Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Bu protokol, Caenorhabditis elegans, gelişmekte olan embriyo bölünen hücreleri görüntüye floresan mikroskobu kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol epidermal hücrelerin altında bulunan ve epidermal morfogenezisi önemli olabilir neuroblasts, bölünmesi nasıl görüntü üzerinde duruluyor. Doku oluşumu metazoan gelişimi için çok önemlidir ve komşu dokuların dış işaretlere dayanmaktadır. C. elegans mikroskobu ile çalışmak için kendi dokuları kolay hale nedeniyle şeffaflık ve basit organizasyon in vivo doku morfogenetiğine incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Ventral muhafaza embriyonun ventral yüzey epitel hücrelerinin tek bir tabaka ile kaplanmıştır süreçtir. Bu olay örten epitel hücrelerinin göçüne aracılık kimyasal rehberlik ipuçları sağlamak temel neuroblasts, kolaylaştırılabilir düşünülmektedir. Bununla birlikte, son derece nöro-proliferatif ve aynı zamanda hareket edebilirventral epidermal hücreler için mekanik bir alt-tabaka olarak. Bu deney protokolü kullanılarak yapılan çalışmalar, doku oluşumu sırasında arası iletişimin önemini ortaya çıkarmak olabilir, ve gelişmekte olan dokular içinde hücre bölünmesi ile ilgili genlerin rollerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Nasıl görüntü hücre bölünmesi için erken C. anlatan protokoller var olsa elegans embriyo, bu protokol nasıl görüntü hücre bölünmesi orta Embriyogenez sırasında bir doku içinde açıklanır. Gelişimi sırasında organizmaların görüntülenmesinde önemli zorluklardan biri fototoksisite onların duyarlılık olmuştur. Ancak, dönen bir disk konfokal mikroskoplar veya süpürüldü alan mikroskoplar artan erişilebilirlik daha yaygın görüntüleme uygulamaları izin verdi. Her iki sistem de organizmalar maruz kaldığı UV sınırlandırarak, katı hal lazerleri ve dağınık ışık kullanır. Ancak, Widefield standları hala yüksek duyarlılık (örn. EMCCD), diyafram denetimi ve ışık kontrolü (örneğin, LED'ler veya ayarlanabilir cıva ampul) ile kameralar ile donatılmış olan, özellikle in vivo görüntüleme için kullanılabilir. Bu protokol, C, gelişmekte olan görüntü hücre bölünmesi için bir konfokal tabanlı bir sistem veya bir widefield sistemi ya nasıl kullanılacağını açıklar elegans </ Em> embriyolar. Örnek olarak, biz nasıl resim neuroblast hücre bölünmesini açıklayınız. Nöro-blastlar örten epidermal hücrelere, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlayarak epidermal morfolojilerinden kolaylaştırmak ve dokuların oluşumunda arası iletişimin önemi mükemmel bir örnek sağlayabilir.

Caenorhabditis elegans şeffaflığıyla ve basit doku organizasyonu ¹ nedeniyle mikroskopi tabanlı çalışmalar için ideal bir model organizmadır. Ayrıca, C. elegans genetik yöntemler ve RNAi için uygun olan, ve genlerin çoğu insan homologlarını beri, bu doku oluşumu için ^2-5 korunmuş mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir. C. In Embriyo> 300 hücreleri olduğunda elegans, epidermis oluşumu, orta embriyojenez sırasında oluşur. Epidermal morfogenez embriyo büzülür epidermal hücrelerin bir tabaka içine ve embr dönüştürmek için uzanan bir süre boyunca birkaç büyük aşamadan oluşurBir solucan ^6'nın uzun oval bir şekil formundan yo. Ventral epidermal hücreler embriyonun ventral yüzeyi (Şekil 1) kapsayacak şekilde ventral orta hat doğru geçiş yaparken, ventral muhafaza, bu morfogenetik olaylardan birini açıklamaktadır. İlk olarak, anterior bulunan öncü hücrelerin iki çift kontralateral komşularıyla ⁶ ile ventral onlar uygun orta hat ve sigorta doğru göç. Bu, ventral cep ^6-7 oluşturma şekiller gibi kama oluşturan merkezi bir arka cep hücrelerinin taşınması takip eder. Cebi kapatır mekanizması iyi anlaşılmamıştır. Bir olasılık, bir supracellular aktin miyozin kasılma yapısı ⁸ yara iyileştirici benzer, moda gibi bir çanta dize birlikte cep hücreleri bağlar olduğunu. İlginç bir şekilde, cep hücrelerin bazı göç epidermi altında bulunan temel neuroblasts ⁹ (nöronal ön-maddeleri arasında, belirli alt-aracılık eders, Şekil 1 B).

Önceki çalışmalar nöro. VAB-1 (efrin reseptörü) ve VAB-2 (efrin ligand) yüksek neuroblasts olarak ifade edilmiştir ve birbirinden anterior ve posterior neuroblasts sıralama kolaylaştırmak edilir ventral epidermal hücre göçü ve ventral muhafaza düzenleyen gösterdi, ve VAB-1 veya VAB-2 neden ventral muhafaza mutasyonlar ^10-13 fenotip. Bununla birlikte, promotör kurtarma deneyler VAB-1, aynı zamanda neuroblasts salgıladığı diğer rehberlik ipuçlarının için üstte ventral epidermal hücreleri ve reseptör olarak gerekli olduğunu göstermiştir ventral epidermal hücrelerinde ⁹ olarak ifade edilmiştir. Bu reseptörlerin herhangi mutasyonlar ventral muhafaza fenotiplerini neden olsa da kusurları nedeniyle neuroblast konumlandırma veya bağlı rehberlik yanıt ventral epidermal hücrelerin başarısızlık ¹⁴ istekalar Sorunlara ortaya çıkması durumunda, bu açık değildir. Nöroblastlar wi bölümü değiştirilmesirehberlik ipuçları salgılama yeteneğini etkileyen thout neuroblasts rolü ve epidermal morfolojilerinden sırasında mekanik girdi sağlama yeteneği ışık tutabilir. Son zamanlarda, bir hücre bölünmesi geni, ani-1 (anillin) yüksek neuroblasts (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir ve tükenme neuroblast bölme kusurlarına neden olduğu bulunmuştur. İlginçtir, bu embriyolar ventral muhafaza fenotipleri (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) gösterilecek.

Anillin hücre bölünmesi için gerekli olan ve özellikle de, bir ana hücre fiziksel olarak iki yavru hücrelere bölündüğü işlemi tarif sitokinez, içindir. Sitokinler sıkıca düzgün kardeş kromatid ayrılması ile birlikte olduğundan emin olmak için mekan ve zaman olarak kontrol edilmesi gereken bir aktomizin kontraktil halka oluşumu ile tahrik edilir. Metazoan sitokinez ana düzenleyicisi RhoA (C. elegans RHO-1), bir küçük bir GTPaz olduğunuonun GTP-bağlı formda yönerge. GEF Ect2/ECT-2 RhoA-GTP kontraktil halka oluşturur ve girişini ¹⁵ aracılık eden alt baş efektörlerinin ile etkileşime sonra, RhoA etkinleştirir. Anillin C-terminalinde ile ve N-terminal ile aktin ve miyozin için RhoA bağlanan bir çok alan bir proteindir. Anillin memeli veya Drosophila S2 hücreleri ¹⁶ kontraktil halkanın konumunu stabilize etmek için gereklidir. Anillin tükenmesi yanal salınımlar geçmesi kasılma yüzük olur, ve sitokinez sonunda çok çekirdekli hücreler ^17-19 oluşturulması başarısız. İlginç bir şekilde, her ne kadar C. elegans ani-1 it sitokinez için gerekli değildir, erken embriyo aktomizin kasılmasını koordine eder. Yukarıda açıklandığı gibi Ancak, ani-1 orta Embriyogenesis (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) sırasında neuroblast sitokinez için gereklidir. Sitokinez başarısızlık neuroblasts sayısını ve konumunu değiştirecek ve loc etkileyebilecekKimyasal rehberlik ipuçlarının tirme ya da doku mekanik özelliklerini değiştirebilir. Her iki model de ventral muhafaza için neuroblasts otonom olmayan rolünü, ve embriyonik gelişim sırasında doku doku iletişimin önemini vurgulamak.

