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Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild teilenden Zellen innerhalb eines Gewebes in Caenorhabditis elegans Embryonen. Während mehrere Protokolle beschreiben, wie Bild der Zellteilung im frühen Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Entwicklungs Gewebe während der Embryogenese Mitte spät.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um Bildteilenden Zellen in den Entwicklungs Caenorhabditis elegans Embryonen. Insbesondere konzentriert sich dieses Protokoll auf, wie man Bild Division Neuroblasten, die unterhalb der epidermalen Zellen zu finden sind und kann wichtig für den epidermalen Morphogenese sein. Gewebebildung ist entscheidend für die Entwicklung Metazoen und setzt auf externe Signale von benachbarten Geweben. C elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus zur Morphogenese in vivo aufgrund seiner Transparenz und einfache Organisation zu studieren, was seine Gewebe einfach über Mikroskopie zu untersuchen. Ventralen Gehäuse ist der Prozess, wo die ventrale Oberfläche des Embryos durch eine einzige Schicht von Epithelzellen bedeckt. Dieses Ereignis wird angenommen, durch die zugrunde liegenden Neuroblasten, die chemische Führungssignale bereitzustellen, um die Migration der darüberliegenden Epithelzellen vermitteln erleichtert werden. Jedoch sind die Neuroblasten hochproliferative und kann auch handelnals mechanischer Träger für die ventrale Epidermiszellen. Studien mit diesen experimentellen Protokoll könnte die Bedeutung der interzellulären Kommunikation bei der Gewebebildung zu enthüllen, und könnte verwendet werden, um die Rollen von Genen in die Zellteilung in sich entwickelnden Geweben beteiligt zu offenbaren.
Zwar gibt es Protokolle, die beschreiben, wie Bild der Zellteilung in der frühen C elegans Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Gewebe während der Embryogenese Mitte. Eine der großen Herausforderungen bei der Abbildung Organismen während der Entwicklung ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität. Allerdings hat erhöhte Zugänglichkeit zu drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopen oder Wischfeld-Mikroskopen weiter verbreitet Imaging-Anwendungen erlaubt. Beide Systeme verwenden Festkörperlaser und gestreuten Lichts, die Begrenzung der Pegel von UV, das die Organismen ausgesetzt sind. Allerdings kann Weitfeld steht immer noch für die Bildgebung in vivo verwendet werden, insbesondere, wenn sie mit Kameras mit hoher Empfindlichkeit (z. B. EMCCD), Blendensteuerung und Lichtsteuerung (zB LEDs oder verstellbare Quecksilberbirnen) ausgestattet. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie entweder auf der Basis eines konfokalen System oder ein Weitfeld-System, um Bild die Zellteilung in den Entwicklungs C verwenden elegans </ Em> Embryos. Als wir beispielsweise, wie man Bild Neuroblast Zellteilung zu beschreiben. Neuroblasten kann epidermalen Morphogenese durch chemische oder mechanische Signale zu den darüberliegenden Epidermiszellen zu erleichtern, und liefern ein ausgezeichnetes Beispiel für die Bedeutung der interzellulären Kommunikation bei der Bildung von Geweben.
Caenorhabditis elegans ist ein idealer Modellorganismus für die Mikroskopie basierte Studien aufgrund seiner Transparenz und einfache Gewebeorganisation ein. Außerdem C. elegans zugänglich ist genetischen Methoden und RNAi, und da viele der Gene humanen Homologen, kann es verwendet werden, um konservierte Mechanismen zur Gewebebildung 2-5 identifizieren. In C. elegans, die Bildung der Epidermis tritt in der Zwischenembryogenese, wenn der Embryo> 300 Zellen. Epidermalen Morphogenese besteht aus mehreren Hauptphasen, in denen der Embryo wird in eine Schicht aus epidermalen Zellen, eingeschlossen verengen und zu erweitern, um die Transformation embryo aus eiförmigen Form in die längliche Form eines Schnecken 6. Ventrale Gehäuse beschreibt eine der morphogenetischen Ereignisse, als die ventralen epidermalen Zellen wandern in Richtung der ventralen Mittellinie, um die Bauchseite des Embryos (Abbildung 1) zu decken. Zuerst werden zwei Paare von vorderen Führungskante liegt Zellen wandern in Richtung der ventralen Mittellinie, wo sie anhaften und Sicherung mit ihren Nachbarn kontralateralen 6. Dies wird durch die Migration der hinteren Tasche befindet sich Zellen, die keilartige Formen Schaffung einer Bauchtasche 6-7 bilden gefolgt. Der Mechanismus, der die Tasche geschlossen ist nicht gut verstanden. Eine Möglichkeit ist, dass eine supra Aktin-Myosin kontraktile Struktur bindet die Tasche Zellen zusammen in einer Tabaksbeutel wie Mode, ähnlich wie Wundheilungs 8. Interessanterweise wird die Migration einiger der Tasche Zellen durch spezifische Teilmengen von Basisneuroblasten 9 (neuronale Vorläufer, die unter der epidermi gefunden werden vermitteltens, Fig. 1B).
