Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante

Este protocolo descreve como as células em divisão imagem dentro de um tecido em Caenorhabditis elegans embriões. Embora vários protocolos descrevem como a divisão celular imagem no embrião precoce, este protocolo descreve como imagem divisão celular dentro de um tecido em desenvolvimento em meados embriogénese tardia.

Este protocolo descreve a utilização de microscopia de fluorescência para a imagem a divisão das células dentro desenvolvendo Caenorhabditis elegans embriões. Em particular, este protocolo se concentra em como a imagem dividindo neuroblastos, que são encontrados debaixo das células da epiderme e podem ser importantes para epidérmica morfogênese. Formação de tecido é crucial para o desenvolvimento metazoan e depende de estímulos externos a partir de tecidos vizinhos. C. elegans é um excelente organismo modelo para estudar a morfogênese do tecido in vivo devido à sua transparência e organização simples, fazendo com que seus tecidos fáceis de estudar via microscopia. Invólucro ventral é o processo em que a superfície ventral do embrião é coberto por uma única camada de células epiteliais. Este evento é pensado para ser facilitado pelas neuroblastos subjacentes, que fornecem sinais de orientação química de mediar a migração das células epiteliais sobre jacentes. No entanto, os neuroblastos são altamente proliferativo e também podem agircomo um substrato mecânico para as células da epiderme ventral. Estudos utilizando este protocolo experimental pode descobrir a importância da comunicação intercelular durante a formação do tecido, e pode ser utilizada para revelar o papel dos genes envolvidos na divisão celular em tecidos em desenvolvimento.

Embora existam protocolos que descrevem como a divisão celular imagem no início do C. elegans embrião, este protocolo descreve como a divisão celular imagem dentro de um tecido em meados embriogênese. Um dos maiores desafios em imagem organismos durante o desenvolvimento tem sido a sua sensibilidade a fototoxicidade. No entanto, o aumento da acessibilidade a fiação microscópios confocal disco ou microscópios de campo varreram permitiu aplicações de imagem mais difundida. Ambos os sistemas utilizam lasers de estado sólido e de luz difusa, o que limita os níveis de UV que os organismos são expostos. No entanto, estandes Widefield ainda pode ser usado para geração de imagens in vivo, particularmente se eles são equipados com câmeras com alta sensibilidade (por exemplo EMCCD), controle de abertura e controle de luz (por exemplo, LEDs ou lâmpadas de mercúrio ajustável). Este protocolo descreve como usar um sistema confocal base ou um sistema de campo amplo para a divisão celular imagem dentro desenvolvimento C. elegans </ Em> embriões. Como um exemplo, nós descrevemos como a imagem da divisão celular neuroblasto. Os neuroblastos podem facilitar epidérmico morfogénese fornecendo estímulos químicos ou mecânicos para as células epidérmicas sobrepostas, e fornecer um excelente exemplo da importância da comunicação intercelular para a formação dos tecidos.

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo ideal para estudos baseados microscopia devido à sua transparência e organização do tecido simples ^1. Além disso, C. elegans é passível de métodos genéticos e RNAi, e uma vez que muitos dos seus genes têm homólogos humanos, ele pode ser usado para identificar os mecanismos conservadas para a formação de tecido ^{de 2-5.} Em C. elegans formação da epiderme ocorre durante o meio embriogênese, quando o embrião tem> 300 células. Epidermal morfogénese consiste em várias fases principais durante os quais o embrião é colocado entre uma camada de células epidérmicas que se contraem e se estendem ao transformar o embryo de uma forma ovóide na forma alongada de um verme ^6. Invólucro ventral descreve um desses eventos morfogenéticas, quando as células da epiderme ventral migrar em direcção à linha média ventral, para cobrir a superfície ventral do embrião (figura 1). Em primeiro lugar, dois pares de células anteriores localizado Leading Edge migrar para a linha média ventral, onde se aderem e se fundem com seus vizinhos contralateral ^6. Esta é seguida pela migração de células de bolso posterior localizado, que formam cunha como formas criando uma bolsa ventral ^6-7. O mecanismo que fecha a bolsa não é bem compreendida. Uma possibilidade é que uma estrutura contrátil actina miosina supracellular liga as células de bolso juntos em um cordão da bolsa como a moda, semelhante a cicatrização de feridas ^8. Curiosamente, a migração de algumas das células de bolso é mediada por subconjuntos específicos de neuroblastos subjacentes ⁹ (precursores neuronais que são encontrados sob a epidermis, Figura 1B).

Estudos anteriores mostraram que os neuroblastos regular a migração das células da epiderme ventral e invólucro ventral. VAB-1 (receptor de Efrina) e VAB-2 (ligando de Efrina) são altamente expressas em neuroblastos e facilitar a separação do anterior e posterior neuroblastos um do outro, e mutações em vab-1 ou vab-2 causa recinto ventral fenótipos ^10-13. No entanto, as experiências mostraram que o promotor de salvamento também é necessário vab-1 nas células da epiderme ventral sobrepostas e receptores para outras pistas de orientação secretadas pelas neuroblastos são expressos nas células da epiderme ventral ^9. Embora as mutações em qualquer um desses receptores causar fenótipos gabinete ventral, não está claro se os defeitos surgem devido a problemas no posicionamento neuroblasto ou devido à falha das células epidérmicas ventrais para responder a orientação cues ^14. Alterando a divisão de neuroblastos without afetando sua capacidade de secretar pistas de orientação poderia lançar luz sobre o papel de neuroblastos e sua capacidade de fornecer entrada mecânica durante epidérmica morfogênese. Recentemente, verificou-se que um gene de divisão celular, ani-1 (anillin) é altamente expressa em neuroblastos (Figura 2A) e a sua exaustão faz com defeitos divisão neuroblastos. Curiosamente, estes embriões exibir fenótipos gabinete ventral (Fotopoulos, Wernike e Piękny, observações não publicadas).

Anillin é necessário para a divisão celular e, particularmente, para a citocinese, a qual descreve o processo pelo qual uma célula mãe divide fisicamente em duas células filhas. Cytokinesis é impulsionada pela formação de um anel contrátil actomiosina, que precisa ser rigidamente controlado no espaço e no tempo para garantir que ele está corretamente juntamente com a segregação de cromátides irmãs. O regulador mestre de citocinese metazoan é RhoA (RHO-1 em C. elegans), uma pequena GTPase que é umctive em sua forma ligada a GTP. O GEF Ect2/ECT-2 ativa RhoA, após o qual RhoA-GTP interage com efetores downstream que formam o anel contrátil e mediam seu ingresso ^15. Anillin é uma proteína do domínio de multi que se liga a RhoA, através do seu terminal C e a actina e miosina, através do seu terminal-N. Anillin é necessário para estabilizar a posição do anel contráctil, em células de mamíferos ou de Drosophila S2 ^16. Esgotamento Anillin provoca anéis contráteis a sofrer oscilações laterais e citocinese eventualmente falhar formando células multinucleadas ^17-19. Curiosamente, apesar de C. elegans ani-1 Coordenadas actomiosina contratilidade no embrião inicial, isso não é essencial para a citocinese. No entanto, como descrito acima, é necessária uma ani-1 para neuroblastos citocinese durante meados de embriogénese (Fotopoulos, Wernike e Piękny, observações não publicadas). Falha Cytokinesis alteraria o número ea posição dos neuroblastos e poderia afetar o locção de pistas de orientação química, ou que poderiam alterar as propriedades mecânicas do tecido. Ambos os modelos destacam o papel não-autônomos de neuroblastos para o gabinete de ventral, ea importância da comunicação tecido-tecido durante o desenvolvimento embrionário.