Bu deneysel protokol anlatıyor görüntü hücre bölünmesi sırasında C. elegans floresan mikroskopi kullanılarak orta embriyogenezis. Hücre bölünmesi mekanizmalar üzerinde çalışmaya Deneylerin çoğu hücre sınırlı sayıda (örneğin C. tek hücreli embriyo, Xenopus veya echinoderm elegans ile kültür tabaklarında (örn.. HeLa veya S2 hücreleri) tek hücre ya da erken embriyolar gerçekleştirilmiştir embriyo). Ancak, bu bölünme uçağın zamanlaması ve yerleştirme etkileyebilecek dış ipuçları olduğu gibi, aynı zamanda dokuların içinde hücre bölünmesi çalışma için önemlidir. Ayrıca, hücreler komşu doku gelişimini etkilemek için kimyasal veya mekanik ipuçları verebilirs, ve hücreler arası iletişim gelişimi sırasında meydana dokuların nasıl yardımcı anlamak önemlidir.

1.. Solucan Suşlan bakımı ve RNAi Sahne için plakaların hazırlanması

1. Nematod Büyüme Medya Tabaklar
   1. Tabaklar
      1. Solucan suşları korumak ve genetik haçlar gerçekleştirmek için nematodu Büyüme Medya (NGM) tabak hazırlayın. Bir 2 L bir şişe içinde, damıtılmış suyun 1 L 3 g NaCl, 17 g ve 2.5 g Agar baktopepton birleştirin ve bir metal karıştırma çubuğu ilave edin.
      2. Agar çözülür ve ortam sterilize etmek için şişeyi otoklav. Daha sonra bir karıştırma plakası üzerinde şişe yerleştirin ve karıştırılırken ortam soğumaya bırakın.
      3. Ortam soğutuldu ve yine (45-50 ° C) dokunun biraz sıcak sonra, 1 ml 1 M _CaCl2, 1 ml 1 M MgSO _4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol solüsyonu ve 25 ml 1 M eklemek potasyum fosfat tampon maddesi (PPB, reaktif / materyallerin tabloda tarifi; filtre stok çözelti sterilize) ve hemen 60 mm x 15 mm (kültür kaplarına ortamı dökün, üst ya da 13 ml / plaka bulaşıkları ~ 3/4 doldurmak USI) otomatik bir dağıtıcı ng. Not: bazı suşları tetrasiklin uzun süreli bakım bakteriyel RNAse III geninin etkisiz hale TN10 transpozonunun izin vermek için, levhaların (12.5 ug / ml) ilave edilebilir için.
      4. Ortam gece oda sıcaklığında katılaşmaya edelim. Not: Levhalar biyolojik başlığı içinde ya da kirlenmeye daha az eğilimli olan laboratuar bir alanda muhafaza edilmelidir. Ayrıca, mantar kontaminasyonu sınırlamak için (kağıt mendil ile örn. temiz) kapaklarındaki inşa herhangi bir yoğunlaşma kaldırmak. Tetrasiklin da plakalarına ilave edilir, bu antibiyotik ışığa duyarlı olduğu gibi, daha sonra, alüminyum folyo ile kapatın.
      5. Ertesi gün, E bir süspansiyonu ile kuru NGM plakaları tohum coli; hafifçe girdaplanmış edilmiştir (OP50 gerginlik Bölüm 1.1.2 bakınız). Çiftleşme için plakaları yapmak için, (a küçük bir daire oluşturmak için) her plakanın merkezine OP50 ~ 50 ul ekle. Solucan suşları korumak için plakaları yapmak için, OP50 100-200 ul (~ için her NGM plaka tohumit) plakanın daha büyük bir alanı kaplar emin olun.
      6. Numaralı seribaşı plakalar kuru O / N, oda sıcaklığında olsun.
      7. Ertesi gün, ters kurutuldu, NGM plakaları edecek ve 4 ° C'de plastik saklama kapları bunları yığın Not: Tabaklar 3-4 hafta ~ kadar kullanılabilir. Tetrasiklin ihtiva eden plakalar, karanlıkta tutulmalıdır.
   2. Gıda
      1. E. kullanın coli OP50 [Caenorhabditis Genetiği Merkezi (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] adlı C için bir besin kaynağı olarak . elegans Not: OP50 -80 ° C (% 50 h / h gliserol, oran 1:1) gliserol stokları olarak saklanabilir.
      2. , NGM plakalar için OP50 yapmak gliserol stokunun küçük bir kısım kullanılarak bir çizgi plaka yapmak için (, steril bir pipet kullanın <10 ul). Bir LB agar plakası (reaktif / materyallerin tablosunda reçete) üzerine bakteri yayın ve ~ 16 saat boyunca 37 ° C'de bırakın. Not: kirlenme ile ilgili sorunlar varsa, streptomisin dirençli OP50 kullanılabilir, birnd streptomisin LB agar plakaları (50 ug / ml) ilave edilebilir.
      3. Ertesi gün, tek bir koloni almak ve 500 ml'lik bir şişe içinde bir sıvı LB ortamı (reaktif / materyallerin tablosunda reçete) 100 ml inoküle.
      4. Kültür çalkalanarak 37 ° C'de O / N büyümesine izin.
      5. Ertesi gün, NGM plakaları tohumlama için bakteriyel süspansiyon kullanmak. Not: OP50 50 ml konik bir tüp içinde alikotlandı ve ~ 4-6 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. RNAi
   Besleme RNA aracılı paraziti için ana yollarından biridir (RNAi, belirli bir gen ürününü demonte) C. elegans. C. elegans çift cinsiyetli E. beslenebilir indüksiyondan sonra dsRNA eksprese eden bir vektör ile transforme edilmiş besleme coli suşu HT115. Bu, dsRNA (ya da fragmanları), genellikle özel gen hedefin önemli demonte sonuçlanan gonad iletilir.
   1. RNAi Tabaklar
      1. Yukarıda tarif edildiği gibi NGM tabak hazırlayın (Bölüm 1.1.1) bakınız, aynı zamanda, 1 M IPTG (izopropiltiyo-beta-D-galaktosit 1 ml ekleyin;) dsRNA ekspresyonunu indükleme ve 50 mg / ml ampisilin (Amp 500 ul; dsRNA eksprese eden vektörler vardır Amp dirençli sıcak ortam (45-50 ° C).)
      2. Plakalar kuruduktan sonra, E: ~ 50-100 ul ile tohum coli HT115 (Bölüm 1.2.2 bakınız). Not: tohumsuz plakalar ~ 4-5 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
      3. Tohumlanan plakaları oda sıcaklığında bir gece boyunca kurumasına izin verin.
      4. Ertesi gün, ters kurutuldu, RNAi plakaları edecek ve 15-20 ° C'de plastik bir depolama kabı içinde depolamak Not: Tohumlu plakaları ~ kadar 2-3 hafta boyunca RNAi verimliliğini korumak.
   2. RNAi Gıda
      1. E. kullanın (CGC itibaren, Bölüm 1.1.2 bakınız) coli HT115 ilgi konusu bir gen için cDNA içeren vektör besleme L4440, veya L4440 ile transforme. Not: genomu içinde açık okuma çerçevelerinin çoğunluğu hedef kütüphaneler Beslemezaten yapılmış ve L4440 olarak klonlar HT115 dönüştü (mevcut olmuştur; örneğin ani -1 ^20-21 Y49E10.19 bir parçasını içeren;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / sayfalar / rnai.html). Not: HT115 -80 ° C (% 50 h / h gliserol, oran 1:1) ile gliserol stoklan halinde tutulabilir.
      2. Ilgi konusu bir geni hedef alan yeni bir yapı oluşturmak için, IPTG ile indüklenebilir olan yan T7 promoterler arasında, L4440 vektör haritası ve klon cDNA bkz.
      3. Dönüşüm için standart bir protokol (örneğin kimyasal yetkili bakteri yapmak ve ısı şok dönüşümü gerçekleştirmek) kullanarak L4440 yapı ile HT115 Transform.
      4. (Bölüm 1.1.2 bakınız) OP50 için tarif edildiği gibi, bir LB agar plakası üzerinde gliserol stoku, fakat plakadan çizgi bakteriler de ampisilin, 50 ug / ml içermelidir. Not: Önceden varolan L4440 yapısı kullanıyorsanız, Bölüm 1.2.2.2-1.2.2.3 atlayın.
      5. Tek bir koloni seçin ve 5 ml aşılamak5, 50 mg / ml stok (LB Amp) için ampisilin ul ve çalkalanarak 37 ° C'de yerleştirin ihtiva eden LB ortam.
      6. ~ 16 saat sonra, O / N kültürün 50 ul taze LB Amp ortam 5 ml aşılamak ve 37 ° C'de çalkalama ile 7-8 saat boyunca kültürünün yetiştirilmesi
      7. 4,000-8,000 xg'de 1 dakika boyunca bakteri santrifüj, süpernatant atmak ve taze LB Amp medya 500 ul pelletini.
      8. Yukarıda açıklandığı gibi (Bölüm 1.2.1) RNAi plakaları tohum için bu bakteri solüsyonu kullanın. Not: HT115 hemen kullanılmalıdır ve saklanmamalıdır.

