutant kanalları s den oosit kullanılarak paralel deneyler ile karşılaştırılırame toplu.

Bu metodolojik yaklaşım sayesinde ENaC aracılı bütün hücre akımların proteolitik harekete geçirme hücre yüzeyinde fragmanlarının bölünmeye ENaC'nın zamana bağımlı bir görünüm ile ilişkili olduğunu ilk kez gösterilmiştir. Bu sonuçlar kanal bölünme ve kanal aktivasyonu arasında nedensel bir bağlantı olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, iki-elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği, plazmin için, fonksiyonel olarak bağlantılı yarılma siteleri, ^13, Kimotripsin ve katepsin ^S-8 ile birlikte varsayılan yarılma siteleri yer yönelimli mutagenez kullanılarak tespit edilmiştir.

Xenopus Oositleri ve cRNA Mikroenjeksiyon 1. Izolasyonu

1. Yetişkin dişi Xenopus laevis'ten oosit elde. % 0.2 MS222 hayvanları uyuşturan, ve küçük bir kesiden karın yumurtalık lobları rezeksiyon.
2. Kalsiyumsuz OR2 çözeltisi (Tablo 1 'de tarifi) içinde çözüldü Clostridium histolyticum'dan tip 2 kolajenaz 600-700 U / ml' si ile 3-4 saat boyunca 19 ° C 'de enzimatik sindirme ile yumurtalık loblarından alınmış oositleri izole edin.
3. Seçimi için, çözelti içeren yüksek sodyum bir mikroskop altında bir Petri tabağına yerleştirin sonra soyuldular oosit (ND96: tarifi tablo 1 'de).
4. Evre V-VI oosit seçin ve bir Pasteur pipeti ile başka bir Petri kabı koyun. NOT: Blunt Pasteur pipeti oosit yaralanmayı önlemek için yanan tarafından.
5. CRNA (örneğin, 0.2 ng başına αβγENaC alt birim) ile oosit enjekte edilir. RNase-içermeyen su içinde cRNAs çözülür. NOT: Toplamher bir oosite enjekte edilen hacim 46 nl.
6. (: Tablo 1 'de tarif ND9) Mağaza oosit sodyum yüklenmesini önlemek için düşük bir sodyum çözeltisi içinde 19 ° C' de oosit enjekte edilir. Bakteri gelişimini önlemek için 100 U / mL sodyum penisilin ve 100 ug / ml streptomisin sülfat ile çözüm Ek. Dikkatlice hasarlı veya ölü oosit miktarını sınırlamak ve cRNA, enjeksiyondan sonra iki gün boyunca banyo çözeltisi ile doldurulmuş bir 12 kuyulu bir levha kuyuları bireysel küçük gruplar halinde muhafaza edilmesi için oosit kolu.

2.. Iki elektrotlu voltaj-kelepçe deneyler

1. Enjeksiyondan iki gün sonra, oosit ölçün.
2. ND96 çözeltisi ile bir ağırlık beslenen perfüzyon sistemine ve amilorid (2 uM) ihtiva eden bir çözelti ile ND96 şırınganın bir şırınga doldurun. Dağı 50 cm oosit banyo odasının üstünde şırınga. Not: ENaC inhibitör amilorid konsantrasyonu olan _IC50 den 20 kat daha yüksek olduğu için seçildi (100 nM).
3. 150 W halojen soğuk ışık kaynağı açın ve binoküler mikroskop ile iyi görselleştirme izin oosit banyo odasının üstünde 10 cm ayarlayın. Daha sonra emme açmak ve oosit banyo odası sonunda emme borusunu ayarlayın. Tüpler süperfüzyon emme borusu karşısında yerini 'adaptör oosit banyo giren. NOT: Emiş gücü oosit superfusing solüsyonun sürekli akışını desteklemek için yeterli olmalıdır.
4. Iv yerçekimi akış kontrol cihazı ile 3-5 ml / dak her çözümün süperfüzyon hızını ayarlayın. Oosit banyo odasına bir adaptör ile süperfüzyon tüpleri bağlayın.
5. <1 mikron ucu çapı elde etmek bir mikropipet çektirmesi ile cam kılcal damarları çekin. Daha sonra 3 M KCl ile ~ 1/4 için kılcal doldurun. Not: Elektrot tutucunun gümüş telin klorlanmış kısmı KCI çözeltisi içine daldırılmaktadır emin olun. Kılcal ucunda hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Hava kabarcıkları measu zarardirenç sokak kapasitans artırarak rement.
6. Mevcut elektrot sahipleri ve gerilim elektrot içine kılcal yerleştirin ve mikro manipülatörler kullanılarak ND96 içeren amilorid (2 uM) çözeltisi içine yerleştirin.