Este protocolo experimental descreve como a divisão celular durante a imagem C. elegans meados embriogênese usando microscopia de fluorescência. A maioria dos ensaios que estudam os mecanismos de divisão celular foram realizados em células individuais dentro de pratos de cultura (p. ex. HeLa ou células S2) ou em embriões precoces, com um número limitado de células (por exemplo, C. elegans embrião de uma célula, de Xenopus, ou Echinoderm embriões). No entanto, é importante também para estudar a divisão celular nos tecidos, uma vez que existem sinais externos que podem influenciar o tempo e de colocação do plano de divisão. Além disso, as células podem fornecer pistas químicas ou mecânicas para influenciar o desenvolvimento do tecido vizinhos, e é importante para entender como comunicação intercelular ajuda para formar tecidos durante o desenvolvimento.

1. Preparação das placas para manutenção de Cepas Worm e Execução de RNAi

1. Placas Nematode Crescimento Mídia
   1. Placas
      1. Prepare Nematode Crescimento Mídia (NGM) placas para manter cepas vermes e realizar cruzamentos genéticos. Misturar 3 g de NaCl, 17 g de ágar e 2,5 g bactopeptona com 1 L de água destilada em um balão de 2 L e adicionar uma barra de agitação metálica.
      2. Autoclave o frasco para dissolver o ágar e para esterilizar os meios de comunicação. Em seguida, colocar o balão em uma placa de agitação e permitir que os meios de comunicação para esfriar, mexendo.
      3. Depois de o suporte ter arrefecido e ainda é um pouco quente ao toque (45-50 ° C), juntar 1 mL de 1 M de _CaCl2, 1 ml de 1 M de _MgSO4, 1 ml de solução de 5 mg / ml de colesterol e 25 ml de 1 M tampão fosfato de potássio (PPB; receita na tabela de reagentes / materiais, filtro de esterilizar soluções estoque) e despeje imediatamente os meios de comunicação em pequenas placas de Petri (60 mm x 15 mm; encher os pratos ~ 3/4 para cima ou 13 ml / placa using um dispensador automático). Nota: Para a manutenção a longo prazo de algumas estirpes de tetraciclina podem ser adicionados às placas (12,5 ug / ml) para permitir a transposão Tn10, a inactivação do gene bacteriano ARNase III.
      4. Deixe os media solidificar durante a noite à temperatura ambiente. Nota: As placas devem ser mantidos em um capuz biológica ou numa área de laboratório que é menos propenso à contaminação. Além disso, remova qualquer condensação que se acumulou sobre as pálpebras (por exemplo, limpar com papel de seda) para limitar a contaminação fúngica. Se a tetraciclina é também adicionado às placas, em seguida, cobrindo-os com folha de alumínio como este antibiótico é sensível à luz.
      5. No dia seguinte, as placas NGM sementes secas com uma suspensão de E. coli (OP50 tensão, veja Secção 1.1.2), que foi gentilmente agitadas. Para fazer placas de acasalamento, adicionar ~ 50 ul de OP50 para o centro de cada uma das placas (de modo a formar um pequeno circulo). Para fazer placas para manter cepas vermes, sementes cada placa NGM com ~ 100-200 mL de OP50 (paragarantir que ele cobre uma área maior da placa).
      6. Que as placas semeadas O seco / N à temperatura ambiente.
      7. No dia seguinte, vire as placas NGM secas de cabeça para baixo e empilhá-los em recipientes de armazenamento de plástico a 4 ° C. Nota: As placas são utilizáveis ​​até ~ 3-4 semanas. As placas contendo tetraciclina deve ser mantida no escuro.
   2. Comida
      1. Use E. coli OP50 [a partir do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] como uma fonte de alimento para C. . elegans Nota: OP50 pode ser armazenado como stocks de glicerol a -80 ° C (proporção de 1:1 em 50% v / v de glicerol).
      2. Para fazer OP50 para as placas NGM, fazer uma placa sequência utilizando uma pequena alíquota do stock de glicerol (<10 mL; utilizar uma ponta de pipeta estéril). Espalhe as bactérias em uma placa de ágar LB (receita na tabela de reagentes / materiais) e deixá-lo a 37 ° C para ~ 16 horas. Nota: Se houver problemas com a contaminação, estreptomicina OP50 resistente pode ser usado, umand estreptomicina podem ser adicionados às placas de agar LB (50 ug / ml).
      3. No dia seguinte, escolha uma única colônia e inocular 100 ml de líquido media LB (receita na tabela de reagentes / materiais) num frasco de 500 ml.
      4. Deixe a cultura crescer O / N a 37 ° C com agitação.
      5. No dia seguinte, use a suspensão bacteriana para semear placas NGM. Nota: OP50 pode ser distribuído por alíquotas em tubos cónicos de 50 ml e armazenada a 4 ° C durante ~ 4-6 semanas.
2. RNAi
   A alimentação é uma das principais maneiras de realizar RNA interferência mediada (RNAi, para knockdown um produto do gene específico) em C. elegans. C. hermafroditas elegans pode ser alimentado E. coli estirpe HT115 transformada com um vector que expressa ARNcd alimentação por indução. Este ARNcd (ou seus fragmentos) são transmitidos para o desenvolvimento das gónadas, geralmente resultando em knockdown substancial do gene alvo específico.
   1. Placas de RNAi
      1. Prepare placas NGM como descrito acima (ver secção 1.1.1), mas também adicionar 1 ml de 1 M de IPTG (isopropiltio-beta-D-galactósido; para induzir a expressão de dsRNA) e 500 ul de 50 mg / ml de ampicilina (Amp; os vectores que expressam ARNcd são Amp resistente) para a mídia quente (45-50 ° C).
      2. Depois as placas foram secas, sementes los com ~ 50-100 ul de E. coli HT115 (ver Secção 1.2.2). Nota: as placas não semeado pode ser armazenado a 4 ° C durante ~ 4-5 semanas.
      3. Deixe as placas semeadas secar durante a noite à temperatura ambiente.
      4. No dia seguinte, vire as placas de RNAi secas de cabeça para baixo e armazená-los em um recipiente de armazenamento de plástico 15-20 ° C. Nota: placas semeadas manter eficiência RNAi para até ~ 2-3 semanas.
   2. RNAi Food
      1. Use E. coli HT115 (a partir do CGC; ver secção 1.1.2) transformada com o vector de alimentação L4440, L4440 ou contendo cDNA de um gene de interesse. Nota: Alimentação bibliotecas que têm como alvo a maioria das estruturas de leitura aberta no genomajá foram feitas e estão disponíveis (clones em L4440 transformado em HT115, por exemplo contendo um fragmento de Y49E10.19 para ani -1 ^20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / páginas / rnai.html). Nota: HT115 pode ser mantido como stocks de glicerol a -80 ° C (proporção de 1:1 em 50% v / v de glicerol).
      2. Para gerar uma nova construção como alvo um gene de interesse, veja o mapa vetor L4440 e clone de cDNA entre os promotores T7 de acompanhamento, que são induzida por IPTG.
      3. Transforme HT115 com a construção L4440 usando um protocolo padrão para a transformação (por exemplo, fazer bactérias quimicamente competentes e realizar a transformação de choque térmico).
      4. Tal como descrito para OP50 (ver secção 1.1.2), as bactérias raia da stock de glicerol em uma placa de agar LB, mas também a placa deve conter 50 ug / ml de ampicilina. Nota: Se estiver usando um pré construção L4440 existente, pule Seções 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Escolha uma única colônia e inocular 5 mlde mídia LB contendo 5 mL de ampicilina de um / ml 50 mg (LB Amp), e colocá-lo a 37 ° C com agitação.
      6. Após cerca de 16 horas, inocular 5 ml de meio LB fresco Amp com 50 mL da cultura O / N e crescer a cultura durante 7-8 horas com agitação a 37 ° C.
      7. Centrifugar as bactérias por 1 min a 4,000-8,000 xg, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 mL de mídia fresco LB Amp.
      8. Use esta solução bacteriana para semear as placas de RNAi como descrito acima (ver Secção 1.2.1). Nota: HT115 deve ser utilizado imediatamente e não deve ser armazenado.