2. Solucan Suşlan yetiştirilmesi

C'yi koruyun standart protokole ^1'e göre NGM plakalar üzerinde CGC sipariş elegans suşları. Bu protokol için kullanılan soylar şunlardır: C, elegans var Bristol, vahşi tip (CGC N2 suşu ID); unc-119 (tm4063); wgIs102 [jambon-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + unc-119 (+)] (CGC OP102 suşu ID); unc-119 (ED3); ltIs44pAA173 [pasta-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (CGC OD70 suşu ID); ajm-1 (ok160); jcEx44 [ajm-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (CGC SU159 suşu ID); unc-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (hmr-1p :: hmr-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR'dir + unc-119 (+)] (CGC FT250 suşu ID).

1. ~ 3 taze NGM plaka doğru fenotip göstermeyen genç yetişkin çift cinsiyetli seçin. Not: N2 (var. Bristol, vahşi tip), 15-25 ° C arasında muhafaza edilebilir, ancak daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı bir yoğunluğa ulaşır. Solucan yoğunluğu yüksek olduğunda, New stokları yapılmalıdır.
2. Floresan proteinleri optimal ifadesi için 20-25 ° C'de tüm floresan suşları (örneğin GFP ve / veya MCherry ifade solucanlar) tutun. Solucan yoğunluğu yüksek ve gıda düşük olduğunda New stokları yapılmalıdır.
3. Solucanlar almak için, kullanmakçekilmiş ucuna (~ 3-5 cm uzunluğunda) de bağlı bir platin tel ile çekilmiş bir cam pipet yapılmış seçin. Pürüzsüz bir kenarı ile tel düzleştirmek. Hermafroditlerde up 'kepçe' için cımbızı kullanın ve yeni plakalar üzerine aktarabilirsiniz. Soylarının çapraz kontaminasyonu engellemek için kullanımı arasında tel bir alev.

3. RNAi

1. RNAi Sahne
   1. İlk olarak, 30-60 dakika ~ için bir dereceye giremeyen NGM plaka üzerinde yer ~ 8 L4 çift cinsiyetli solucanlar OP50 bakteriler kaldırmak için.
   2. Daha sonra, ilgili gen için dsRNA eksprese eden bir plazmid taşıyan L4440 HT115 ile tohumlanmış bir NGM Amp IPTG plakası üzerine yerleştirin çift cinsiyetli 8 (. Örneğin, ani-1, 1.2) ~ 24 saat karıştırıldı. Not: ilgi konusu genin, veya arzu edilen fenotipi (ki Nakavt gücüne bağlı olabilir) bağlı olarak, solucan, 24 saat sonra, taze, RNAi üzerine çift cinsiyetli yer (zaman daha kısa veya daha uzun süreler için RNAi tabakalarına bırakılabilir plakalar).
   3. Bir neg içinative kontrolü, bir RNAi plaka üzerinde yer solucanlar boş L4440 vektörü taşıyan HT115 ile ekildi. Not: Bu embriyonlar, herhangi bir fenotipi olması gerekir.
   4. Bir pozitif kontrol için, iyi karakterize fenotiplerle bir geni hedefleyen dsRNA'yı ifade eden RNAi plaka üzerine solucanlar yerleştirin. Not: 24 saat ve çift cinsiyetli 48 saat sonra steril olduktan sonra rho-1 (Y51H4A.3) için, embriyolar% 100 ölümcüldür.
2. RNAi Etkinlik
   RNAi Nakavt seviyeleri, bazı dokular diğerlerinden daha dirençli olabilir, özellikle, çünkü test edilmelidir. Erken orta embriyojenez sırasında, çoğu dokuların RNAi duyarlı olan, ancak geç embriyo ya da larva, nöronlar, RNAi dayanıklıdır. Farklı suşları RNAi duyarlılığı (örneğin rrf-3) geliştirmek için, ya da (nöral promoter unc-119 ile bir transjenin ifade edilen ile kombinasyon halinde, örneğin 1-sid) dokuya-özgü RNAi üretmek için kullanılabilir.
   1. Western Blotting
      C kullanılarak bağışıklık-boyamasıyla elegans proteinleri olabilir,Standart protokol ²² uygun olarak gerçekleştirildi.
      1. RNAi yapıldıktan sonra, bir mikrosantrifüj tüpü içinde çift cinsiyetli (embriyolar ile doldurulmuş) ~ 10 Hastaların gravida toplamak ~ 2 dakika süre ile, kaynatılarak 20-30 ul 1 x SDS-PAGE numune tampon ve eritmek için biyolojik kabiliyetiyle ekleyin. Benzer şekilde, kontrol numunesi için ayrı bir tüp içinde N2 solucanlar toplamak. Not: çift cinsiyetli sayısı, birincil antikorlar hassasiyetine bağlı olarak değişebilir.
      2. Örnek tampon maddesi içinde kontrol numunesi (örneğin, 3-100%) seyreltikleri oluşturun. RNAi kontrol ve numune yük ve standart bir protokol (% jel ilgilenilen proteinin boyutuna bağlı olarak değişecektir) göre SDS-PAGE ile çalıştırın.
      3. Bir zara jel aktarın ve standart bir protokole uygun olarak immunoblotting gerçekleştirin. Not: Kullanımı farklı birincil ve ikincil antikor seyreltilerini her antikor için önerilen.
      4. Geliştirin (örneğin kemilüminesansını kullanıyorsanız) veya tarama (örneğin floresan kullanıyorsanız) immunoblot ve inci karşılaştırıne RNAi şerit vs N2 şeritlerde bantların yoğunluğu ve Nakavt seviyesini belirlemek (örneğin, RNAi şerit yoğunluğunun% 12 kontrol şeridi ile eşleşen, bu protein,% 88 azalma olduğunu göstermektedir). Not:. Maddox ve arkadaşları ^23, bkz ANI-1 Nakavt etkinliğini görmek için
   2. İmmünoboyama
      C. immün elegans Standart protokol ²² göre gerçekleştirilebilir.
      1. RNAi gerçekleştirdikten sonra, iki yöntemden birini kullanarak gebe çift cinsiyetli ve hasat embriyolar toplamak. Santrifüj (1.000-4.000 xg) ile mikrosantrifüj tüpleri ve pelet silikonlu 1,5 ml M9 tampon (reaktif / materyallerin tablosunda reçete) olarak yöntem, bir yer çift cinsiyetli biri için. Not: Aynı şekilde N2 gravid Hermafroditler toplamak.
      2. M9 çözüm çıkarın.
      3. 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpüne ağartma çözeltisi 1 ml (1 M NaOH,% 5 ağartıcı) eklenerek embriyolar boşaltınız. Benzer şekilde, ağartıcı N2 diyekontrol slaytlar yapmak rmaphrodites.
      4. Vortex yavaşça, sonra hemen santrifüj (4,000-8,000 xg) vasıtasıyla embriyolar pelet ve ağartma çözüm kaldırmak. Not: solucanlar ağartıcı ile inkübe edilir, toplam süre 5 dakika geçmemelidir.
      5. Ve bir poli-L-lizin kaplı bir mikroskop lamı üzerine, bir cam Pasteur pipet kullanılarak embriyo transferi, embriyolar Tris Tamponlu Salin (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCI TBS) ile 3 kez yıkayın. Not: kaplamak için poli-L-lisin ile bir cam mikroskop slayt, ilk olarak slayt silin, daha sonra poli-L-lisin bir damla (~ 20-30 ul) ekleyin ve yüzeyi boyunca eşit bir şekilde yayılır ve kurumaya bırakın. En iyi sonuçlar, bir kat slaytlar iki kez için. Embriyolar (Bölüm 3.2.2.1-3.2.2.5) toplamak için alternatif bir yöntem, bir poli-L-lizin kaplı bir mikroskop lamı üzerine M9 bir damla koyun ve damla içine ~ 10 gebe çift cinsiyetli seçmek.
      6. Her bir mikroskop lamı üzerine lamel (embriyoların en içeren bir alana) yeri ve eklemesıvı nitrojen içinde kayar. Not: damla içine doğrudan yerleştirilen çift cinsiyetli için, çift cinsiyetli açık kırmak ve embriyolar sınırdışı lamel üzerine koymak baskı.
      7. Hemen sıvı nitrojen içinde dondurarak sonra lamelleri kapalı hafifçe vurarak embriyolar dondurularak-çatlak.
      8. Embriyoların düzeltmek için 20 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol slaytlar yerleştirin. Not: bazı antijenler, bu gibi paraformaldehid gibi bir çapraz bağlama sabitleyici tercih edilebilir. DUERR ²² daki protokole bakınız.
      9. Rehidrate ve slaytlar yıkanarak embriyolar permeabilize Tris Tamponlu Tuzlu Tween-20 içeren 4x (TBST, 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Tween-20) 10 dakika her biri için.
      10. Embriyoların çoğu içeren alanı çevresinde her slayt kuru ve sıvı engelleme kalem (örneğin PAP kalem) kullanarak embriyoların etrafında bir daire çizin.
      11. % 5 normal eşek serum (NDS; blok) ile TBST'nin ~ 100 ul ekleyin her slayt (daire alan) ve inkübeOda sıcaklığında 20 dakika. Not: 'ıslak odasına' (ıslak kağıt havlu içeren bir kapak ile, örneğin bir tabak) slaytlar yerleştirin.
      12. , Bloğunu her bir slayt (daire içine alan) (TBST içerisinde seyreltilmiş) birincil antikor ~ 50-100 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilir. Not: antikora bağlı olarak, seyreltme ve inkübasyon süresi değişebilir. GFP tespit etmek için, bir 1/200 seyreltide bir anti-fare anti-GFP birincil antikor kullanımı. ANI-1 algılamak için, (nazik Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill tarafından sağlanan) bir 1/1600 seyreltme bir anti-tavşan anti-ANI-1 primer antikoru kullanın. Daha uzun inkübasyon zamanları için, 4 ° C 'de yer slaytlar
      13. (Mümkünse, ileride kullanılmak üzere tutmak) primer antikorları çıkarın ve 5 dakika her biri için TBS ile slaytlar 3x yıkayın.
      14. Son yıkama çıkarın ve her bir slayt (daire içine alan) (TBST içerisinde seyreltilmiş) ikincil antikor ~ 50-100 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilir. Not: antikora bağlı olarak, seyreltme değişebilir. GFP algılamak için, bir a kullanınBir 1/250 seyreltmede nti-fare Alexa Fluor 488 ikincil antikor. ANI-1 tespit etmek için, bir 1/250 seyreltmede anti-tavşan Alexa Fluor 568 ikincil antikor kullanımı.
      15. Sekonder antikorlar çıkarın ve yıkayın slaytlar 5 dakika her biri için TBS ile 3x. Not: DNA leke DAPI ~ 50-100 ul eklemek için, (4 ',6-diamidino-2-fenilindol, 1 mg / ml) 5 dakika süreyle TBST içinde 1/500 seyreltme ile.
      16. DAPI çıkarın ve her biri için 5 dakika TBS ile 2x slaytlar yıkayın. Not: DAPI boyama yapılmaz ise, bu ekstra yıkama adımı atlayın.
      17. 0.1 M Tris (pH 9) ile birlikte tek bir hızlı yıkama yapın, montaj medya 15 ul 37 ° C (% 4 n-propil-3.4.5 trihydroxybenzoate (propil galat), 50 mM Tris, pH ~ 9'a önceden ısıtılmış kaldırmak ve ekleme Her bir slayt (daire alan)% 50 gliserol).
      18. Aşırı sıvı fitil ve oje ile slaytlar mühür, (daire içine alan montaj medya üstüne) her slayt lamel ekleyin. Not: Slaytlar -20 ° C'de saklanabilir
      19. Üzerinde embriyolar gözlemlemekBir widefield floresan mikroskop veya lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak kayar. Önemlisi, kontrol (N2 veya non-RNAi) embriyolar kullanarak optimum piksel yoğunluğunun görüntüleri toplamak için ayarlarını. Ardından, aynı ayarları kullanarak RNAi embriyolardan görüntüleri toplamak. Kontrol vs için toplanan görüntülerin örnekleri ani-1 RNAi embriyolar Şekil 2B'de de gösterilmiştir.