Amilorid duyarlı Tüm hücre Akımlar 3. Ölçümü

1. Sıfır _m V ve V _e ayarlayarak gerilim elektrodunun (V _m) ve akım elektrot (V _{e) 'nin,} elektrod potansiyeli _düğmeleri ofset _Not:. Direnç V ve _m 0,5 ölçmek için elektrot için 1-2 MQ olmalıdır Mevcut enjeksiyon elektrot için -1 MQ.
2. Voltaj algılama elektrotun yakınında banyo odası içine oosit yerleştirin. NOT: Bu transferi adımların herhangi sırasında oosit zarar vermeyin. Oositin aktarmak için bir Pasteur pipet kullanın. Oosit pipet kenarlarını zarar görmesini önlemek için yanan tarafından köreltilmiş olmalıdır.
3. Oo impaleher ikisi de mikro elektrod ile hafifçe cytes.
4. -60 MV yükseltecideki tutma potansiyeli ayarlayın ve grafik kaydedici açın. Çözeltisi içeren amilorid (2 uM) açın. NOT: Geçerli yaklaşık 0 ± 0.5 uA olmalıdır. Büyük sızıntı akımları bir sızdıran Impalement göstermektedir. Bu nedenle, bu oosit ret edilmelidir. Ayrıca, amilorid (2 uM) varlığında ölçülen kaçak akımlar αβγ-WT oosit ifade αβγ-mutant ENaC'nın ölçülen kişilerce oosit ifade benzer olmalıdır. Bu mutasyonlar, kanalın Amilorid duyarlılığı etkilemez gösterir.
5. Kaydetmeye başlayın. Gerekirse kazancını kontrol etmektedir.
6. Ölçülen akım sabit bir düzlüğe ulaştığında, amilorit-serbest çözeltisine değiştirin. Not: Mevcut izleri aşağı akım deplasmanlar içeri doğru akımlar, hücre içine, hücre dışı taraftan pozitif yük, yani hareket (Na ⁺⁾ karşılık gelir.
7. AfBir akım plato sonra (~ 60 sn) ulaşıldığında ter, geri amilorit içeren solüsyona Superfusion geçmek. Oositin akım ilk taban akımı ulaştıktan sonra, voltaj kelepçe kapatın ve yavaşça geri elektrotlar.
8. , Impalement bölgelerinde de, plazma zarının sızdırmazlığı sağlayan bir proteaz serbest ND96 çözeltisi 100-150 ul ihtiva eden bir 96-yuvalı plakanın bir oyuğuna oosit yerleştirin.
9. 5 dakika sonra, 30 dakikalık bir inkübasyon süresi için çözeltisini ihtiva eden bir proteaz veya proteaz olmayan bir kontrol çözeltiye oosit aktarın. NOT: Kuluçka süresi proteaz ve çalışılan kanal bağlıdır.
10. Inkübasyon adım akım ölçümü tekrarlayın sonra (3.2 ve aşağıdaki bakın). NOT: Bu proteaz çözeltisi içinde inkübe edildikten sonra oosit>% 90 ölçmek mümkündür.