2. Cultivando Cepas Worm

Manter C. cepas elegans pedidos do CGC em placas NGM acordo com o protocolo padrão ^1. As cepas utilizadas para este protocolo são: C. elegans var Bristol, do tipo selvagem (ID tensão no CGC N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [presunto-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + unc-119 (+)] (ID tensão no CGC OP102); unc-119 (ed3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (ID tensão no CGC OD70); ajm-1 (ok160); jcEx44 [ajm-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (ID tensão no CGC SU159); unc-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: hmr-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (ID tensão no CGC FT250).

1. Escolha a 3 hermafroditas jovens adultos que apresentam o fenótipo correto para uma placa NGM fresco. Nota: N2 (var. Bristol, de tipo selvagem) pode ser mantida entre 15-25 ° C, mas que vai atingir a densidade mais rápida a temperaturas mais elevadas. Novas ações devem ser feitas quando a densidade verme é alta.
2. Mantenha todas as amostras fluorescentes (por exemplo, GFP e / ou mCherry expressam vermes) a 20-25 ° C para a expressão óptima de proteínas fluorescentes. Novas ações devem ser feitas quando a densidade é alta e verme alimento é de baixo.
3. Para pegar vermes, use umaescolha feita a partir de uma pipeta de vidro puxado com um fio de platina fundidos na extremidade puxada (~ 3-5 cm de comprimento). Achate o fio com uma borda lisa. Use a picareta para 'colher' up hermafroditas e transferi-los para novas placas. Chama o fio entre o uso para evitar a contaminação cruzada de cepas.