4. Canlı Görüntüleme ve Hasat Embriyolar için Slaytlar hazırlanması

1. Canlı görüntüleme için agaroz pedlerin hazırlanması
   1. Onlara bant 1-2 şeritler ile diğer iki slaytlar, her arasında temiz, önceden ısıtılmış mikroskop slayt yerleştirin.
   2. , Bir cam Pasteur pipet kullanarak, slayt (ısıtılmış damıtılmış su içinde çözülmüş) v agaroz / ağ% 2 bir damla ekleyin.
   3. Çabuk agaroz damla düzleştirmek için bir dik şekilde ilk slayt üstüne ikinci, temiz bir mikroskop lamı yerleştirin. Not: komşu üzerine bant kaydırdıes pad için kalınlığı sağlar.
   4. Üst slayt çıkarmadan önce 1-2 dakika için agaroz ped kurumasını bekleyin. Altında agaroz pedi kırma önlemek için dikkatli üst kızağın kapalı kaydırın. Not: Bazen ped üst slayt aktarılır ve hala kullanılabilir olduğu sürece bozulmadan kalır.
   5. Bir kaç dakika içinde agaroz ped üzerine embriyolar transfer hazırlandıktan sonra (adım 4.2), aşağıda tarif edildiği gibi. Not: ped, opak bir görünüme sahip olmalıdır; açıktır kez, o kullanmak için çok kurudur.
2. Hasat embriyolar
   1. Sulston ve diğ. ²⁴ türetilmiş canlı görüntüleme için, embriyolar toplamak için, aşağıdaki yöntemi kullanarak
   2. NGM veya RNAi plakaları (açlıktan) yaklaşık 4-6 gravid yetişkin almak ve bir depresyon slayt üzerinde bir kuyu M9 tampon 20-30 ul koyun.
   3. (Ya da seçenek olarak, vulva yakın) spermateka her iki tarafında solucanlar kesmek için bir neşter kullanarak sterilizeçözeltisi içine embriyolar bırakın.
   4. Bir cam kılcal / pipet bağlı bir ağız parçası ile lastik hortum kullanmak küçük bir delik var ve ağız pipetleme embriyolar emme çekti. Seçenek olarak ise, bir Pasteur pipeti kauçuk ampul bağlı bir kılcal cam boru ile embriyolar toplar.
   5. Solucan enkaz ayırmak için, aynı zamanda M9 tampon içeren ikinci bir çukuruna emilen embriyolar aktarın.
   6. Daha sonra, emme taze hazırlanmış bir agaroz ped üzerine embriyolar (adım 4.1).
   7. Birlikte tek bir x, y düzleminde filme edilebilir embriyo sayısını artırmak için (bir diş çekme yapıştırılmış) bir kirpik kullanılarak yığın embriyolar. Not: Oksijen yoksunluğu önlemek için, birlikte en fazla 10 embriyolar yığın yoktur.
   8. Daha sonra, bir lamel ile slayt kapak ve kısmen önceden ısıtılmış sıvı valap ile mühür, görüntüleme sırasında embriyonun su kaybını önlemek için (vazelin, lanolin ve parafin eritilir ve 01:01:01 birleştirilmiş). Not: Ek M9 tampon can embriyolar görüntüleme için yeterli sıvı sahip olmasını sağlamak için yastık için ilave edilebilir. Valap yerine, vazelin kısmen lamelleri kapatılması için de kullanılabilir, ancak bu lamelleri kayma ve mikroskop hedefler üzerine alabilir neden daha az serttir.