4. Biyotinilasyonu Deneyi

1. Seçmek ve binoküler mikroskop altında kusurlu oosit atın. NOT: enjekte kullanıned akım ölçümleri için ve biyotinilasyon deneyler için aynı partiden oositlerde.
2. Deneyde kullanılmadan önce en az 20 dakika boyunca oda sıcaklığında biotin tutun.
3. Çözümler hazırlayın: ND96 ve ND96 uygun proteaz içeren. Etiketleyerek ve kısaca oosit yaralanmaları önlemek için kendi ipuçları yanan tarafından Pasteur pipetler hazırlayın. Not: Burada ND96'da proteaz kimotripsin 2 ug / ml kullanılır. Çözümleri çapraz bulaşmayı önlemek için ayrı bir pipet ile her grup tedavi.
4. Oda sıcaklığında bir proteaz ihtiva eden 2.5 ml kontrol ND96 ve ND96 ile 6 oyuklu plakanın her doldurun. Daha sonra oyuk başına 30 oosit yatırmak ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe. NOT: Sonraki işlemler için her zaman buz üzerinde örnekleri tutmak önemlidir. Bütün santrifüjleme aşamaları, 4 ° C'de gerçekleştirilmiştir
5. 2.5 ml ND96 (her grup, yıkama adımları için 3 kuyu ihtiyaç) ile yeni bir 6-yuvalı plakanın her doldurun ve biyotin tartın. Not: 2.5 mg biyotin per de (1 mg / ml) gereklidir. 25 ml tampon maddesi biyotinilasyon Tablo 1 'de (tarifi)' de 10 biyotinilasyon tampon grupları (örneğin, 25 mg biyotin () 'de biotin çözülür.
6. Bir de 2.5 ml ND96'da dolu oositlerin her grup aktarın. Aktarım kalan proteaz yıkayın ND96 ile iki kuyu içine bir sekans oositlerde. ND96 içinde 5 dakika için oosit inkübe edin.
7. Iyi olarak ihtiva eden 2.5 ml biyotin çözeltisi içine oosit aktarın ve 15 dakika süre ile hafif bir çalkalama ('çalkalayıcı') ile inkübe edin. Not: biotin solüsyonu seyreltme önlemek için pipet ile transfer ND96 en aza indirmek.
8. Biyotinilasyon reaksiyonu durdurmak için iyi olarak ihtiva eden 2.5 ml soğutma tamponu (Tablo 1 'de tarifi) içine oosit her grup aktarın. Daha sonra, aynı zamanda 2.5 ml tampon söndürmek ve yumuşak çalkalama ile 5 dakika boyunca inkübe içeren ikinci bir kuyuya oosit her grup aktarın.
9. Hasarlı veya ölü oosit çıkarın. Not:Aşağıdaki prosedür için grup başına oosit aynı sayıda seçin.
10. Bir 1.5 ml plastik bir mikrosantrifüj tüpüne oosit her grup aktarın. NOT: aktarılan söndürme tampon miktarını en aza indirin.
11. Daha sonra, proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş (tarifi bkz. Tablo 1) 1 ml liziz tamponunda, bir 27 G iğne içinden geçirilerek lize oosit.
12. 1500 x g 10 dakika boyunca lizatları santrifüjleyin.
13. Aspire edilen süpernatan ve% 0.5 Triton-X-100 ve% 0.5 NP40 ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer. Kalan pelet atın. Not: Süpernatan biyotinile edilmiş plazma zar proteinleri ve non-biyotinile hücre içi proteinler içerir.
14. , Buz üzerinde 20 dakika için bir mikrosantrifüj tüpleri inkübe edin. Tekrar tekrar girdap Bu periyot süresince, tüpler tam NP40 ve Triton-X-100'de proteinleri çözmek için olan.
15. 1500 x g de 3 dakika boyunca oosit grup başına agaroz boncuklar santrifüj 100 ul. Sonrasantrifüj boncuklar çözeltiden süpernatant kaldırmak ve tampon ile boncuk denge sağlaması için lizis tamponuyla üç kez yıkayın.
16. Boncuklara biyotinile protein bağlanmasına olanak sağlamak üzere 4,13 'de hazırlanan protein-deterjan çözeltisini ihtiva eden her bir mikrosantrifüj tüpü içine yıkandı, tanelerin Pipet 100 ul.
17. 4 ° C'de genel dönme O / N mikrosantrifüj tüpleri inkübe
18. 1500 x g de 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpleri santrifüjleyin. Daha sonra, yeni bir tüp içine süpernatant aktarın. NOT: Hücre içi protein biotin ile etiketlenmiş değildir. Üst faz, -20 ° C'de saklanabilir Boncuk aspire etmeyin.