3. RNAi

1. Realizando RNAi
   1. Em primeiro lugar, lugar ~ 8 hermafroditas L4 em uma placa NGM unseeded para ~ 30-60 min para remover as bactérias OP50 dos vermes.
   2. Em seguida, colocar os 8 hermafroditas numa placa NGM Amp IPTG semeada com HT115 que carrega o plasmídeo L4440 expressar ARNcd de um gene de interesse (por exemplo ani-1;. Ver 1.2) durante ~ 24 horas. Nota: Dependendo do gene de interesse, ou os fenótipos desejados (que pode depender da força de knockdown), os vermes podem ser deixados nas placas de RNAi por períodos de tempo mais curtos ou mais longos (depois de 24 horas, coloque os hermafroditas em RNAi fresco placas).
   3. Para um negcontrole operatória, colocar minhocas sobre uma chapa de RNAi semeado com HT115 carregando o vetor L4440 vazio. Nota: Estes embriões não deve ter fenótipos.
   4. Para um controlo positivo, colocar uma placa de vermes em RNAi expressar ARNcd que tem como alvo um gene com fenótipos bem caracterizados. Nota: Para ró-1 (Y51H4A.3), os embriões são 100% letal após 24 horas e hermafroditas são estéreis após 48 horas.
2. RNAi Eficácia
   Os níveis de knockdown por RNAi deve ser testado, em particular desde cerca de tecidos podem ser mais resistentes do que os outros. Durante o início de meados embriogênese, a maioria dos tecidos são RNAi-sensível, mas no embrião ou larva tarde, os neurônios são resistentes à RNAi. Diferentes estirpes pode ser utilizada para melhorar a sensibilidade de RNAi (por exemplo, RRF-3), ou para gerar específica de tecido de RNAi (por exemplo, sid-1 em combinação com um transgene expresso pelo promotor neural unc-119).
   1. Western Blotting
      Immunoblotting usando C. elegans proteínas pode serrealizada de acordo com o protocolo padrão ^22.
      1. Depois de realizar ARNi, recolher ~ 10 prenhe (preenchido com embriões) hermafroditas num tubo de microcentrífuga, adicionar 20-30 tampão de amostra de SDS-PAGE pi 1x e lise por ebulição durante ~ 2 min. Da mesma forma, recolher vermes N2 num tubo separado para a amostra de controlo. Nota: O número de hermafroditas pode variar dependendo da sensibilidade dos anticorpos primários.
      2. Criar diluições da amostra de controlo (por exemplo, 3-100%) em tampão de amostra. Carregar o controlo e as amostras de RNAi e executar-se por SDS-PAGE de acordo com o protocolo padrão (o gel% irá variar dependendo do tamanho da proteína de interesse).
      3. Transferir o gel para uma membrana e efectuar imunotransferência, conforme o protocolo padrão. Nota: Utilize diferentes diluições de anticorpos primários e secundários, como recomendado para cada anticorpo.
      4. Desenvolver (por exemplo, se estiver usando quimiluminescência) ou digitalizar (por exemplo, se estiver usando fluorescência) do immunoblot e comparar ªe densidade de bandas nas pistas N2 contra a pista de RNAi, e determinar o nível de knockdown (por exemplo, a densidade de pista de RNAi corresponde a pista de controlo de 12%, isto sugere que a proteína é reduzida em 88%). Nota: Para ver a eficiência da ANI-1 knockdown, consulte Maddox et al ^23.
   2. Imunocoloração
      Imunocoloração em C. elegans pode ser realizada de acordo com protocolo padrão ^22.
      1. Após a realização de RNAi, recolher hermafroditas grávidas e embriões de colheita, utilizando um dos dois métodos. Para um dos métodos, lugar hermafroditas em tampão M9 (receita na tabela de reagentes / materiais) em 1,5 ml siliconizada microtubos e pellet através de centrifugação (1,000-4,000 xg). Nota: Da mesma forma coletar N2 hermafroditas grávidas.
      2. Remover a solução de M9.
      3. Expelir embriões por adição de 1 ml de solução de branqueamento (NaOH 1 M, 5% de branqueamento) para o tubo de microcentrífuga durante 3 min. Da mesma forma, N2 lixívia elermaphrodites para fazer lâminas de controlo.
      4. Vortex suavemente, em seguida, agregar imediatamente os embriões através de centrifugação (4,000-8,000 xg) e remover a solução de branqueamento. Nota: O tempo total em que os vermes são incubadas com lixívia não deve exceder os 5 minutos.
      5. Lavar os embriões 3 vezes com soluto salino tamponado com Tris (TBS, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl) e de transferência de embriões, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro para um poli-L-lisina-revestidas lâmina de microscópio. Nota: Para revestir uma lâmina de vidro com poli-L-lisina, primeiro limpe o slide, em seguida, adicionar uma gota (~ 20-30 mL) de poli-L-lisina e espalhe uniformemente por toda a superfície e deixe secar. Para melhores resultados, revestir as lâminas mais duas vezes. Um método alternativo para coletar embriões (Secções 3.2.2.1-3.2.2.5) é colocar uma gota de M9 em um poli-L-lisina revestido de lâmina de microscópio e escolher ~ 10 hermafroditas grávidas na gota.
      6. Adicionar uma lamela por cima de cada lâmina de microscópio (para a área que contém a maioria dos embriões) e lugaros slides em nitrogênio líquido. Nota: Para hermafroditas colocados diretamente na queda, a pressão colocada na lamela de abrir os hermafroditas e expulsar os embriões.
      7. Freeze-rachar os embriões sacudindo fora as lamelas imediatamente depois congelá-los em nitrogênio líquido.
      8. Colocar as lâminas no gelo metanol frio por 20 min para fixar os embriões. Nota: Para alguns antigénios, um fixador de reticulação, tais como paraformaldeído pode ser preferível. Veja o protocolo de Duerr ^22.
      9. Rehidratar e permeabilizar os embriões por lavagem das lâminas 4x com tampão salino Tris contendo Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) durante 10 minutos cada.
      10. Seque cada slide em torno da área que contém a maioria dos embriões e desenhar um círculo em torno dos embriões usando uma caneta bloqueio líquido (por exemplo, PAP caneta).
      11. Adicionar ~ 100 mL de TBST com 5% de soro de burro normal (NDS; bloco) para cada slide (área circulada) e incubar20 min à TA. Nota: Coloque os slides em uma "câmara úmida" (por exemplo, um prato com uma tampa contendo papel-toalha molhada).
      12. Remover o bloco, adicionar ~ 50-100 ul de anticorpos primários (diluído em TBST) para cada lâmina (zona assinalada) e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Nota: Dependendo do anticorpo, o tempo de diluição e incubação pode variar. Para detectar a GFP, usamos um agente anti-rato de anticorpo primário anti-GFP em uma diluição de 1/200. Para detectar ANI-1, usamos um anti-coelho anti-ANI-1 anticorpo primário em uma diluição de 1/1600 (gentilmente cedido por Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Para períodos de incubação mais longos, colocar as lâminas a 4 ° C.
      13. Remover anticorpos primários (se possível, mantenha para uso futuro) e lavagem das lâminas 3x com TBS por 5 minutos cada.
      14. Retirar a última lavagem e adicionar ~ 50-100 uL de anticorpos secundários (diluído em TBST) para cada lâmina (zona assinalada) e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Nota: Dependendo do anticorpo, a diluição pode variar. Para detectar a GFP, usamos um umnti-rato Alexa Fluor 488 anticorpo secundário numa diluição de 1/250. Para detectar ANI-1, que usa um anti-coelho Alexa Fluor 568 anticorpo secundário numa diluição de 1/250.
      15. Remover anticorpos secundários e lavagem das lâminas 3x com TBS por 5 min cada. Nota: Para coloração do DNA, adicionar ~ 50-100 ul de DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol; de 1 mg / ml) na diluição 1/500 em TBST durante 5 minutos.
      16. Retirar DAPI e lavagem das lâminas 2x com TBS durante 5 minutos cada. Nota: Se a coloração DAPI não é realizada, pule esta etapa de lavagem extra.
      17. Realizar uma rápida lavagem com Tris 0,1 M (pH 9), remover e adicionar ~ 15 ul de meio de fixação pré-aquecido a 37 ° C (4% de n-propil-3.4.5 trihidroxibenzoato (gaiato de propilo), Tris 50 mM, pH 9, em glicerol a 50%) para cada slide (área circulada).
      18. Adicionar uma lamela a cada slide (na parte superior do meio de montagem na área circulada), pavio fora o excesso de líquido e selar os slides com unha polonês. Nota: As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C.
      19. Observe os embriões emos slides usando um microscópio de fluorescência widefield ou de varredura a laser microscópio confocal. Importante, ajustar as configurações para coletar imagens de intensidade de pixels ideal usando controle embriões (N2 ou não RNAi). Em seguida, recolher imagens a partir de embriões de RNAi usando as mesmas configurações. Exemplos de imagens coletadas para o controle vs ani-1 embriões de RNAi são mostrados na Figura 2B.

4. Preparação de slides para Imagens ao vivo e colheita Embriões

1. Preparação de pastilhas de agarose para geração de imagens ao vivo
   1. Coloque um pano limpo, pré lâmina de microscópio esquentou entre dois outros slides, cada um com 1-2 tiras de fita sobre eles.
   2. Utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, adicionar uma gota de 2% w / v de agarose (dissolvido em água destilada aquecida) para a corrediça.
   3. Colocar rapidamente um segundo, lâmina de microscópio limpa em cima do primeiro slide de uma forma perpendicular para nivelar a queda de agarose. Nota: A fita na vizinha deslizoues proporciona a espessura da almofada.
   4. Deixe o bloco seco agarose para um 1-2 min antes de remover o top slide. Deslize a parte superior de slides com cuidado para evitar a quebra do bloco de agarose por baixo. Nota: Às vezes a almofada é transferido para o deslizamento de topo e ainda é utilizável, desde que ele permanece intacto.
   5. Transferir os embriões para a almofada de agarose dentro de poucos minutos após a sua preparação, tal como descrito abaixo (ver passo 4.2). Nota: O teclado deve ter uma aparência opaca, uma vez que é claro, é muito seco para usar.
2. Colheita de embriões
   1. Usar o seguinte protocolo para a recolha de embriões de imagens ao vivo, o qual é derivado a partir de ²⁴ Sulston et al.
   2. Escolha aproximadamente 4-6 adultos grávidas (que não morreram de fome) de placas NGM ou RNAi e colocá-los em 20-30 mL de tampão M9 em um poço em um slide depressão.
   3. Usar um bisturi esterilizado para cortar os vermes em cada lado da spermatheca (ou, alternativamente, próximo da vulva) alibertar os embriões para dentro da solução.
   4. Use uma mangueira de borracha com um pedaço na boca ligado a um capilar de vidro / pipeta puxado ter um pequeno furo e aspirar os embriões por via oral pipetagem. Alternativamente, coletar embriões com um tubo de vidro capilar que está ligado a uma pipeta de bulbo de borracha Pasteur.
   5. Transferir os embriões aspirada para um segundo poço contendo também tampão M9, para ajudar a separá-los do detritos sem-fim.
   6. Em seguida, os embriões de sucção em uma almofada de agarose preparada na hora (veja o passo 4.1).
   7. Embriões se aglutinarem usando um cílio (colado a um palito) para aumentar o número de embriões que podem ser filmadas em um x, y avião. Nota: Para evitar a privação de oxigênio, não se aglutinar mais de 10 embriões em conjunto.
   8. Em seguida, cobrir a lâmina com uma lamela e selar parcialmente com pré valap líquido aquecido (vaselina, lanolina e parafina; derretido e combinado 01:01:01) para evitar a desidratação dos embriões durante o exame. Nota: Adicionais tampão ca M9n ser adicionado à almofada para assegurar que os embriões têm líquido suficiente para a imagiologia. Em lugar de valap, vaselina pode ser usado para selar parcialmente lamelas, mas é menos rígida causando as lamelas de deslizamento e podem passar para os objectivos do microscópio.