5. Canlı Görüntüleme

1. Neuroblasts görselleştirmek için, bir fluoresan proteine ​​bağlı bir neuroblast özgü bir proteini eksprese eden bir sonsuz yük elde edilir (örneğin, HAM-1: GFP, CGC OP102 suşu ID). , Hücre zarlarının algılamak farklı bir floresan protein bağlı lipidler tanıyan bir protein alanını ifade bir solucan suşu kullanmak için (örneğin MCherry:. PH, CGC OD70 suşu ID).
2. Floresan hermafroditlerde Hasat embriyolar (Protokolü 4) (Protokoller 3 ve 4), ve yukarıda anlatıldığı gibi slaytları kontrolü veya ani-1 RNAi plakaları üzerinde tuttu.
3. Epifloresans mikroskobu ile 4D görüntü embriyolar (x, y, z ve zaman atlamalı). Bir wi birini kullanındefield sistemi [GFP ve TexasRed için filtreler, 60X veya 100X, yüksek çözünürlüklü bir CCD (şarj bağlı cihaz) kamera için hedefleri kadar olan otomatik floresan mikroskop, yüksek sahne motorlu (örn.. Piezo Z) ve özel toplama yazılımı] veya bir Livescan alan süpürüldü konfokal mikroskop [100X, bir EMCCD (elektron çarpılması CCD) kamera için 488 nm ve 561 nm lazerler, hedefleri yukarı ile floresan mikroskop tarama otomatik, yüksek (örneğin Piezo Z) ve özel toplama yazılım aşamasına motorlu]. Not: widefield sistemi için, LED'ler ve bir EMCCD kamera kullanarak fototoksisite sınırlayacaktır. Ayrıca, döner disk konfokal mikroskop süpürüldü alan sistem yerine kullanılabilir.
4. Her iki sistemde görüntü neuroblast hücre bölünmesi, x bulmak, y 10X veya 20X hedefleri kullanarak embriyo çerçeveleri, ve optimal x, embriyolar dorsal ardalanmasına geçiyor y çerçevesini seçin (adım önce ventral kasasına; Şekil 1A) ya da erken aşamalarındaventral muhafazanın (~ ilk hücre bölünmesi sonrası 350 dakika; Şekil 1A).
5. Süpürüldü alan mikroskobu, 50 bir yarık ile% 40 güçte 488 nm ve 561 nm 100 mW lazer kullanır. Widefield sisteminde, düşük-orta ışık yoğunluğu (kontrol ise) ile GFP ve TexasRed filtreleri kullanın. Not: widefield sistemi için LED'ler, düşük fototoksisite ve tercih edilir.
6. Her iki sistemde, 60X ya da 100X yağ daldırma kullanım amacı ve 10 dakikalık bir toplam 0.2 mikron her 2 dakika 20 Z-yığınlar toplar. Not: Her ne kadar HAM-1: GFP ve MCherry: PH sondalar nispeten yüksek seviyelerde ifade, her sonda için pozlama süreleri farklı mikroskoplar için optimize edilmiş olması gerekir. Not: geniş açılı bir sistem için, daha az Z-yığınları fototoksisite sınırlamak için tavsiye edilir ve daha uzun süreler boyunca görüntüleme için, daha az zaman noktalarını kullanın.
7. Bir merc kullanıyorsanız (widefield sistemde UV ışığına embriyoların pozlama neden fototoksisite en aza indirmek içinUry ampul),% 30 açıklığı kapatmak ve () ayarlanabilir aydınlatma sistemini kullanarak ışık yoğunluğunu azaltmak. Not: kazanç sistemi kullanılarak gerekli değildir, ancak diğer uygun mikroskoplar piksel yoğunluğunun görüntüler elde etmek için kazanç kullanılmasını gerektirebilir farklı sayısal açıklık, daha düşük yoğunluklarda ve amaçları ile ışık kaynağı olabilir. Herhangi gözlenen fenotipleri artifaktüel fototoksisite nedeniyle değil emin olmak için bir kontrol embriyo kullanarak koşulları test.

6. Mikroskopi Verilerin Analizi

1. TIFF gibi görüntüleri, ihracat dosyaları analiz etmek ve böyle bir Java tabanlı görüntü işleme programında (örneğin ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/) gibi özel yazılımlar kullanarak bir yığın olarak TIFF dosyalarını açmak için. Not: görüntüleri toplamak için kullanılan toplama yazılımı bağlı olarak, dosyalar orijinal haliyle muhafaza edilebilir ve ImageJ açıldı. Meta dosyaları ile tutulur gibi bu tercih edilir.
2. Yığını ayırın'görüntüler' basıp zaman noktaları ve istediğiniz gibi Z-uçakları içine. Not: 20 Z-uçaklık bir yığın alınmış olmasına rağmen, neuroblasts birçok <1 ortalarında geç embriyonik dönemde kalın um ve sadece birkaç Z-uçakları ihtiyaç vardır.
3. Her zaman noktası için seçilen Z uçakları yeniden düzeltin ve ayrı Z-yığın projeksiyonları yapmak. Daha sonra, her zaman için çıkıntılar bir zaman sekansına yapmak için bir araya etmektedir yığını.
4. Her kanal için parlaklık / kontrast ve veya ayarlamalar yapın.
5. Ardından, ilgi, mahsulün bir bölge seçmek (ve gerekirse döndürmek) bölgesi.
6. 'Birleştirilmiş kanalların' fonksiyonunu kullanarak Birleştirilmiş görüntüler oluşturmak ve her bir kanal için farklı bir renk seçin. RGB birleştirilen görüntüleri dönüştürün.
7. Daha net görüntüleri görselleştirmek için adımlar 6.3 veya 6.4 ('edit' başlığı altında kullanım 'invert' fonksiyonu) her kanal için gri tonlu görüntüleri ters çevirin.
8. Vektör tabanlı yazılımı rakamlar yapmak için 8-bit TIFF gibi tüm son görüntüleri kaydetprogramları veya Quicktime dosyaları film yapmak gibidir.
9. Pixel boyutu ölçümleri (örneğin, görüntüler ile bir ölçek çubuğu dahil) gerekli olup olmadığını, embriyonun boyutunu ölçmek için ImageJ, ya da diğer görüntü işleme yazılımı kullanın. Not: Farklı hedefleri kullanarak toplanan Görüntüler farklı piksel boyutlarına sahip olacak.

Bu deneysel protokol nasıl C. görüntü hücre bölünmesi açıklanmaktadır elegans ortalarında Embriyogenez sırasında embriyolar. Özellikle, epidermal morfolojilerinden kolaylaştırabilir ki ne resim neuroblasts için tarif etmektedir. Epidermal morfogenez nedeniyle epidermal hücre şekli değişiklikleri, göç ve yapışma, aynı zamanda altında yatan neuroblasts (Şekil 1 B) kimyasal ya da mekanik ipuçları dayanır bir arada oluşur. Nöro-blastlar göç ^10,14,25 düzenleyen ventral epidermal hücrelerin yüzeyi üzerindeki reseptörler ile alınan yönlendirme ipuçları salgılar. Ayrıca, nöro-ventral epidermal hücrelerin ²⁶ göç katkı mekanik kuvvetler sağlamak olabilir ki, yüksek proliferatif. Bu protokol, orta embriyojenez sırasında neuroblast hücre bölünmesi incelemek için kullanılabilir. Birincisi, neuroblasts görselleştirmek için belirteçleri coexpressing embriyolar: sitokineze geçiren (HAM-1 GFP) (mCherry: PH) oluşturulur. HAM-1: GFP GFP (yeşil floresan protein) çekirdek ²⁷ neuroblast lokalize protein etiketli ifade eder ve orta embriyojenez sırasında mevcut bir çok diğer hücre tipleri (> 300 hücre, Şekil 3) vardır çünkü kullanmak gereklidir. DNA, mitoz sırasında kromozomların yoğunlaşır, bu durum, aynı zamanda, hücre bölünmesi için iyi bir belirteci olarak işlev görür. MCherry: PH anne promoteri (pasta-1) ile ifade edilen bir mCherry-etiketli floresan protein ve hücre zarlarına lokalize PLC1 ∂ 1 ile 28 arasındaki lipid bağlama alanını içerir. Şekil 3;, Video 1) Bu protein, zar ve sitosol iki yavru hücrelere ana hücrenin ayrılması için tutam zaman, sitokinez görselleştirmek için gereklidir. , Diğer belirteçler diğer hücre tiplerini görselleştirmek için kullanılan olabilir: Bu protokol nasıl (GFP ifade HAM-1 ile gösterilen) görüntü neuroblast bölümü, açıklanır rağmen.