Western Blot Analizi ile hücre yüzeyinde ENaC Cleavage Parçalarının 5. Algılama

1. Liziz tamponu ile boncuk üç kez yıkayın ve 2x SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde 100 ul ilave edin. Not: Numuneler -20 ° C'de saklanır ya da hemen western blot analizi için hazırlanabilir.
2. Çıban s5 95 ° C'de dakika ve daha sonra buz üzerinde yer borular depas'lar.
3. 3 dakika 20,000 xg'de ve yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine süpernatan pipetle santrifüj örnekleri. NOT: Bu yüzer oositin hücre yüzeyinden biyotinile edilmiş plazma zan proteinleri içerir.
4. Hücre yüzeyinde yarılma fragmanlarının araştırmak için western blot ile bu süpernatan 30 ul analiz eder.
5. Uygun bir jel (% 8,% 10,% 12 incelenmiştir yarılma fragmanlarının moleküler ağırlığına bağlı olarak) kullanılarak SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile biyotinile edilmiş proteinleri ayırın.
6. Yarı kuru blotting ile poliviniliden difluorür (PVDF) membran proteinleri için aktarın.
7. (Şekil 3 ve ¹³⁾ C-terminalindeki bir epitopa karşı yönlendirilen insan γENaC karşı spesifik bir antikor ile membran kontrol edin.
8. İkinci olarak anti-yaban turpu peroksidaz etiketli keçi anti-tavşan antikoru kullanarakvücut.
9. Kemilüminesan sinyalleri algılar.

Serin proteaz plazmin ENaC aracılıklı akımları aktif olup olmadığını araştırmak için, tek tek ENaC ifade eden oositlerin ΔI _ami proteaz içermeyen (kontrol) 'de oosit 30 dakika süreyle kuluçkalamadan (Şekil 2A) ya da plazmin içeren çözelti (Şekil önce ve sonra belirlendi 2B) iki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği (bkz. Şekil 1) kullanılarak. Plazmine maruz ölçülen her oosite ΔI _Ami artmıştır. Bunun aksine, kontrol deneylerinde, proteaz içermeyen solüsyon içinde ENaC-eksprese eden oositlere 30 dakika inkübasyon önemsiz bir etkiye sahiptir (Şekil 2, C, D) vardı. Bu nedenle, bu yöntemi kullanarak plazmin ile ENaC aracılı akımının bir uyarım tespit edilebilir.

ENaC aracılı akımları aktivasyonu, hem de üzerine, varsayılan bölünme mevkilerini mutasyonlannın etkilerini incelemek için bir kanal bölünme üzerine, WT-ENaC'nın on kimotripsin etkisi bu konuda karşılaştırılmıştırmutasyona uğramış prostasin ve plazmin yarılma bölgeleri olan bir mutant ENaC (γ _{RKRK178AAAA, K189A).} Kanal kimotripsin ile aktivasyonu hem de ENaC'nın görünümünü hücre yüzeyinde ürün parçalanmasının zaman süreci farklı proteaz inkübasyon sürelerini (Şekil 4A) kullanılarak araştırılmıştır. Bu mutant kanal gecikmeleri ve kimotripsin ile ENaC aracılı akımının aktivasyonunu azalttığı gösterilmiştir. Bu, tam olarak bölünmüş alt birimine karşılık gelen 67 kDa bir molekül ağırlığı düşük γENaC bölünme fragmanının geciktirilmiş bir görünüm ile paraleldir. Bölünme fragmanları, C-terminalindeki bir epitop (Şekil 3) karşı yönlendirilmiş bir γENaC antikor kullanılarak tespit edilmiştir. Bu yaklaşım, metodolojik ENaC aracılı akımların proteolitik aktivasyon zaman süreci, hücre yüzeyinde bir 67 kDa γENaC bölünme ürününün görünümü (Şekil 4, B, C) ​​ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu, kavramını desteklemektedirproteolitik kanal bölünme ve kanal aktivasyonu ¹³ arasında nedensel bir bağlantı. Ayrıca, hücre yüzeyinde akım ölçümleri ve γENaC fragmanların tespiti birleştirerek bu mutasyona uğramış proteolitik bölünme mevkilerinin kanal aktivasyonu için, fonksiyonel olarak bağlantılı olduğu gösterilmiştir.