Frühere Studien zeigten, dass die Neuroblasten regulieren ventralen epidermalen Zellmigration und ventralen Gehäuse. VAB-1 (Ephrin-Rezeptor) und VAB-2 (Ephrin-Liganden) sind hoch in der Neuroblasten ausgedrückt und voneinander erleichtert das Sortieren der vorderen und hinteren Neuroblasten und Mutationen in vab-1-oder-2 vab Ursache ventralen Gehäuse Phänotypen 10-13. Jedoch Promotor Rettungsexperimente zeigten, daß VAB-1 wird auch in der darüberliegenden Bauch epidermalen Zellen und Rezeptoren für andere Führungssignale von den Neuroblasten sezerniert erforderlich sind in den ventralen Hautzellen 9 ausgedrückt. Obwohl Mutationen in einem dieser Rezeptoren verursachen Bauch Gehäuse Phänotypen, ist es nicht klar, ob Defekte entstehen durch Probleme in der Neuroblast Positionierung oder durch Ausfall der ventralen epidermalen Zellen zu reagieren Führung 14 Queues. Ändern der Teilung der Neuroblasten wiThout die ihre Fähigkeit, Führungssignale absondern könnte Licht auf die Rolle der Neuroblasten und ihre Fähigkeit, mechanische Eingangs während epidermalen Morphogenese bieten zu vergießen. Kürzlich wurde festgestellt, daß eine Zellteilung Gen ani-1 (Anillin) ist hoch in Neuroblasten (2A) ausgedrückt und seine Erschöpfung verursacht Neuroblasten Teilungsfehler. Interessant ist, dass diese Embryonen anzuzeigen ventralen Gehäuse Phänotypen (Fotopoulos, Wernicke und Piekny, unveröffentlichte Beobachtungen).
Anillin ist für die Zellteilung erforderlich ist, und insbesondere für die Cytokinese, die das Verfahren, bei dem eine Mutterzelle physikalisch unterteilt in zwei Tochterzellen beschreibt. Zytokinese wird durch die Bildung eines Aktomyosin Kontraktionsring, der fest in Raum und Zeit gesteuert werden, um sicherzustellen, dass er richtig mit Schwester-Chromatid-Trennung gekoppelt werden muss angetrieben. Die Master-Regulator der Zellteilung ist metazoan RhoA (RHO-1 in C. elegans), eine kleine GTPase, die eine istctive in seiner GTP-gebundenen Form. Die GEF Ect2/ECT-2 RhoA aktiviert, nach der RhoA-GTP interagiert mit Effektoren, die die Kontraktionsring zu bilden und zu vermitteln seine Eindringen 15. Anillin ist ein Multidomänen-Protein, das RhoA über seinen C-Terminus und an Actin und Myosin über seinen N-Terminus bindet. Anillin erforderlich ist, um die Position des kontraktilen Ring in Säugetier-oder Drosophila S2 Zellen 16 zu stabilisieren. Anillin Erschöpfung verursacht Kontraktionsringe, um seitliche Schwingungen zu unterziehen, und Zytokinese schließlich ausfällt Bildung kernigen Zellen 17-19. Interessant, wenn auch C. elegans ani-1-Koordinaten Aktomyosin Kontraktilität im Embryo, ist es nicht wesentlich für die Cytokinese. Jedoch, wie oben beschrieben, ani-1 ist für Neuroblast Zytokinese in der Zwischenembryogenese (Fotopoulos, Wernicke und Piekny, unveröffentlichte Beobachtungen) erforderlich. Cytokinesis Scheitern würde die Anzahl und Position der Neuroblasten verändern und könnte die Lok beeinflussenation von chemischen Führungssignale, oder es könnte die mechanischen Eigenschaften des Gewebes verändern. Beide Modelle unterstreichen die Rolle der nichtautonomen für Neuroblasten ventralen Gehäuse, und die Bedeutung der Gewebe-Gewebe-Kommunikation während der embryonalen Entwicklung.
Das Versuchsprotokoll beschreibt, wie Bild Zellteilung während C. elegans Mitte Embryogenese unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Die Mehrzahl der Experimente, die die Mechanismen der Zellteilung in Einzelzellen in Kulturschalen (zB. HeLa-Zellen oder S2) oder in frühen Embryonen mit einer begrenzten Anzahl von Zellen (z. B. C. elegans ein Embryo, Xenopus oder stachelhäuter durch Embryonen). Jedoch ist es wichtig, auch die Zellteilung im Gewebe zu untersuchen, wie es externe Signale, die den Zeitpunkt und die Platzierung der Teilungsebene beeinflussen können. Weiterhin können Zellen, chemische oder mechanische Signale bereitzustellen, um die Entwicklung der benachbarten Gewebe beeinflussens, und es ist wichtig zu verstehen, wie die interzelluläre Kommunikation hilft Geweben während der Entwicklung zu bilden.