Neuroblasts bölünmesi görselleştirmek için, embriyolar coexpsalamura HAM-1: GFP ve MCherry: PH (10 dakikalık bir toplam) her 2 dakikada bir görüntülü. Her neuroblast çapı sadece 1-4 ~ mikron ve 1 mikron kalınlığında (örn.. 100X) ile bir objektif kullanmak en iyisidir. Ayrıca, çok sayıda Z-yığınları (~ 20) (şekil olarak küresel) her hücrenin çeşitli açıları görüntülü emin olmak için küçük bir adım boyutu (0.2 mikron) ile toplanır. Zaman noktaları ödün vermeden bu pek görüntüleri toplamak için, bir çok motorlu aşama (örneğin Piezo Z Aşama) tavsiye edilir. Görüntüler bir dizi toplama sonra, DNA, yoğunlaştınlır membran ingressed ve yeni kız hücreler (birleştirilmiş kanal öngörülen istifinin zaman noktaları oluşturan, bölünen birkaç Z-yığınları içinde hücreleri bulmak için analiz edilmektedir ) video 1, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, ve birleştirilmiş kanallarının seçilmiş yığınları Şekil 3B'de gösterilmiştir. Daha iyi hücreleri görselleştirmek için, önerilirGri tonlamalı her kanalı tutmak ve (Şekil 4) görüntüleri ters.

Görüntü çözünürlüğü, yüksek çözünürlüklü CCD kamera (1344 x 1024 piksel) vs kullanarak widefield sistemi için farklıdır. yüksek hassasiyet (~ 35 kare / sn ve 512 x 512 piksel) ile yüksek hızlı EMCCD kamerayı kullanarak süpürüldü alan sistem. Her iki sistemde ile çekilen kontrol embriyolar neuroblasts bölen ters çevrilmiş görüntüleri karşılaştırılması (. Vs 5 Şekil 4) sunulmaktadır. Şekil 4A (Widefield sistemi; Video 2) gösterildiği gibi., Görüntüleri Şekil 5A vs daha net (süpürüldü alan sistem, Video 4). Widefield sistemini kullanarak Ancak, embriyolar fototoksisite duyarlıdır ve daha hızlı bir zaman noktaları yüksek çözünürlüklü kamera ile mümkün değildir. Örneğin, çeşitli proteinlerin lokalizasyonu (örneğin,. T değişiklikleri incelemeko) kendi dinamikleri değişiklikleri incelemek, zaman noktaları daha sık toplanan gerekebilir. Ayrıca, Z-yığınları ve zaman noktalarının sayısını azaltmadan daha uzun süre için görüntünün mümkün olmayabilir. Widefield sistemde bir EMCCD kamera kullanarak görüntüleme uygulamaları geniş bir yelpazede izin verebilir. Yüksek çözünürlük ve yüksek hız hem de sahip kameralar geliştirilmiştir, ancak sürücüleri kullanılan satın alma yazılıma bağlı olarak mevcut olmayabilir, ve hala EMCCD kameralar gibi hassas olmayabilir. Genel olarak görüntüleme C için kullanılan bir başka sistem elegans da alt fototoksisite vardır ve (Tartışma) EMCCD veya CCD ya kameralarla donatılmış olabilir dönen disk konfokal vardır.

(, Bölüm 1.2 ve protokol 3 bakınız, örneğin ani-1) ve bunların contro embriyolar aynı şekilde görüntülenmiş hücre bölünmesi için gerekli olan genleri incelemek için, çift cinsiyetli ilgi konusu bir gene karşı RNAi ile muamele edilirl embriyolar. Embriyolar kontrol RNAi embriyolardan hücre karşılaştırmak için, (maç hücre şekilleri ve pozisyonları yardım) embriyonik gelişim benzer aşamalarında görüntünün en iyisidir. Örneğin, görüntüleme neuroblasts için iyi bir referans noktası olarak hareket (Şekil 4 ve 5) için ventral muhafaza sırasında embriyonun merkezinde görünür büyük bir hücre vardır. Gen burada çalışılan, ani-1 (anillin), aktomizin kasılma düzenler, fakat erken embriyo ^23,29-30 in sitokinez için gerekli ^değildir. Anillin en homologları, ancak, daha yüksek ökaryotlarda ¹⁶ sitokinez için gerekli olan ve ani-1 neuroblast sitokinez (FOTOPOULOS, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) için gereklidir. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, (Video 3) ve 5B (Video 5), çeşitli nöro-sitokinez başlatmak ve membranlar olarak tutam, ancak bunun yerine iki ayrı kızı oluşturabilenHücreler, bunların membranlar gerileme ve hücreler, (> 1 çekirdek / hücre) çok çekirdekli hale gelir. Bu ani-1 Bu protokol ile ortaya değildir, diğer hücre türlerinin bölünme ya da şekil değişikliği için gerekli olabileceğini belirtmek gerekir. Ayrıca, bu protokol doku spesifik RNAi (Tartışma) sonuçlarını göstermek değildir.

Şekil 1. C. sırasında ventral muhafaza elegans epidermal morfogenez. Bir kontrol ajm-1 A) Z-yığın projeksiyonları (0.5 mikron kalınlığında 3 Z-yığınlarının): GFP (epidermal hücre sınırlarını görselleştirmek adherens kavşak işaretleyici; CGC SU159 suşu ID) embriyo geçiren dorsal ardalaması (sol, dorsal görünümü ) ve bir kontrol AJM-1: GFP embriyo geçiren ventral muhafaza (sağ, ventral görünüş). Görüntüler daha iyi vis döndürülürhücre sınırlarını ualize. B) Çizgi C ventral görünümleri göstermek ventral muhafaza geçiren elegans embriyolar. Öncelikle, öncü hücreler (mavi) iki çift ventral orta hat (solda embriyo) doğru göç aktin zengin filopodia (siyah çizgiler) kullanın. (; Siyah noktalı çizgi / daire, yara iyileşmesi anımsatan B ') ²⁵ Sonraki, posterior ventral cep hücreleri (kırmızı), bir mekanizma gibi bir çanta dize ile kapanabilir ventral yüzeyinde delik oluştururken orta hatta doğru göç ederler. Ayrıca (gri daire gibi) temel Nöroblastlar da gösterilmiştir. İkinci embriyo (B ") epidermal hücrelerin spesifik alt kümelerinin göç PLX-2/plexin ve VAB-1/Ephrin reseptör ifade 'plexin bant' hücreleri (yeşil düzenlemesiyle oluşan bir 'köprü' tarafından yönlendirildiğini gösterir daireler). resmi büyütmek için buraya tıklayın.