Şekil 1. Xenopus oocytes içerisinde heterolog olarak ifade ENaC'nın bir proteazın uyarıcı etkisini belirlemek Prosedür laevis oositleri. ENaC aktivitesi Amilorid duyarlı bütün hücre akım bileşeni ΔI _ami ölçülmesiyle tahmin edilmektedir.

Şekil 2,. Plazmin ENaC aracılı para birim uyarırENaC eksprese eden oositlerde ts. İnsan ENaC ifade (AD) Oositler bir proteaz içermeyen çözeltisi (kontrol) ya da plazmin (10 ug / ml) ihtiva eden çözelti içinde 30 dakika için kuluçkalanmıştır. (-) Daha önce ΔI _ami belirlemek ve sonra (+) inkübasyon, oositler -60 mV tutma potansiyeline kadar sıkıştırıldı (A, B) oosit bir yığınından temsilci dört tam hücre akımı izler.. Amilorid (ami), siyah çubuklar ile belirtildiği gibi, özellikle ENaC inhibe etmek için banyo çözeltisi mevcuttu. (C) tek bir oosit elde edilen veri noktaları, bir çizgi ile birbirine bağlanmıştır. (D) 'e benzer deneylerin özeti C. Kolon gösterildiği gibi temsil ΔI _ami göreli uyarıcı etkisi inkübasyon önce ölçülen ilk ΔI _ami (ΔI _ami başlangıç) için bir 30 dakika inkübasyon (ΔI _ami 30 dakika) sonra ölçülen ΔI _ami oranı olarak hesaplanır. Kolonların içindeki Numaraları gösterirölçülen ayrı oosit sayısı. K oosit farklı kısımlarının sayısını göstermektedir. (Bu rakam modifiye edilmiştir [Haerteis ve ark 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, DOI:. 10.1085/jgp.201110763])

Kanal plazma zarı ulaşmadan önce Golgi ilişkili dönüştürücü furin tarafından proteolitik aktivasyon ve kullanılan antikorun bağlanma yeri için γENaC alt birim gösteren yarılma siteleri Şekil 3.. Modeli. Proteolitik bölünme biyosentetik yolda ENaC olgunlaşması için önemlidir. 76 kDa fragmanının furin klevaj ile γ-alt-biriminin C-termininde bir epitopa karşı bir biyotinilasyon yaklaşımı ve bir antikor kullanılan hücre yüzeyinde tespit edilebilir sonra. Proteolitik EN önemli son adımaC muhtemelen aktivasyon γENaC bir 67 kDa bölünme fragmanının sonuçlanan furin sitesi için bir bölge distal hücre dışı proteazlar (örneğin plasmin veya kimotripsin) ile bölünmektedir plazma membranında gerçekleşir. (Bu rakam modifiye edilmiştir [Haerteis ve ark 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, DOI:. 10.1085/jgp.201110763])