1. Herstellung von Platten für die Pflege Worm Stämme und Darstellende RNAi
2. Der Anbau Worm Stämme
Pflegen C. elegans Stämme aus der CGC nach Standard-Protokoll 1 bestellt am NGM-Platten. Stämme für dieses Protokoll verwendet werden, umfassen: C. elegans var. Bristol, Wildtyp (Stamm-ID bei CGC N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [Schinken-1 TY1 :: :: :: EGFP 3xFLAG + unc-119 (+)] (Stamm-ID bei CGC OP102); unc-119 (ed3); ltIs44pAA173 [pie-1P-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (Stamm-ID bei CGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (Stamm-ID bei CGC SU159); unc-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: hmr-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (Stamm-ID bei CGC FT250).
3. RNAi
4. Herstellung von Folien für Live-Imaging und Ernten Embryonen
5. Live-Imaging
6. Analyse von Mikroskopie Daten
Das Versuchsprotokoll beschreibt, wie Bild der Zellteilung in C. elegans Embryonen während der Embryogenese Mitte. Insbesondere beschreibt sie, wie man Bild Neuroblasten, die epidermalen Morphogenese erleichtern können. Epidermalen Morphogenese tritt aufgrund einer Kombination von epidermalen Zellformänderungen, Migration und Adhäsion, sondern stützt sich auf chemische oder mechanische Signale aus den zugrundeliegenden Neuroblasten (Abbildung 1B). Die Neuroblasten sezerFührungsSignale, die durch Rezeptoren auf der Oberfläche der ventralen epidermalen Zellen, die ihre Migration 10,14,25 regelt empfangen werden. Darüber hinaus sind die Neuroblasten hochproliferative, die mechanischen Kräfte, die auf die Migration von ventral Epidermiszellen 26 beitragen bereitstellen kann. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Neuroblast Zellteilung während der Embryogenese Mitte zu studieren. Zunächst Embryonen Koexpression Marker Neuroblasten visualisieren (HAM-1: GFP) unterziehen Zytokinese (mCherry: PH) erzeugt werden. HAM-1: GFP exprimiert GFP (green fluorescent protein) markierten Protein, das an Kernen 27 Neuroblasten lokalisiert, und ist notwendig, um zu verwenden, da es viele andere Zelle in der Zwischenembryogenese vorhanden Typen (> 300 Zellen, Fig. 3). Dies dient auch als ein guter Marker für die sich teilenden Zellen, da die DNA in Chromosomen während der Mitose kondensiert. mCherry: PH ist ein mCherry-markierte fluoreszierende Protein, das von einer mütterlichen Promotor (pie-1) ausgedrückt ist, und enthält die Lipidbindungsdomäne von PLC1 ∂ 1 28, die an Zellmembranen lokalisiert. Dieses Protein ist erforderlich, um Zytokinese visualisieren, wenn die Membran und Cytosol klemmen in die Mutterzelle in zwei Tochterzellen zu trennen, Fig. 3; Video 1). Obwohl dieses Protokoll beschreibt, wie die Bildneuroblast Division (von HAM-1 dargestellt: GFP-Expression), könnten andere Marker verwendet werden, andere Zelltypen zu visualisieren.
Zur Visualisierung Division Neuroblasten, Embryonen coexpRessing HAM-1: GFP und mCherry: PH werden alle 2 min (insgesamt 10 min) abgebildet. Jeder Neuroblast ist nur ~ 1-4 um im Durchmesser und ist <1 um dick, und es ist am besten, um ein Objektiv mit hoher Vergrößerung (z. B.. 100X) zu verwenden. Außerdem zahlreichen Z-Stapel (~ 20) mit einer kleinen Schrittweite (0,2 &mgr; m) gesammelt werden, um sicherzustellen, dass die verschiedenen Seiten jeder Zelle (kugelförmig) abgebildet werden. Um diese vielen Bilder, ohne Zeit Punkte zu sammeln, ist ein hoch motorisierte Stufe (zB Piezo Z-Stage) empfohlen. Nach dem Sammeln einer Reihe von Bildern, werden sie analysiert, um die Zellen innerhalb von wenigen Z-Stapel, die sich teilen, wird die DNA kondensiert, wird die Membran eingedrungen und die neuen Tochterzellen bilden (Zeitpunkte des projizierten Stapel zusammen Kanäle zu finden sind, in Fig. 3A gezeigt, und ausgewählte Stapel zusammen Kanäle sind in Fig. 3B gezeigt, Video 1). Um die Zellen besser sichtbar zu machen, ist es empfehlenswert,halten jeden Kanal in Graustufen und invertieren die Bilder (zB Bild 4).