C. Şekil 2. ANI-1 lokalizasyonu elegans embriyolar. A) sabit bir C. HMR-1 ifade elegans embriyo: GFP; GFP (yeşil) ve ANI-1 (kırmızı) için costained (E-kaderin epidermal hücre sınırları marker). . Dış hücre katmanları (kalınlığı 0.2 um 4 Z-yığınlarının) konfokal görüntüleri N2 ve N2 Sabit örten epidermal hücreleri ve ANI-1 pozitif B, altta yatan neuroblasts) göstermek; ani-1 RNAi embriyolar için lekeli işbirliği vardır ANI-1. ANI-1 büyük ölçüde ani-1-tükenmiş embriyo azalır. Ölçek çubukları:. 10 mikron büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,. Görselleştirme C. sırasında neuroblast bölünmesi elegans embriyogenezis. Ve MCherry GFP (yeşil neuroblast çekirdek görselleştirmek için): (A) Z-yığın uzantısı (kalınlığı 0,2 um ile 20 Z-yığınlarının) HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyodan gösterilmiştir PH (hücre zarları görselleştirmek için kırmızı) . Birçok Nöroblastlar ve diğer hücre tipleri projeksiyonlar görünür Z uçaklar daha küçük bir sayı kullanarak (B) Z-yığın projeksiyonlar coexpressing başka bir kontrol embriyo gösterilmiştir HAM-1:. GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Bir alan daha net bir bireysel bölme neuroblast göstermek için (beyaz kutu) büyütülür. Beyaz ok başları yeni mitoz sırasında yoğunlaştırılmış DNA vurgulamak ve bir bölme hücre ve yeşil çevrelerin ingressing plazma zarı işaretmitoz sonuna doğru kız çekirdekleri oluşturulur. Büyük hücreli embriyonun içinde gelişim aşamasını ve konumunu belirlemek için bir referans noktası (beyaz yıldız) olarak hizmet vermektedir. Ölçek çubukları:. 10 mikron (beyaz) ve 3.5 mikron (sarı) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 4. C. sırasında neuroblast sitokineze görselleştirme elegans bir widefield sistemini kullanarak Embriyogenezis. A) Ters Z-yığın projeksiyonları (kalınlığı 0.2 mikron 2 Z-yığınlarının) coexpressing bir kontrol embriyo gösterilmiştir HAM-1: GFP ve mCherry: yüksek çözünürlüklü bir CCD kamera kullanarak widefield sisteminden toplanan PH. Kırmızı oklar i ile bölünmesi nöroblast işaretHücre zarları ngressing. Yeşil çevrelerinde mitoz erken aşamalarında özet DNA vurgulamak veya yeni mitoz / sitokinez sonuna doğru kızı çekirdek oluşturarak. Gösterilen büyük hücreli gelişim evresini belirlemek için bir referans noktası (sarı yıldız) olarak hizmet vermektedir. B) Images) A benzer, fakat ani-1 RNAi ile tedavi bir embriyo vardır. Hücre zarı hücre mitoz yoluyla ilerler ancak çok çekirdekli hücre bırakarak, kısa bir süre sonra rahatlatır olarak ingresses. Ölçek çubuğu:. 10 mikron (siyah), 3.5 mikron (sarı) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 5. C. sırasında neuroblast sitokineze görselleştirme elegans süpürdü alan sistemi kullanılarak Embriyogenezis. 0.2 mikron (toplam 0.4 mikron 2 Z-yığınlarının) A) Ters Z-yığın projeksiyonları HAM-1 coexpressing bir embriyodan gösterilir: GFP ve MCherry: yüksek hassasiyet ile bir EMCCD kamera kullanarak süpürüldü alan sistem toplanan PH, ama düşük çözünürlük. Bir neuroblast geçiren sitokinez için kırmızı ok ucu noktaları. Yeşil çevrelerinde mitoz ve sitokinez sonra yeni oluşan kızı çekirdeklerin sırasında yoğunlaştırılmış DNA vurgulayın. Büyük hücreli gelişim evresini belirlemek için bir referans noktası (sarı yıldız) olarak hizmet vermektedir. Gösterilmiştir B) Images) A benzer, fakat ani-1 RNAi ile tedavi bir embriyo, ve 3 Z-yığınlarının (toplam 0.6 mikron kullanılmaktadır .) Yukarıda tarif edildiği gibi, daha sonra zar mitoz yoluyla hücre ilerledikçe olarak giriş yapan, fakat, hücre çok çekirdekli olmasına neden rahatlatır. Ölçek çubuğu: 10 mikron (siyah), 3.5 mikron (sarı).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Video 1. C. sırasında bölünmesi neuroblasts görselleştirme elegans embriyogenezis. HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonlar: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Widefield mikroskop toplanan Görüntüler her iki kanal için gösterilmiştir. Video Şekil 3B üçüncü panelinde gösterilen embriyo gelir. Videoyu izlemek için tıklayın.

Video 2. C. sırasında bölünmesi neuroblasts görselleştirme elegans embriyogenezis. HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonlar: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video mCherry için widefield mikroskop toplanan ters görüntülere karşılık: PH kanal only (Şekil 4A embriyo). Videoyu izlemek için tıklayın.

Video 3. C. sırasında bölünmesi neuroblasts görselleştirme elegans embriyogenezis. Bir ani-1 RNAi tedavi edilen embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonları coexpressing HAM-1: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video mCherry için widefield mikroskop toplanan ters görüntülere karşılık gelir:. PH kanal sadece (Şekil 4B embriyo) video izlemek için tıklayınız.

Video 4. C. sırasında neuroblast bölünmesi görselleştirme elegans embriyogenezis. HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonlar: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video ters tekabülmCherry için süpürüldü alan konfokal mikroskop toplanan görüntüleri ed:. PH kanal sadece (Şekil 5A embriyo) video izlemek için tıklayınız.

Video 5. C. sırasında neuroblast bölünmesi görselleştirme elegans embriyogenezis. Bir ani-1 RNAi tedavi edilen embriyo üç Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonları HAM-1 coexpressing: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video mCherry için süpürüldü alan konfokal mikroskop toplanan ters görüntülere karşılık gelir:. PH kanal sadece (Şekil 5B embriyo) video izlemek için tıklayınız.

Bu protokol, orta embriyojenez sırasında görüntü hücre bölünmesi için mikroskopla çeşitli kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol nasıl epidermal morfogenetiğine kolaylaştırabilir neuroblasts bölünme hücreleri görüntü vurguluyor. Hücre-hücre iletişimi metazoan gelişimi ve C. sırasında doku oluşumu için önemlidir elegans in vivo doku oluşumunu incelemek için mükemmel bir model. Güzel dokuların etkileşimi canlandıran bir olay epitel hücrelerinin bir tabakası içinde embriyo kapsayan, epidermal morfogenez olduğunu. Özellikle, ventral muhafaza ventral epidermal hücreler, embriyo ventral yüzeyi içine göç işlemi, ve altta yatan neuroblasts dayanır. Nöro-blastlar, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlamak ve neuroblasts konumu değiştirilmiş olması durumunda ventral muhafaza taviz verilmektedir. Ventral muhafaza düzgün gerçekleşmesi için neuroblasts sayısı (veya kutup) de gerekli olabilirve onların bölünme düzenleyen mekanizmaları anlamak önemlidir. Bu protokol nasıl görüntü hücre bölünmesi C. kullanarak yaşayan bir doku içinde açıklanır elegans iki flüoresan millerini (MCherry: PH plazma zarları ve HAM-1 anahat: neuroblast çekirdeklerini etiketlemek için GFP) coexpressing embriyolar.
C canlı görüntüye en önemli adımlar elegans floresan probları ifade embriyolar: i) ii) doku oluşumu sırasında gen gereksinimleri çalışma için mutantlarının kullanımı ya da RNAi, 20-25 ° C de muhafaza arzu edilen flüoresan işaretçileri sentezleyen sağlıklı, genç, ergin hermafrodit bireyler () kullanın iii) en embriyolar toplamak mikroskopi için doğru aşama (örneğin. orta embriyogenezis), ve iv) düşük fototoksisite tutmak için optimize edilmiş ayarlar kullanılarak floresan mikroskopi gerçekleştirmek, ancak yüksek görüntü kalitesini korumak için.

Belirli bir hücre ve / veya ilgi konusu bir dokuda hücre içi bölmelere belirlemek için, pro floresan ile etiketlenmiş işaretlerini ifade solucan kullanımıbes. Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) birden fazla belirteci birlikte ifade suşları sunar. Ancak, iki suş (her ilgi tek bir işaretleyici ifade) stabil hem sondalar ifade bir yük oluşturmak için birkaç kuşak boyunca geçti ve bir floresan mikroskop ile taranarak gerekebilir. Neuroblast çekirdekleri görselleştirmek için bir işaretleyici ifade eden bir suşu ile çaprazlandı;: Örneğin, bu deney protokolü, hücre zarının (OP70 PH mCherry) görselleştirmek için bir işaretleyici ifade eden bir baskı yapmak için (HAM-1: GFP; OP102) oluşturmak için bir hem coexpressing süzün.