5. Imagens ao vivo

1. Para visualizar os neuroblastos, obter uma estirpe sem-fim que expressa uma proteína específica do neuroblasto ligado a uma proteína fluorescente (por exemplo, HAM-1: GFP, ID estirpe em CGC OP102). Para detectar as membranas celulares, utilizar uma estirpe de vírus que também exprime um domínio de proteína que reconhece lípidos ligados a uma proteína fluorescente diferente (por exemplo, mCherry:. PH, ID estirpe em CGC OD70).
2. Colheita de embriões hermafroditas fluorescentes manteve no controle ou ani-1 placas de RNAi (ver protocolos 3 e 4), e preparar os slides, como descrito acima (ver Protocolo 4).
3. Embriões imagem em 4D (x, y, z e time-lapse) por microscopia de epifluorescência. Use um wisistema defield [microscópio de fluorescência automatizado com filtros para GFP e TexasRed, objetivos de até 60X ou 100X, uma alta resolução CCD (Charge coupled device) câmera, altamente motorizada fase (por exemplo,. Piezo Z) e software de aquisição especializado] campo ou uma varredura ao vivo varreu microscópio confocal [automatizado microscópio de varredura fluorescente com 488 nm e 561 nm lasers, os objetivos até 100X, um (elétron CCD multiplicando) câmera EMCCD, altamente motorizada fase (por exemplo, Piezo Z) e software de aquisição especializado]. Nota: Para que o sistema de campo amplo, usando LEDs e uma câmera EMCCD limitará fototoxicidade. Além disso, um microscópio confocal de disco giratório pode ser usada no lugar do sistema de campo varrido.
4. Para a divisão celular imagem neuroblasto em qualquer sistema, encontrar x, y quadros de embriões utilizando os objectivos de 10X ou 20X e escolha um x, y ótimas quadro onde os embriões são submetidos a intercalação dorsal (passo antes de gabinete ventral; Figura 1A) ou são em fases iniciaisde invólucro ventral (~ 350 minutos após a primeira divisão celular; Figura 1A).
5. No microscópio de campo varrido, use a 488 nm e 561 nm lasers 100 MW a 40% de energia com uma fenda de 50. Sobre o sistema de campo amplo, utilize os filtros GFP e TexasRed com baixo-médio de intensidade de luz (se controlável). Nota: Para que o sistema de campo amplo, os LEDs têm baixa fototoxicidade e são preferíveis.
6. Em qualquer sistema, use os objetivos de imersão em óleo 60X ou 100X e coletar 20 Z-pilhas de 0,2 m a cada 2 min, num total de 10 min. Nota: Embora o HAM-1: GFP e mCherry: sondas de PH expressar em níveis relativamente elevados, os tempos de exposição para cada sonda terá de ser otimizado para diferentes microscópios. Nota: Para que o sistema de campo amplo, menos Z-stacks são recomendados para limitar fototoxicidade e para a imagem latente durante longos períodos de tempo, usar menos pontos no tempo.
7. Para minimizar fototoxicidade causada pela exposição dos embriões à luz UV sobre o sistema widefield (se usando um mercury bolbo), fechar a abertura a 30% e diminuir a intensidade da luz (utilizando um sistema de iluminação ajustável). Nota: Embora o ganho não é necessário utilizar qualquer um dos sistemas, outros microscópios podem ter fontes de luz com intensidades mais baixas ou objetivos com diferentes aberturas numéricas, o que poderia exigir o uso de ganho para obter imagens de intensidade de pixels ideal. Teste as condições usando um embrião de controle para assegurar que quaisquer fenótipos observados não são devido a fototoxicidade artificial.

6. Análise de Dados Microscopia

1. Para analisar as imagens, arquivos de exportação, como TIFF e abrir os TIFF como uma pilha usando um software especializado, como um programa de processamento de imagem baseado em Java (por exemplo, ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Nota: Dependendo do software de aquisição usado para coletar as imagens, os arquivos podem ser mantidos em sua forma original e inaugurado em ImageJ. Isso é preferível que os metadados é mantida com os arquivos.
2. Separa-se a pilhaem "imagens" e pontos de seleção de tempo e Z-aviões como desejados. Nota: Apesar de uma pilha de 20 Z-aviões é tomada, muitos dos neuroblastos são <1 mm de espessura em meados embriogênese tardia e apenas alguns Z-aviões são necessários.
3. Empilhe novamente os aviões Z selecionados para cada ponto de tempo e fazer projeções Z-stack separados. Em seguida, empilhe as projeções para cada vez apontam juntos para fazer uma seqüência de tempo.
4. Faça os ajustes para o brilho / contraste e ou para cada canal.
5. Em seguida, selecione uma região de interesse, cultura (e girar, se necessário) da região.
6. Criar imagens fundidas utilizando a função dos canais incorporadas 'e escolher uma cor diferente para cada canal. Converter imagens incorporadas para RGB.
7. Inverter imagens em tons de cinza para cada canal de passos 6.3 ou 6.4 (uso da função 'invertido' em 'editar') para visualizar imagens com maior clareza.
8. Salvar todas as imagens finais como TIFF de 8 bits para fazer figuras no vetor baseada softwsão programas ou como arquivos QuickTime para fazer filmes.
9. Se forem necessárias medições de tamanho de pixel (por exemplo, incluir uma barra de escala com as imagens), utilizar ImageJ, ou outro software de processamento de imagens para medir o tamanho do embrião. Nota: As imagens recolhidas com objetivos diferentes terão diferentes tamanhos de pixel.

Este protocolo experimental descreve como a divisão celular imagem em C. elegans embriões durante meados embriogênese. Em particular, ela descreve como neuroblastos de imagem, o que pode facilitar epidérmica morfogênese. Epidermal morfogênese ocorre devido a uma combinação de mudanças no formato de células epidérmicas, migração e adesão, mas também depende de estímulos químicos ou mecânicos dos neuroblastos subjacentes (Figura 1B). Os neuroblastos secretam pistas de orientação que são recebidos por receptores na superfície das células da epiderme ventral, o qual regula a sua migração ^10,14,25. Além disso, os neuroblastos são altamente proliferativo, que podem fornecer forças mecânicas que contribuem para a migração das células da epiderme ventral ^26. Este protocolo pode ser utilizado para estudar a divisão celular de neuroblastos em meados embriogénese. Primeiro, os embriões co-expressam marcadores para visualizar neuroblastos (HAM-1: GFP) passando por citocinese (mCherry: PH) são gerados. HAM-1: GFP expressa GFP (proteína fluorescente verde) etiquetadas proteína que se localiza neuroblasto núcleos ^27, e é necessário utilizar uma vez que existem muitos outros tipos de células presentes durante meados embriogênese (> 300 células; Figura 3). Isso também funciona como um bom marcador para células em divisão, uma vez que o DNA se condensa em cromossomos durante a mitose. mCherry: PH é uma proteína fluorescente mCherry marcado que é expresso por um promotor materna (pie-1), e contém o domínio de ligação de lípidos de PLC1 ∂ 1 28, que se localiza nas membranas celulares. Esta proteína é necessária para visualizar a citocinese, quando a membrana e citosol beliscar em separar a célula mãe em duas células filhas, a Figura 3; Vídeo 1). Embora este protocolo descreve a forma de divisão de neuroblastos imagem, (mostrado pela HAM-1: expressão da GFP), outros marcadores podem ser utilizados para visualizar a outros tipos de células.