Die Bildauflösung ist für die Weitfeld-System mit einem hochauflösenden CCD-Kamera (1344 x 1024 Pixel) vs. das Wischfeld System mit einer Hochgeschwindigkeitskamera EMCCD mit hoher Empfindlichkeit (~ 35 Bilder / s und 512 x 512 Pixel). Inverted Bilder der Aufteilung von Steuerneuroblasten Embryonen mit beiden Systemen getroffen werden für den Vergleich (Abbildung 4 vs. 5) vorgestellt. Wie in 4A (Weitfeld-System, Video 2) gezeigt, sind die Bilder klarer vs 5A. (Wischfeld-System, Video 4). Wenn jedoch mit der Weitfeldsystem sind Embryonen anfällig für Phototoxizität und schneller Punkte sind mit der hochauflösenden Kamera nicht möglich. Um beispielsweise Änderungen in der Lokalisierung der verschiedenen Proteine (zB. T untersucheno studieren Veränderungen in ihrer Dynamik), könnte Zeit Punkte müssen öfter gesammelt werden. Auch kann es nicht möglich sein, für längere Zeiträume ohne die Anzahl von Z-Stapel und Zeitpunkten. Mit einem EMCCD Kamera auf der Weitfeldsystem kann eine breitere Palette von Imaging-Anwendungen zu ermöglichen. Kameras, die sowohl eine hohe Auflösung und hohe Geschwindigkeit haben, entwickelt worden sind, aber die Fahrer nicht in Abhängigkeit von der Erfassungssoftware verwendet wird verfügbar sein, und sie können noch nicht so empfindlich wie EMCCD Kameras. Ein weiteres System, das häufig für die Bildgebung C verwendet elegans ist die sich drehende Scheibe konfokalen, die auch niedrigere Phototoxizität und kann entweder mit EMCCD oder CCD-Kameras ausgestattet werden (siehe Diskussion).
, Gene, die für die Zellteilung erforderlich sind, zu studieren, Hermaphroditen mit RNAi gegen ein Gen von Interesse (zB ani-1, siehe Abschnitte 1.2 und 3 des Protokolls) behandelt und die Embryos werden in der gleichen Weise wie abgebildet Kontrl Embryonen. Um Zellen von RNAi Embryonen zu vergleichen, um Embryonen zu kontrollieren, ist es am besten, Bild in ähnlichen Stadien der Embryonalentwicklung (zum Spiel Zelle Formen und Positionen zu helfen). Zum Beispiel gibt es eine größere Zelle in der Mitte des Embryos sichtbar während der ventralen Gehäuse, das wie ein guter Bezugspunkt für die Bildgebung Neuroblasten (Abbildungen 4 und 5) wirken können. Das Gen, hier studierte, ani-1 (Anillin) organisiert Actomyosin Kontraktilität, ist aber im frühen Embryo 23,29-30 nicht Zytokinese erforderlich. Anillin die Homologen sind jedoch für die Zytokinese in höheren Eukaryonten 16 erforderlich und ani-1 für Neuroblast Zytokinese (Fotopoulos, Wernicke und Piekny, unveröffentlichte Beobachtungen) erforderlich. Wie in den 4B gezeigt (Video 3) und 5B (Video 5), mehrere Neuroblasten initiieren Zytokinese und ihre Membranen in kneifen, aber statt Bildung von zwei separaten TochterZellen, ihre Membranen zurückbilden und die Zellen vielkernigen (> 1 Kern / Zelle). Es ist zu beachten, dass ani-1 kann die Teilung oder Formänderung von anderen Zelltypen, die nicht von diesem Protokoll ergeben, werden erforderlich sein werden. Darüber hinaus hat das Protokoll nicht Ergebnisse von Gewebe-spezifische RNAi (siehe Diskussion) zu zeigen.
Fig. 1 ist. Ventrale Gehäuse während C. elegans epidermalen Morphogenese. A) Z-Stapel-Projektionen (3 Z-Stapel von 0,5 um Dicke) eines Steuer AJM-1: GFP (adhaerens Marker epidermalen Zellgrenzen visualisieren; Stamm ID bei CGC SU159) Embryo unterziehen Rücken Einlagerung (links, Rückenansicht ) und einem Steuer AJM-1: GFP Embryo unterziehen ventralen Gehäuse (rechts, Bauchansicht). Die Bilder werden zu einer besseren über invertiertualize Zellgrenzen. B) Cartoons zeigen ventralen Ansichten von C. elegans Embryonen unterziehen ventralen Gehäuse. Zuerst werden zwei Paare von Spitzenzellen (blau) verwenden Aktin reiche Filopodien (schwarze Linien), in Richtung der ventralen Mittellinie (Embryo auf der linken Seite) zu migrieren. Als nächstes werden die hinteren Bauchtasche Zellen (rot) wandern in Richtung der Mittellinie ein Loch auf der ventralen Oberfläche, die durch eine Tabaksbeutel ähnlichen Mechanismus schließen kann (B ', schwarz gestrichelten Linie / Kreis, erinnert an Wundheilung) 25. Ebenfalls dargestellt sind die zugrunde liegenden Neuroblasten (als graue Kreise). Die zweite Embryo (B ") zeigt, wie die Migration bestimmter Untergruppen von epidermalen Zellen durch eine" Brücke "aus der Umlagerung von PLX-2/plexin und VAB-1/Ephrin Rezeptor-exprimierenden 'plexin Band-Zellen (grün ausgebildet vermittelte Kreise). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