Embriyonik gelişim sırasında gen gereksinimleri çalışma için en iyi yolu, gen ürünü devrilen ya da mutasyona uğramış fonksiyon deneyleri, kaybı yapmaktır. Bu deneysel protokol anillin (ani-1), embriyonik dokularda endojen ANI-1 seviyelerini azaltmak için karşı RNAi performans açıklar. Hiçbir iyi karakterize hypomorphic allelleri vardırani-1. Bu nedenle, RNAi fonksiyon fenotipleri ani-1 'in kaybını incelemek ve embriyonik gelişim sırasında işlevini belirlemek için en iyi seçenektir. Tipik olarak, bu Nakavt verimliliği değişken olabilir gibi, yerine RNAİ'nin mutantlar kullanmak daha iyidir ve nadiren null. RNAi protokolleri besleme ile karşılaşılan en yaygın sorunlardan biri RNAi verimliliğini azaltacak, kirliliktir. , Kontaminasyon riskini azaltmak aseptik koşullarda RNAi tabak ve yemek hazırlamak için. Kirlilik, kullanımdan önce, levhaların bir kaç tarama ile tespit edilebilir, ve sütlü / opak görünümlü bakterileri ile plakalar atılmalıdır. RNAi verimliliği azaltabilir başka bir sorun doğru gelişim aşamasında çift cinsiyetli seçerek değil gereğidir. Hiçbir / birkaç döllenmiş embriyo var L4-sahnelenen veya genç erişkin solucanlar (gelişmekte vulva solucanın ventral tarafında beyazımsı daire / delik gibi görünür), kullanmak en iyisidir. Ayrıca, RNAi koşulları ve tedavi mBugün, farklı gen ürünleri için değişir. RNAİ'nin gücünü artırmak veya azaltmak için farklı yollar solucanlar üzerinde tutulur (Bölüm 1.2.2 bakınız) LB Amp medya farklı miktarlarda peletlendi HT115 bakteri resuspending ve RNAi tedavi (zamanın uzunluğu süresini değiştirerek gereğidir RNAi plakaları;) Protokolü 3 bkz. Bu protokol için uygun ani-1 RNAi fenotipleri elde etmek için, bakterileri LB Amp ortam ve solucanlar 500 ul içerisinde yeniden süspanse edildi (ani-1 RNAi önceden Maddox vd. ²³ ile karakterize edilir), 2 gün boyunca RNAi plakalar üzerinde tutuldu. RNAi dirençli veya duyarlı suşlar (örn.. Rde-1 sid-1 veya rrf-3), aynı zamanda RNAi gücünü değiştirmek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu suşlar doku hassas suşları yaratmak için yabani tip genlerinin doku spesifik ifade ile akuple edilebilir. Örneğin, belirli bir neuroblast RNAi gerçekleştirmek için, tek bir wt ifade sid-1 mutant embriyolar (RNAi dirençli) kullanabilir Sid-1 unc-119 organizatörü (CGC TU3401 suşu ID) ³¹ altında.

Bu protokol nasıl görüntü neuroblast hücre bölünmesi orta Embriyogenez sırasında açıklanır. Uygun Z-yığınlar toplama ve görüntü kalitesinden ödün vermeden fototoksisite en aza indirmek için görüntüleme koşulları optimize, bu tür embriyoların gelişimsel aşaması olarak, dikkatli bir değerlendirme gerektirir protokolün birçok yönleri vardır. Doğru gelişim aşamasında (örn. ventral muhafaza) de zaman noktalarını yakalamak için, embriyolar (; Şekil 1A6 embriyonun sırt tarafında epidermis bir tek tabaka oluşturmak için dorsal epidermal hücrelerin çiftleri interdigitate ve sigorta) dorsal birleşmesinden filme edilmelidir. Şu anda, nöro hızla bölünen. Embriyoların evreleme (örneğin mikroskop kullanılarak), düşük büyütme altında zor olabilir bu yana, en farklı aşamaları ve embriyoların birçok embriyolar toplamak için yardımcı olurDoğru kademe yüksek büyütme kullanılarak seçilebilir.

Nöroblastomun nispeten küçük ve ince ve embriyo ortasında boyunca bulunur. Bu, tüm hücre bölünmesi sırasında yakalanan olduğundan emin olmak için Z-yığınlarının sayısını ve boyutunu optimize etmek için gereklidir. Örneğin, çok fazla görüntü toplama daha fazla ışığa maruz embriyolar ve fototoksisite onları eğilimli yapacaktır. Ancak, çok az sayıda Z-yığınlarının toplanması veya kalın Z bölümleri kullanarak zor bütün bir bölme neuroblast hücre düzgün görüntü için yapabilir.
Bu protokol, görüntü neuroblast hücre bölünmesi için bir süpürüldü alan konfokal mikroskop ya da geniş açılı sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Daha önce tarif edildiği gibi, bir geniş açılı epifluorescent mikroskop kullanılarak ana sınırlamaları bir fototoksisite için potansiyeldir. Son derece görüntüleme C için dönen bir disk konfokal veya süpürüldü alan konfokal kullanılması tavsiye edilirken elegans embriyolar, bazı laboratuvarlar bu sistemlerin sınırlı erişimi olabilir. Bu potokol gibi,% 30 açıklığı kapatarak cıva ampul (veya tercihen LED'leri kullanarak) gelen ışığın yoğunluğunu azaltan, EMCCD kamera kullanarak ve kazanç artan veya izin kutulamanın gibi widefield sistemlerini kullanırken fototoksisite sınırlamak için bazı öneriler verir Maruz kalma süresi bir azalma. Z-yığınları ve zaman noktalarının sayısı da bir widefield sistemi kullanılarak sınırlı olacaktır. Bu protokolde tarif edilmemiş olsa da, bir geniş açılı mikroskop ile karşılaştırıldığında daha düşük fototoksisite neden olarak, dönen disk konfokal mikroskop yaygın canlı görüntüleme için kullanılır. Süpürüldü alan sistemine benzer, katı hal lazer kullanan ve saçar (her ne kadar süpürüldü alanında vs farklı bir şekilde). CCD veya EMCCD Ya kameralar genellikle çift görüntüleme izin için birden fazla kamera portu vardır dönen disk sistemi ile kullanılabilir. Süpürüldü alan mikroskobu benzer görüntüler widefield sistemi vs pozlama süreleri% 50-90 daha düşük ile yakalanabilir.
Bu protocol doku oluşumu sırasında mitoz düzenleyen çeşitli genlerin işlevini incelemek için kullanılabilir. Her görüntü arasındaki süre kısaltılmış olabilir (örneğin.. 2-3 dk vs her 15-30 sn) daha iyi mitotik fenotipleri görselleştirmek için. Farklı probları kullanılabilir (örneğin, yerine HAM-1 kullanarak:. GFP, floresan-etiketli DNA H2B görselleştirmek için kullanılabilir ve / veya floresan tübülin mitotik iğ görselleştirmek için kullanılabilir etiketli). Z-yığınları ve her bir yığını için kalınlığı sayısı da (daha küçük bir basamak boyutu, örneğin daha fazla yığınları) değiştirilebilir. Uygun ayarları seçimi, yukarıda tarif edildiği gibi, fototoksisite sınırlayan ve görüntü kalitesini optimize etmek için çok önemlidir. Olsa MCherry: PH ve HAM-1: GFP sondalar mümkün olmayabilir, bu protokolü açıklanan ne vs uzun süre Z-yığınlarının veya görüntüleme sayısını artırarak, daha hızlı puan toplayarak, nispeten yüksek seviyelerde ifade Bir widefield sistemi üzerinde.
Java tabanlı imyaş işleme programı (İmageJ, NIH) farklı mikroskoplar ve görüntüleri ile toplanan görüntüleri işlemek için kullanılabilir TIFF olarak ihraç edilebilir. Ancak, satın alma için kullanılan yazılıma bağlı olarak, dosyalar zaten işleme yazılımı ile uyumlu olabilir. Meta özgün dosyaları ile tutulur, çünkü orijinal dosyaları vs ihraç görüntüleri (örn. TIFF) açmak için iyidir. Işleme yazılımı rakamlar veya film yapmak için görüntüleri işlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, kantitatif analiz, aynı zamanda, seçilmiş bölgelerde piksel yoğunlukları ölçüm olarak, gerçekleştirilebilir. Optimal yazılım gibi Görüntü İşleme Toolbox (MathWorks, Matlab) veya 3D ve 4D Real-Time Etkileşimli veri görselleştirme (Imaris, Bitplane) gibi, analize bağlı olarak seçilmelidir.
Bu protokolü kullanarak, ani-1 Bu erken embriyo sitokinez için gerekli olmasa da, neuroblast sitokinez için gerekli olduğu gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, nu kontrol ederekNöro-blastlar örten epitel hücrelerine, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlamak için mber ve neuroblasts konumu, ani-1, ventral muhafazası için ventral epidermal hücrelerin göçünü düzenleyebilir. Ani-1 ara geç embriyojenez sırasında bölünme ya da diğer hücre tipleri şekil değişikliği için gerekli olan, ancak, bu bilinmemektedir. Bir doku genel bileşimi komşu dokuları nasıl etkilediğini gösteren metazoan gelişimi sırasında doku iletişimin önemini vurgulamaktadır.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yazarlar bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) hibe Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenen olduğunu kabul etmek istiyorum.