Şekil 4:. Plazmin (K189) ile prostasin bölünme sitesini (RKRK178) her iki mutasyonu ENaC aracılıklı akımları aktivasyonunu ve kanal γ-alt-birimi ve bir 67-kDa ayrışma ürünün görünümünü geciktiren Oositler WT sentezleyen (açık semboller) ve γ _{RKRK178AAAA; K189A} ENaC mutant kanal (kapalı semboller) proteaz içermeyen çözeltisine (kontrol) içinde 30 dakika boyunca ya da 5, 3 için kuluçkalanmıştırKimotripsin (2 ug / ml) ihtiva eden bir çözelti içerisinde 0, ya da 60 dakika. (A) kuluçka öncesi ve sonrası ΔI _ami belirlemek için, oosit -60 mV tutma potansiyeline kadar sıkıştırıldı. Daireler inkübasyondan önce ölçülen başlangıçtaki ΔI _ami (ΔI _ami hemen) için 5 sonra ölçülen ΔI _AMI oranına, 30 ya da 60 dakika inkübasyon (ΔI _ami dakika) temsil eder. Her bir veri noktası dört farklı partilerin 22-24 ayrı oosit ölçülen ortalama ΔI _ami temsil eder. (BD) ΔI _ami, hücre yüzeyinde biyotinile γENaC ekspresyonu, SDS-PAGE ile analiz edilmiştir deteksiyonuna paralel olarak. γENaC insan γENaC C-terminalinde bir epitopa karşı bir antikor ile tespit edilmiştir. Her bir şerit için, B ya da D'de gösterilenlere benzer üç western blotlar, s oosit bir toplu işletmeye Örnek western blotlar gösterilmiştir. (CE) densitometrik analizi76 kD (açık sütunlar) ve 67 kD (gri sütun) bölgelerinde tespit ignals belirlenmiş ve bulgulanan toplam sinyalin toplamına göre normalize edilmiştir. N oosit farklı kısımlarının sayısını göstermektedir. büyük resim görüntülemek için.

Bu yazıda başarılı bir proteaz ile ENaC'nın aktivasyonunu altında yatan mekanizmaları incelemek için uygulanan bir metodolojik ^8,13 yaklaşım tarif edilmektedir. Iyi kurulmuş Xenopus laevis oosit ekspresyon sistemi işlevsel olarak ifade ENaC için kullanılmıştır. ENaC işlevi geleneksel iki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği ile değerlendirildi. Yer yönlendirmeli mutagenez, işlevsel olarak ilgili bir proteaz bölünme mevkilerini belirlemek için kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümlerle paralel olarak gerçekleştirilen deneyler Biyotinilasyon mümkün ENaC'nın görünümünü mevcut proteolitik aktivasyon, hücre yüzeyinde ürün bölünmeye ilişkilendirmek için yapılmıştır. Mevcut aktivasyon zaman süreci ve hücre yüzeyinde proteolitik yarılma fragmanlarının görünüşü arasında bir korelasyon proteolitik kanal aktivasyon kavramını desteklemektedir.

Iki elektrotlu voltaj-kelepçe kayıtları, bir O Impalement gerektirirİki mikro elektrod ile ocyte. Bu prosedür genellikle bireysel bir oosit içinde sadece bir kez yapılır. Bununla birlikte, oosit için aşikar zarar vermeden bir ilk bütün hücre mevcut kaydın sonra Mikroelektronlar kaldırmak mümkün oldu. Gerçekten de, impalements bölgelerinde de plazma membranı, bir kaç dakika içinde yeniden mühürlemek için görüntülenir. Bu durumda, bir ilk iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümü tamamladıktan sonra, bir mikrofüj tüpüne ya da dolu bir 96-yuvalı plakanın bir oyuğuna iki elektrotlu voltaj-kelepçe kurulum deney akış odasından oositin aktarmak mümkündür test veya kontrol solüsyonunun bir küçük hacimli. Daha sonra, aynı oosit akış odasının geri aktarılabilir ve bir ikinci iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümü gerçekleştirmek için tekrar kazığa edilebilir. Dikkate değer, ENaC-aracılıklı akımları oosit kontrol çözelti içinde muhafaza edilmiştir, birinci ve ikinci ölçüm arasında çok farklılık yoktu. Bir proteaz içeren bir Sol oositin kontrastı, kuluçkalandırmaİlk ölçümden sonra, ution ikinci ölçümde artan ENaC aracılı akımı (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. Bu bulgu, proteolitik kanal aktivasyonunu gösterir.