ANI-1 Lokalisation in C 2. elegans Embryonen. A) Eine feste C. elegans Embryo HMR-1-exprimierenden: GFP (E-Cadherin, Marker der epidermalen Zellgrenzen) für GFP (grün) und ANI-1 (rot) costained. Die konfokale Bilder der äußeren Zellschichten (4 Z-Stapel von 0,2 um Dicke) zeigen die darüber liegenden Hautzellen und die zugrunde liegenden Neuroblasten, die ANI-1-positiven B) Fest N2 und N2;. Ani-1 RNAi Embryonen werden für Co gefärbt ANI-1. ANI-1 ist stark in der ani-1-verarmten Embryo reduziert. Maßstabsbalken:. Um 10 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3. Visualisierung Division Neuroblast während C. elegans Embryogenese. Und mCherry GFP (grün bis Neuroblastenzellkerne sichtbar zu machen): (A) Z-Stapelvorsprünge (20 Z-Stapeln von 0,2 um Dicke) aus einem Kontrollembryo Koexpression HAM-1 gezeigten pH-Wert (um Zellmembranen zu visualisieren; rot) . Viele Neuroblasten und anderen Zelltypen sind in den Projektionen sichtbar (B) Z-Stapel-Projektionen mit einer kleineren Anzahl von Z-Ebenen werden von einer anderen Steuer Embryo Koexpression gezeigt HAM-1:. GFP (grün) und mCherry: PH (rot). Ein Bereich ist in (white box) herausgezoomt, um deutlicher zu zeigen, eine individuelle Trennneuroblast. Weiß Pfeilspitzen weisen auf die eindringenden Plasmamembran einer sich teilenden Zelle und grünen Kreise markieren die kondensierte DNA während der Mitose und neuBilden Tochterkerne gegen Ende der Mitose. Die große Zelle dient als Bezugspunkt (weiße Sternchen), um Entwicklungsstufe und Lage innerhalb des Embryos zu bestimmen. Maßstabsbalken:. 10 um (weiß) und 3,5 um (gelb) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4. Visualisierung Neuroblast Zytokinese während C. elegans Embryogenese mit einem Weitfeld-System. A) Inverted Z-Stapel-Vorsprünge (2 Z-Stapel von 0,2 um Dicke) aus einem Kontrollembryo Koexpression gezeigt HAM-1: GFP und mCherry: PH von der Weitfeldsystem mit einer CCD-Kamera mit hoher Auflösung gesammelt. Red Pfeilspitzen weisen auf Teilung Neuroblasten mit ingressing Zellmembranen. Grüne Kreise markieren kondensierte DNA während der frühen Phasen der Mitose oder sich neu bildenden Tochterkerne gegen Ende der Mitose / Cytokinese. Die große Zelle dient als Bezugspunkt (gelbe Sternchen), um Entwicklungsstufe zu bestimmen. B) gezeigten Bilder sind ähnlich A), sind aber aus einem Embryo mit ani-1 RNAi behandelt. Die Zellmembran Zutritte in die Zelle verläuft über Mitose, aber entspannt kurz nach, so dass eine vielkernige Zelle. Maßstab:. 10 um (schwarz), 3,5 um (gelb) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 5. Visualisierung Neuroblast Zytokinese während C. elegans Embryogenese mit einem Wischfeld-System. A) invertiert Z-Stapel Vorsprünge 2 Z-Stapeln von 0,2 um (insgesamt 0,4 &mgr; m) von einem Embryo Koexpression HAM-1 gezeigt: GFP und mCherry: PH aus dem Wischfeld System unter Verwendung eines EM-CCD-Kamera mit hoher Empfindlichkeit gesammelt, aber niedrigere Auflösung. Die roten Pfeilspitze zeigt auf eine Neuroblast unterzieht Zytokinese. Grüne Kreise markieren kondensierte DNA während der Mitose und der neu entstehenden Tochterkerne nach der Zellteilung. Die große Zelle dient als Bezugspunkt (gelbe Sternchen), um Entwicklungsstufe zu bestimmen. B) gezeigten Bilder sind ähnlich A), sind aber aus einem Embryo mit ani-1 RNAi behandelt und 3 Z-Stapel verwendet werden (insgesamt 0,6 um ). Wie oben beschrieben, entspannt die Membran ingresses wie in den Zell Mitose durchläuft, sondern dann verursacht die Zelle kernig sein. Maßstab: 10 um (schwarz), 3,5 um (gelb).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Video 1. Visualisierung Division Neuroblasten während C. elegans Embryogenese. Z-Stapel Vorsprünge von zwei Z-Ebenen (0,4 um / Ebene) aus einem Kontrollembryo Koexpression HAM-1: GFP (grün) und mCherry: pH-Wert (rot). Bilder aus der Weitfeldmikroskop gesammelt werden für beide Kanäle angezeigt. Das Video entspricht der in der dritten Platte von 3B gezeigt Embryo. Klicken Sie hier, um Video zu sehen.