Para visualizar dividindo neuroblastos, embriões coexpRessing HAM-1: GFP e mCherry: PH são gravadas a cada 2 minutos (para um total de 10 min). Cada neuroblasto é apenas ~ 1-4 m de diâmetro, e é <1 mm de espessura, e é melhor usar um objetivo com ampliação elevada (por exemplo,. 100X). Além disso, numerosos Z pilhas (~ 20) são recolhidas com um tamanho pequeno passo (0,2 mm) para assegurar que os vários ângulos de cada célula (forma esférica) são gravadas. Para coletar isso muitas imagens sem comprometer os momentos, uma fase altamente motorizado (por exemplo Piezo Z Stage) é recomendado. Após a recolha de uma série de imagens, que são analisados ​​para se encontrar dentro de algumas células Z pilhas que se estão a dividir, o DNA é condensado, a membrana é ingressou e as células filhas são formando (pontos de tempo da pilha projectada dos canais são fundidos mostrado na Figura 3A, e pilhas seleccionados de canais fundidos são mostrados na Figura 3B; Vídeo 1). Para melhor visualizar as células, é recomendávelmanter cada canal em tons de cinza e inverter as imagens (por exemplo, a Figura 4).

A resolução da imagem é diferente para o sistema de campo amplo com uma câmera CCD de alta resolução (1344 x 1024 pixels) vs. o sistema de campo varrido usando uma câmera EMCCD alta velocidade com alta sensibilidade (~ 35 frames / seg e 512 x 512 pixels). Imagens invertidas de dividir neuroblastos a partir de embriões de controlo tomadas com ambos os sistemas são apresentados para comparação (Figura 4 vs. 5). Como mostrado na Figura 4A (sistema widefield; vídeo 2), as imagens são mais claras vs Figura 5A. (Sistema campo varrido; vídeo 4). No entanto, quando se utiliza o sistema de campo amplo, os embriões são susceptíveis a fototoxicidade e pontos de tempo mais rápido não são possíveis com a câmara de alta resolução. Por exemplo, para examinar as alterações na localização de várias proteínas (p. ex. To mudanças em sua dinâmica estudar), pontos de tempo pode precisar de ser recolhidos com maior frequência. Além disso, pode não ser possível para a imagem por longos períodos de tempo, sem reduzir o número de pilhas de Z-e pontos de tempo. Usando uma câmera EMCCD no sistema widefield pode permitir uma ampla gama de aplicações de imagem. As câmeras que têm tanto de alta resolução e alta velocidade têm sido desenvolvidos, mas os motoristas podem não estar disponíveis, dependendo do software de aquisição a ser utilizado, e eles ainda não pode ser tão sensível como câmeras EMCCD. Outro sistema que é comumente usado para a imagem latente C. elegans é o confocal disco giratório, que também tem menor fototoxicidade e pode ser equipado com um ou outro EMCCD ou CCD (ver Discussão).

Para estudar os genes que são necessários para a divisão celular, os hermafroditas são tratados com RNAi contra um gene de interesse (por exemplo, ani-1; ver Secções 1.2 e 3 do protocolo) e seus embriões são gravadas da mesma forma como control embriões. Para comparar células a partir de embriões de RNAi para controle de embriões, é melhor para a imagem em estágios semelhantes de desenvolvimento embrionário (para ajudar a formas celulares jogo e posições). Por exemplo, há uma célula maior visível no centro do embrião durante recinto ventral que pode actuar como um bom ponto de referência para os neuroblastos de imagem (Figuras 4 e 5). O gene estudado, ani-1 (anillin), organiza actomiosina contratilidade, mas não é necessário para a citocinese no embrião inicial ^23,29-30. Homólogos do Anillin, no entanto, são necessários para a citocinese em eucariotos superiores ^16, e ani-1 é necessário para neuroblasto citocinese (Fotopoulos, Wernike e Piękny, observações não publicadas). Como mostrado nas Figuras 4B (Video 3) e 5B (Vídeo 5), vários neuroblastos iniciar citocinese e suas membranas beliscar, mas, em vez de formar duas filha separadacélulas, as suas membranas regredir e as células se tornam multinucleadas (> 1 núcleo / célula). Deve-se notar que a ani-1 pode ser necessário para a divisão ou a mudança de forma de outros tipos de células, que não são revelados por este protocolo. Além disso, este protocolo não mostra resultados de RNAi específica do tecido (ver Discussão).