Tek bir oosit olarak iki ayrı akım ölçümleri gerçekleştirilmesi oosit test çözeltisi, küçük bir hacim içinde değişken bir zaman süresi için iki ölçüm arasında, proteazlar ya da diğer farmakolojik ajanlar maruz avantajını sunar. Büyük miktarlarda pahalı ve / veya kullanılamaz ajanlar, örneğin saflaştırılmış proteaz preparatlar kullanılırken bu önemlidir. Ajanların sınırlı durumu nedeniyle sürekli dakikada birkaç mililitre debilerde oosit superfusing için gerekli test solüsyonu geniş hacimli imkansız (ya da satın alınacak) sürekli iki elektrot gerilim-kelepçe kayıtları bunları kullanmak için yapabilir. Ayrıca, sürekli iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümleri bilinen fenomeni ile sınırlıdırspontan kanal kestirip Bu fenomene de ENaC'nın ¹⁵ nitelendirdi. Buna karşılık, bir saat ya da daha fazlasına kadar için iki ayrı ölçümler arasındaki çözüm test etmek için oosit maruz değil genel olarak (bkz, Şekil 4A) bir sorun teşkil etmez. Son olarak, aynı oosit içinde yapılan iki ardışık ölçüm ilaç etkileri eşleştirilmiş gözlemler sağlar. Genellikle iyon kanalı bir ifadesinde, oositler, arasında yüksek değişkenlik sorununu azaltır, çünkü bu, oosit (proteaz ile muamele edilmiş ve araç ile tedavi edilmiş) iki ayrı gruplarından eşleştirilmemiş ölçümleri üzerinde bir avantaja sahiptir. Eşleştirilmiş gözlem ve ilk ölçüm verileri normalleştirmek için olasılığı ile, daha az sayıda oositler bir farmakolojik maddenin önemli bir etki göstermek için deney grubu başına ihtiyaç vardır. Verilerin Normalleştirme da bunun için farklı iyon kanalı ifade seviyeleri ve bu nedenle, farklı taban akımı (Şekil 2D, gametlerin, farklı gruplar verilerini özetleyen kolaylaştırır.) Bu yaklaşım, ilgi konusu iyon kanalı faaliyet (bkz. Şekil 2) ikinci bir ölçüm için birinci araç ile tedavi edilen kontrol oositlerde sabit kalır olduğunu göstermek için Açıkçası, kontrol deneyleri gereklidir.

Mevcut proteolitik aktivasyon, hücre yüzeyinde ürün bölünmeye ENaC'nın görünümü ile karşılıklı ilişki içinde olduğunu göstermek için, biyotinilasyon yaklaşım, ilk Harris et al. ⁹ kullanılabilir. Bu prosedür, (Protokol bölümünde ayrıntılı olarak ve Şekil 4 'de gösterildiği gibi) ve proteaz ENaC-aracılı aktivasyonu daha sonra akımlarının ayrılması parçalarının zamana bağımlı bir görünüm ile paralel olduğu kanalları bu maruz göstermek için uyarlanmıştır. Biyotinilasyon yöntem de hücre yüzeyinde genel bir artış ya da azalma zar proteinlerinin analizini sağlar. Bu nedenle bu yöntem, proteazlar ve diğer Phar etkisini araştırmak için uygundurplazma zarı içine veya kanal alma üzerine kanal ekleme üzerine macological ajanlar. Ayrıca, biyotinile edilmiş plazma zar proteinlerinin western blot analizi sağlar: protein fragmanları (örneğin, proteolitik ENaC fragmanları) ya da işlevsel olarak ilgili olabilir glikosilasyon deseni değişikliklerin tespiti.

Sonuç olarak, yöntemlerin kombinasyonu ENaC aracılı bütün hücre akımları üzerinde proteazların uyarıcı etkisini araştırmak ve geniş bir uygulama yelpazesi için yararlı olabilir ENaC'nın meydana gelmesi ile bir korelasyon hücre yüzeyinde ürün bölünmeye göstermek için kullanılır. Özel olarak, bu yöntemler, başka iyon kanalları, taşıyıcı ya da zar-ötesi reseptör (örneğin, proteaz tarafından aktive edilen reseptörleri PAR) düzenlemesi ile ilgili olarak benzer soruları için uygun olabilir.

The authors have nothing to disclose.

The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.