Video 2. Visualisierung Division Neuroblasten während C. elegans Embryogenese. Z-Stapel Vorsprünge von zwei Z-Ebenen (0,4 um / Ebene) aus einem Kontrollembryo Koexpression HAM-1: GFP (grün) und mCherry: pH-Wert (rot). Das Video entspricht umgedrehte Bilder aus der Weitfeld-Mikroskop für die mCherry gesammelt: PH Kanal only (Embryo in Abbildung 4A). Klicken Sie hier, um Video zu sehen.
Video 3. Visualisierung Division Neuroblasten während C. elegans Embryogenese. Z-Stapel-Projektionen von zwei Z-Ebenen (0,4 um / Flugzeug) von einem ani-1 RNAi behandelten Embryo Koexpression HAM-1: GFP (grün) und mCherry: PH (rot). Das Video entspricht umgedrehte Bilder aus der Weitfeld-Mikroskop für die mCherry gesammelt:. PH-Kanal nur (Embryo in 4B) Klicken Sie hier, um Video zu sehen.
Video 4. Visualisierung Division Neuroblast während C. elegans Embryogenese. Z-Stapel Vorsprünge von zwei Z-Ebenen (0,4 um / Ebene) aus einem Kontrollembryo Koexpression HAM-1: GFP (grün) und mCherry: pH-Wert (rot). Das Video entspricht invertierened Bilder aus dem Wischfeld Konfokalmikroskop für die mCherry gesammelt:. PH-Kanal nur (Embryo in 5A) Klicken Sie hier, um Video zu sehen.
Video 5. Visualisierung Division Neuroblast während C. elegans Embryogenese. Z-Stapel-Projektionen von drei Z-Ebenen (0,4 um / Flugzeug) von einem ani-1 RNAi behandelten Embryo Koexpression HAM-1: GFP (grün) und mCherry: PH (rot). Das Video entspricht umgedrehte Bilder vom Feld gefegt Konfokalmikroskop für die mCherry gesammelt:. PH-Kanal nur (Embryo in 5B) Klicken Sie hier, um Video zu sehen.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von verschiedenen Arten von Bildmikroskopie Zellteilungen in der Zwischenembryogenese. Insbesondere stellt dieses Protokoll, wie Bild die Aufteilung der Neuroblasten, epidermalen Zellen, die Morphogenese erleichtern können. Zell-Zell-Kommunikation wichtig für die Gewebebildung während metazoan Entwicklung und C. elegans ist ein ausgezeichnetes Modell zur Gewebebildung in vivo zu studieren. Ein Ereignis, das schön schildert das Zusammenspiel von epidermalen Geweben Morphogenese, die den Embryo in einer Schicht von Epithelzellen umfaßt. Insbesondere ist ventralen Gehäuse der Prozess, wo die ventralen epidermalen Zellen wandern, um die Bauchseite des Embryos umschließen, und stützt sich auf die zugrunde liegenden Neuroblasten. Die Neuroblasten bereitzustellen chemische oder mechanische Signale und ventralen Gehäuse ist beeinträchtigt, wenn die Position der Neuroblasten verändert wird. Die Zahl (oder Polarität) des Neuroblasten kann auch wichtig sein für Bauch Gehäuse richtig auftreten,und es ist wichtig, die Mechanismen zu verstehen, deren Teilung zu regulieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild der Zellteilung in einem lebenden Gewebe mit C. elegans Embryonen Koexpression zwei Fluoreszenzsonden (mCherry: PH an Plasmamembranen und HAM-1 skizzieren: GFP zu beschriften Neuroblast Kerne).
Die wesentlichen Schritte, um Aufnahmen von lebenden C. elegans Embryonen exprimieren Fluoreszenzsonden sind: i) verwenden gesunden, jungen Erwachsenen Hermaphroditen Ausdruck der gewünschten Fluoreszenzmarker (bei 20-25 ° C gehalten), ii) verwenden, Mutanten oder RNAi Gen-Anforderungen bei der Gewebebildung zu untersuchen, iii) sammeln Embryonen bei der rechts der Bühne für die Mikroskopie (zB. Mitte der Embryogenese) und iv) durchführen Fluoreszenzmikroskopie mit den Einstellungen optimiert, Phototoxizität niedrig zu halten, aber eine hohe Bildqualität zu erhalten.
Um bestimmte Zellen und / oder intrazelluläre Kompartimente in einem Gewebe von Interesse zu identifizieren, nutzen Würmer exprimieren Marker mit fluoreszierenden pro getaggtbes. Die Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) bietet eine Vielzahl von Stämmen, die mehrere Marker coexprimieren. Allerdings können zwei Stämme (jeweils eine einzelne Markierung von Interesse exprimieren) durchquert und mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden über mehrere Generationen, um eine Belastung stabil exprimieren beide Sonden zu erzeugen. Zum Beispiel für die Durchführung dieser Versuchsprotokoll, eine Belastung eine Markierung, um Zellmembranen (mCherry: PH, OP70) visualisieren exprimiert, wurde mit einem Stamm gekreuzt eine Markierung, um Neuroblast Kerne sichtbar zum Ausdruck (HAM-1: GFP; OP102) zur Erzeugung einer Stamm Koexpression beides.