Figura 1. Ventral recinto durante C. elegans morfogênese epidérmica. A) as projeções Z-stack (3 Z-pilhas de 0,5 m de espessura) de um controle AJM-1: GFP (marcador adherens junção de visualizar limites da célula da epiderme; ID tensão no CGC SU159) embrião passando por intercalação dorsal (esquerda, vista dorsal ) e um AJM-1 controle: embrião GFP passando gabinete ventral (à direita, vista ventral). As imagens são invertidos para melhor visualize limites da célula. B) Desenhos Animados mostrar vistas ventral da C. embriões elegans submetidos recinto ventral. Em primeiro lugar, dois pares de líderes de células de ponta (azuis) usar filopodia actina rico (linhas pretas) para migrar em direção a linha média ventral (embrião do lado esquerdo). Em seguida, as células de bolso ventral posterior (vermelho) migram em direção a linha média criando um buraco na superfície ventral que pode fechar por um cordão da bolsa como mecanismo (B '; preta pontilhada linha / círculo; reminiscência de cicatrização de feridas) ^25. Também são mostrados os neuroblastos subjacentes (como círculos cinza). O segundo embrião (B ") indica a forma como a migração de subconjuntos específicos de células epidérmicas são mediados por uma 'ponte' formado a partir do rearranjo de células PLX-2/plexin e VAB-1/Ephrin-expressam o receptor 'da banda plexin' (verde círculos.) Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 2. ANI-1 localização em C. elegans embriões. A) C. A fixa elegans embrião expressando HMR-1: GFP (E-caderina, marcador de limites da célula da epiderme) costained para GFP (verde) e ANI-1 (vermelho). Imagens confocal das camadas de células externas (4 Z-pilhas de 0,2 m de espessura) mostram as células da epiderme sobrejacente e neuroblastos subjacentes, que são ANI-1 positivo B) Fixa N2 e N2;. Ani-1 embriões RNAi são co manchado por ANI-1. ANI-1 é bastante reduzido no embrião esgotados ani-1-. Barras de escala: 10 m. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3. Visualizando dividindo neuroblasto durante C. elegans embriogênese. (A) as projeções Z-stack (20 Z-pilhas de 0,2 m de espessura) são mostrados a partir de um embrião de controle co-expressam HAM-1: GFP (para visualizar núcleos neuroblastos; verde) e mCherry: PH (para visualizar as membranas celulares; vermelho) . Muitos neuroblastos e outros tipos de células são visíveis nas projecções (B) Z-projecções pilha utilizando um menor número de aviões Z são mostradas a partir de um outro embrião de controlo co-expressam HAM-1:. GFP (verde) e mCherry: PH (vermelho). Uma área é ampliada (caixa branca) para mostrar mais claramente uma neuroblasto divisória individual. Cabeças de setas brancas apontam para a membrana plasmática ingressing de uma célula se dividir e círculos verdes destacar o DNA condensada durante a mitose e recém-formando núcleos filha, no final da mitose. A grande célula serve como um ponto de referência (asterisco branco) para determinar o grau de desenvolvimento e localização dentro do embrião. Barras de escala: 10 m. (Brancos) e 3,5 mM (amarelo) Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4. Visualizando neuroblasto citocinese durante C. elegans embriogênese usando um sistema de campo amplo. A) invertido projeções Z-stack (2 Z-pilhas de 0,2 m de espessura) são mostrados a partir de um embrião de controle co-expressam HAM-1: GFP e mCherry: PH recolhida a partir do sistema widefield usando uma câmera CCD de alta-resolução. Setas vermelhas apontam para neuroblastos dividindo com ingressing membranas celulares. Círculos verdes destacar DNA condensado em fases precoces da mitose ou recém-formando núcleos filhos no final da mitose / citocinese. A grande célula serve como um ponto de referência (asterisco amarelo) para determinar a fase de desenvolvimento. B) As imagens mostradas são semelhantes a A), mas são de um embrião tratado com ani-1 RNAi. O ingresso da membrana celular em que a célula passa através da mitose, mas relaxa, pouco depois, deixando uma célula multinucleados. Barra de escala:. 10 m (preto), 3,5 mM (amarelo) Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 5. Visualizando neuroblasto citocinese durante C. elegans embriogênese usando um sistema de campo varrido. A) invertido projeções Z-stack de 2 Z-pilhas de 0,2 m (total de 0,4 mM) são mostrados a partir de um embrião que co-expressam HAM-1: GFP e mCherry: PH coletadas a partir do sistema de campo varrido usando uma câmera EMCCD com alta sensibilidade, mas resolução mais baixa. A seta vermelha aponta para uma citocinese neuroblasto passando. Círculos verdes destacar DNA condensada durante a mitose ea filha recém-formando núcleos após citocinese. A grande célula serve como um ponto de referência (asterisco amarelo) para determinar a fase de desenvolvimento. B) As imagens mostradas são semelhantes a A), mas são de um embrião tratado com ani-1 RNAi, e Z-3 são utilizadas pilhas (total de 0,6 mM ). Como descrito acima, os ingressa membrana em que os rendimentos de células através de mitose, mas, em seguida, fazendo com que relaxa a célula se torne multinucleados. Barra de escala: 10 um (preto), 3,5 mM (amarelo).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Video 1. Visualizando neuroblastos dividindo durante C. elegans embriogênese. Projeções Z-stack de dois aviões Z (0,4 mM / avião) a partir de um embrião de controle co-expressam HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (vermelho). Imagens coletadas do microscópio widefield são mostradas para ambos os canais. O vídeo corresponde ao embrião mostrado no terceiro painel da Figura 3B. Clique aqui para assistir ao vídeo.

Video 2. Visualizando neuroblastos dividindo durante C. elegans embriogênese. Projeções Z-stack de dois aviões Z (0,4 mM / avião) a partir de um embrião de controle co-expressam HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (vermelho). O vídeo corresponde a imagens invertidas, coletados a partir do microscópio de campo amplo para a mCherry: canal PH only (embrião na Figura 4A). Clique aqui para assistir ao vídeo.

Vídeo 3. Visualizando neuroblastos dividindo durante C. elegans embriogênese. Projeções Z-stack de dois aviões Z (0,4 mM / avião) a partir de um embrião tratado ani-1 RNAi co-expressam HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (vermelho). O vídeo corresponde a imagens invertidas, coletados a partir do microscópio de campo amplo para a mCherry:. Único canal PH (embrião na Figura 4B) Clique aqui para assistir ao vídeo.

Video 4. Visualizando dividindo neuroblasto durante C. elegans embriogênese. Projeções Z-stack de dois aviões Z (0,4 mM / avião) a partir de um embrião de controle co-expressam HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (vermelho). O vídeo corresponde a invertered imagens recolhidas a partir do microscópio confocal campo varrido para o mCherry:. único canal PH (embrião na Figura 5A) Clique aqui para assistir ao vídeo.

Video 5. Visualizando dividindo neuroblasto durante C. elegans embriogênese. Projeções Z-stack de três planos Z (0,4 mM / avião) a partir de um embrião tratado ani-1 RNAi co-expressam HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (vermelho). O vídeo corresponde a imagens invertidas, coletados a partir do campo de microscópio confocal varrido para o mCherry:. Único canal PH (embrião na Figura 5B) Clique aqui para assistir ao vídeo.

Este protocolo descreve o uso de vários tipos de microscopia de divisões celulares imagem durante meados embriogénese. Em particular, este protocolo destaca como a imagem da divisão de neuroblastos, células que podem facilitar epidérmica morfogênese. Comunicação célula-célula é importante para a formação de tecidos durante o desenvolvimento de metazoários e C. elegans é um excelente modelo para estudar a formação de tecido in vivo. Um evento que retrata muito bem a interação de tecidos é epidérmica morfogênese, que cobre o embrião de uma camada de células epiteliais. Em particular, o invólucro ventral é o processo em que as células da epiderme ventral migrar para envolver a superfície ventral do embrião, e baseia-se os neuroblastos subjacentes. Os neuroblastos fornecer estímulos químicos ou mecânicos, e gabinete ventral fica comprometida se a posição dos neuroblastos é alterada. O número (ou polaridade) da neuroblastos também pode ser essencial para o recinto ventral ocorra adequadamente,e é importante compreender os mecanismos que regulam a sua divisão. Este protocolo descreve como a divisão celular de imagem dentro de um tecido vivo usando C. elegans embriões co-expressam duas sondas fluorescentes (mCherry: PH para delinear membranas e HAM-1 no plasma: GFP para rotular núcleos neuroblasto).
Os passos mais importantes para a imagem que vivem C. elegans embriões expressando sondas fluorescentes são: i) usar saudáveis, hermafroditas adultos jovens expressando os marcadores fluorescentes desejados (mantida a 20-25 ° C), ii) usar mutantes ou RNAi para estudar os requisitos de genes durante a formação do tecido, iii) coletar embriões no à direita do palco para microscopia (eg. meados embriogênese) e iv) realizar microscopia de fluorescência usando configurações otimizadas para manter fototoxicidade baixo, mas para manter a alta qualidade de imagem.