Der beste Weg, um Gen-Anforderungen während der embryonalen Entwicklung zu studieren, ist zu Funktionsverlust Experimente, wo die Gen-Produkt wird zu Boden geworfen oder mutierte durchzuführen. Dieses Versuchsprotokoll beschreibt die Durchführung RNAi gegen Anillin (ani-1), um die endogene ANI-1-Mengen in allen embryonalen Geweben zu verringern. Es gibt keine gut gekennzeichnet hypomorphen Allelevon ani-1. Daher ist RNAi die beste Option zu ani-1 's Verlust der Funktion Phänotypen zu untersuchen und festzustellen, seine Funktion während der embryonalen Entwicklung. Normalerweise ist es besser, statt der RNAi-Mutanten zu verwenden, da die Effizienz der Zuschlags kann variabel sein und ist selten null. Eines der häufigsten Probleme bei der Fütterung RNAi Protokolle gestoßen ist die Kontamination, die RNAi-Effizienz reduzieren. Um das Risiko der Kontamination zu verringern, bereiten die RNAi-Platten und Essen in aseptischen Bedingungen. Verunreinigungen können durch Screening einige der Platten vor der Verwendung festgestellt werden, und die Platten mit milchig / undurchsichtig Suche Bakterien verworfen werden. Ein weiteres Problem, das RNAi-Effizienz reduzieren kann, ist nicht durch die Wahl Hermaphroditen an der richtigen Entwicklungsstadium. Es ist am besten, L4-Stufen-oder jungen erwachsenen Würmer (die Entwicklung der Vulva erscheint als weißlicher Kreis / Loch auf der Bauchseite der Schnecke), die keine / wenige befruchtete Embryonen zu verwenden. Darüber hinaus sind die RNAi-Bedingungen und Behandlungen may variieren für verschiedene Gen-Produkte. Verschiedene Möglichkeiten zum Erhöhen oder Verringern der Stärke des RNAi durch Resuspendieren der pelle HT115 Bakterien in verschiedenen Mengen LB-Amp-Medium (siehe Abschnitt 1.2.2) und durch Änderung der Dauer der RNAi-Behandlung (Zeitdauer, die Würmer zu halten RNAi-Platten, siehe Protokoll Nr. 3). Um eine optimale ani-1 RNAi-Phänotypen für dieses Protokoll zu ergeben, wurden Bakterien in 500 ul LB-Amp-Medium resuspendiert und Würmer wurden auf RNAi-Platten für 2 Tage gehalten (ani-1 RNAi wurde zuvor von Maddox et al. 23 gekennzeichnet). RNAi resistent oder empfindliche Stämme (z. B.. Rde-1, 1-sid oder RRF-3) kann auch verwendet werden, um die Festigkeit von RNAi zu verändern. Noch wichtiger ist, kann diese Stämme mit dem Gewebe-spezifische Expression der Wildtyp-Gene, um Gewebe-empfindliche Stämme erstellen gekoppelt werden. Zum Beispiel, um Neuroblast spezifische RNAi durchführen, einer sid-1-Mutante Embryonen (RNAi fest) verwenden Gew. ausdrücken Sid-1 unter dem unc-119-Promotor (Stamm-ID bei CGC TU3401) 31.
Dieses Protokoll beschreibt, wie Neuroblast Bild der Zellteilung während der Embryogenese Mitte. Es gibt mehrere Aspekte des Protokolls, die sorgfältig zu prüfen sind, wie etwa die Entwicklungsstadium des Embryos, das Sammeln der entsprechenden Z-Stacks und die Optimierung der Abbildungsbedingungen zu Phototoxizität, ohne die Bildqualität zu minimieren. Zu Zeitpunkten an der richtigen Entwicklungsstufe (zB Bauch Gehäuse) zu erfassen, sollte Embryonen aus dorsalen Einlagerung gefilmt werden (Paare von Rücken epidermalen Zellen ineinander greifen und verschmelzen zu einer einzigen Schicht von Epidermis auf der dorsalen Seite des Embryos bilden; Abbildung 1A6). Zu diesem Zeitpunkt werden die Neuroblasten schnell teil. Da die Inszenierung der Embryonen kann schwierig sein, unter geringer Vergrößerung (z. B. mit einem Binokular), hilft es, viele Embryonen der unterschiedlichen Stadien und Embryonen in die sammelnrechts der Bühne kann mit höherer Vergrößerung gewählt werden.
Neuroblasten sind relativ klein und dünn, und sind in der gesamten Mitte des Embryos gefunden. Es ist wichtig, die Anzahl und Größe der Z-Stapel zu optimieren, um sicherzustellen, daß die gesamte Zelle während der Teilung erfasst. Zum Beispiel, das Sammeln zu viele Bilder werden Embryonen, um mehr Licht aussetzen und machen sie anfällig für Phototoxizität. Allerdings sammeln zu wenige Z-Stapel oder Dick Z Abschnitte könnte es schwierig, richtig zu Bild eine ganze Trennneuroblast Zelle zu machen.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Wischfeld konfokalen Mikroskop oder Weitfeld-System, um Bild Neuroblast Zellteilung. Wie bereits beschrieben, ist eine der wichtigsten Einschränkungen der Verwendung eines Weitfeld-Epifluoreszenz-Mikroskop das Potenzial für Phototoxizität. Zwar ist es sehr zu empfehlen, um eine sich drehende Scheibe konfokalen oder Wischfeld konfokale Bildgebung für C verwenden elegans Embryonen können einige Labors haben nur begrenzten Zugang zu diesen Systemen. Diese protocol gibt einige Vorschläge, um Phototoxizität zu begrenzen, wenn mit Weitfeld-Systeme, wie das Schließen der Blende auf 30%, eine Senkung der Intensität des von der Quecksilberlampe (oder vorzugsweise unter Verwendung von LEDs), mit einem EM-CCD-Kamera, und die Erhöhung der Gewinn oder Binning zu ermöglichen, eine Verringerung der Belichtungszeit. Die Zahl der Z-Stapel und Zeitpunkte werden ebenfalls mit einem Weitfeld-System beschränkt. Obwohl es nicht in diesem Protokoll beschrieben, wird die sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop häufig für die Bildgebung verwendet, da es geringere Phototoxizität verursacht im Vergleich zu einer Weitfeldmikroskop. Ähnlich wie bei der Wischfeld System, verwendet es Festkörperlaser und streut Licht (wenn auch in anderer Weise gegen die Wischfeld). Entweder CCD-oder EM-CCD-Kameras können mit Spinning-Disk-System, die oft über mehrere Kamera-Ports erlauben Dual Imaging verwendet werden. Ähnlich wie bei der Wischfeld-Mikroskop können Bilder mit Belichtungszeiten von 50 bis 90% niedriger im Vergleich zu den Weitfeld-System erfasst werden.
Diese PROTOKol kann die Funktion verschiedener Gene, die bei der Gewebebildung Mitose regulieren, zu untersuchen. Die Zeit zwischen jedem Bild kann verkürzt werden (zB. Alle 15-30 sec vs. 2-3 min) bis mitotischen Phänotyp besser zu visualisieren. Verschiedene Sonden verwendet werden (z. B. anstatt HAM-1: GFP-markierten fluoreszierenden H2B könnte verwendet werden, um DNA sichtbar zu machen, und / oder fluoreszierend gekennzeichneten Tubulin verwendet werden, um mitotische Spindeln visualisieren.). Die Zahl der Z-Stapel und der Dicke für jeden Stapel könnte auch geändert werden (z. B. mehrere Stapel einer kleineren Schrittweite). Wie oben beschrieben, die Wahl der richtigen Einstellungen ist von entscheidender Bedeutung für die Begrenzung Phototoxizität und die Optimierung der Bildqualität. Obwohl die mCherry: PH und HAM-1: GFP exprimieren Sonden auf relativ hohem Niveau, Sammeln schneller Zeitpunkten die Anzahl von Z-Stapeln oder Bildgebung für längere Zeiträume gegen was in diesem Protokoll beschriebenen Umständen nicht möglich, auf einer Weitfeld-System.
Ein Java-basiertes imAlter Verarbeitungsprogramm (ImageJ, NIH) können verwendet werden, um Bilder von den verschiedenen Mikroskopen und Bilder gesammelt, verarbeitet werden können als TIFF-Dateien exportiert werden. Jedoch, abhängig von der für die Erfassung verwendeten Software, die Dateien könnte bereits mit der Verarbeitungssoftware kompatibel. Es ist besser, die Originaldateien vs exportierten Bildern (zB TIFF-Dateien) zu öffnen, da die Metadaten mit den Originaldateien gehalten. Verarbeitungssoftware verwendet werden, um Bilder für die Herstellung von Figuren oder Filme zu manipulieren. Darüber hinaus können auch quantitative Analysen durchgeführt werden, wie Messpixelintensitäten in ausgewählten Regionen. Optimale Software sollte in Abhängigkeit von der Analyse ausgewählt werden, wie zB Image Processing Toolbox (MathWorks, Matlab) oder 3D-und 4D-Echtzeit-Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane).
Unter Verwendung dieses Protokolls wurde ani-1 gezeigt, für Neuroblasten Cytokinese benötigt werden, obwohl sie nicht für die Cytokinese in frühen Embryos erforderlich. Interessant ist, durch Steuern der number und Position der Neuroblasten kann ani-1 die Migration von epidermalen Zellen für ventrale Bauch Gehäuse zu regeln, weil die Neuroblasten bieten chemische oder mechanische Hinweise, um die darüberliegenden Epithelzellen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob ani-1 ist für die Division oder Formänderung von anderen Zelltypen während der mittleren späten Embryogenese erforderlich. Zeigen, wie die Gesamtzusammensetzung eines Gewebes wirkt benachbarten Gewebe betont die Bedeutung der Kommunikation im Gewebe metazoan Entwicklung.
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Die Autoren möchten, um zu bestätigen, dass diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Zuschuss unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
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