Para identificar as células específicas e / ou compartimentos intracelulares dentro de um tecido de interesse, utilizar vermes expressando marcadores marcados com pró fluorescentebes. O Centro de Genética Caenorhabditis (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) oferece uma variedade de cepas que co-expressar múltiplos marcadores. Contudo, duas amostras (cada uma expressando um único marcador de interesse) pode ter que ser cruzados e pesquisados ​​com um microscópio de fluorescência ao longo de várias gerações para gerar uma estirpe expressando estavelmente ambas as sondas. Por exemplo, para levar a cabo este protocolo experimental, uma estirpe que expressa um marcador para visualizar membranas celulares (mCherry: PH; OP70) foi cruzada com uma estirpe que expressa um marcador para visualizar núcleos neuroblastos (HAM-1: GFP; OP102) para gerar um tensão co-expressam ambos.

A melhor maneira de estudar os requisitos de genes durante o desenvolvimento embrionário é a realização de experimentos de perda de função, onde o produto do gene é derrubado ou mutantes. Este protocolo experimental descreve realizar RNAi contra anillin (ani-1) para reduzir endógenos ANI-1 níveis em todos os tecidos embrionários. Há alelos hypomorphic não bem caracterizadosde ani-1. Portanto, RNAi é a melhor opção para analisar a perda do ani-1 de fenótipos de função e determinar a sua função durante o desenvolvimento embrionário. Normalmente, é preferível utilizar os mutantes em vez de RNAi, como a eficiência de knockdown pode ser variável e raramente é nula. Um dos problemas mais comuns encontrados com alimentação protocolos RNAi é a contaminação, o que reduzirá a eficiência de RNAi. Para diminuir o risco de contaminação, preparar as chapas e comida de RNAi em condições assépticas. A contaminação pode ser detectada por rastreio de algumas das placas antes da utilização, e com placas opacas bactérias lácteas / procuram deve ser descartado. Outro problema que pode reduzir a eficiência de RNAi é não escolhendo hermafroditas no estágio de desenvolvimento para a direita. O melhor é usar vermes adultos L4-encenados ou jovens (a vulva desenvolvimento aparece como um círculo / buraco esbranquiçada no lado ventral do verme), que não têm / alguns embriões fertilizados. Além disso, as condições e os tratamentos de RNAi may variar para diferentes produtos de genes. Diferentes maneiras de aumentar ou diminuir a força do RNAi é por ressuspensão das bactérias HT115 peletizadas em diferentes quantidades de meio LB Amp (ver secção 1.2.2), e alterando a duração do tratamento de RNAi (período de tempo que os vermes são mantidos placas de RNAi, ver Protocol 3). Para produzir ótimas ani-1 RNAi fenótipos para este protocolo, as bactérias foram ressuspendidas em 500 mL de mídia LB Amp e worms foram mantidos em placas de RNAi para 2 dias (ani-1 RNAi foi previamente caracterizada por Maddox et al. ^23). Estirpes resistentes ou sensíveis RNAi (por exemplo. Rde-1, sid-1 ou rrf-3) também pode ser utilizada para alterar a força de RNAi. Mais importante, estas estirpes podem ser acoplados com a expressão específica de tecido dos genes de tipo selvagem para criar estirpes sensíveis de tecido. Por exemplo, para executar neuroblastos RNAi específico, pode-se utilizar um sid-os embriões mutantes (RNAi)-resistente que expressa em peso Sid-1 sob o unc-119 promotor (ID tensão no CGC TU3401) ^31.

Este protocolo descreve como divisão celular neuroblasto imagem em meados de embriogênese. Há vários aspectos do protocolo que requerem uma consideração cuidadosa, como o estágio de desenvolvimento dos embriões, coletando os Z-pilhas apropriadas e otimizar as condições de imagem para minimizar fototoxicidade sem comprometer a qualidade da imagem. Para capturar pontos de tempo no estágio de desenvolvimento para a direita (por exemplo, cerco ventral), embriões devem ser filmado de intercalação dorsal (pares de células epidérmicas dorsais interdigitam e fundem para formar uma única camada de epiderme no lado dorsal do embrião; Figura 1A6). Neste momento, os neuroblastos estão em divisão rápida. Desde encenar os embriões podem ser difíceis em pequeno aumento (por exemplo, usando um microscópio de dissecação), que ajuda a coletar muitos embriões de diferentes estágios e embriões noà direita do palco podem ser selecionados usando uma ampliação maior.

Neuroblastos são relativamente pequenas e finas, e são encontrados em todo o meio do embrião. É essencial para optimizar o número e tamanho de Z-pilhas para assegurar que toda a célula é capturado durante a divisão. Por exemplo, a coleta de muitas imagens irá expor os embriões para mais luz e torná-los propensos a fototoxicidade. No entanto, a coleta também algumas Z-pilhas ou usar seções Z grossos poderia dificultar a imagem corretamente uma célula em divisão neuroblasto inteiro.
Este protocolo descreve o uso de um microscópio confocal de campo varrido ou sistema widefield a divisão celular imagem neuroblastos. Como descrito anteriormente, uma das principais limitações da utilização de um microscópio de epifluorescência widefield é o potencial para a fototoxicidade. Embora seja altamente recomendável usar um confocal disco giratório ou varrido confocal campo para a imagem latente C. elegans embriões, alguns laboratórios podem ter acesso limitado a estes sistemas. Este protocolo dá algumas sugestões para limitar fototoxicidade quando se utiliza sistemas de campo amplo, como fechar a abertura a 30%, reduzindo a intensidade da luz da lâmpada de mercúrio (ou de preferência utilizando LEDs), usando uma câmara EMCCD, e aumentando o ganho ou a permitir binning uma diminuição no tempo de exposição. O número de pilhas de Z-e pontos de tempo também será limitado utilizando um sistema de campo amplo. Embora não tenha sido descrito neste protocolo, o disco giratório microscópio confocal é comumente usado para geração de imagens ao vivo, uma vez que provoca menor fototoxicidade em comparação com um microscópio de campo amplo. Semelhante ao sistema de campo varrido, que utiliza lasers de estado sólido e espalha a luz (embora de forma diferente em relação ao campo varrido). Ou CCD ou EMCCD câmeras podem ser usadas com o sistema de disco giratório, que muitas vezes tem várias portas de câmaras para permitir dupla imagem. Semelhante ao microscópio de campo varrido, as imagens podem ser capturadas com tempos de exposição 50-90% menor em relação ao sistema de campo amplo.
Este protocolool pode ser utilizado para estudar a função dos vários genes que regulam a mitose durante a formação do tecido. O tempo entre cada imagem pode ser reduzido (p. ex. Cada 15-30 seg vs. 2-3 min) para visualizar melhor fenótipos mitóticas. Diferentes sondas pode ser utilizado (por exemplo, em vez de usar HAM-1:. GFP, H2B fluorescente marcado pode ser utilizada para visualizar o ADN, e / ou fluorescente marcado tubulina poderia ser usado para visualizar fusos mitóticos). O número de Z-pilhas e a espessura de cada pilha também pode ser alterada (por exemplo, mais pilhas de um tamanho menor do passo). Como descrito acima, escolher as configurações adequadas é fundamental para limitar a fototoxicidade e otimizar a qualidade de imagem. Mesmo que o mCherry: PH e HAM-1: sondas GFP expressar em níveis relativamente elevados, a coleta de pontos de tempo mais rápido, aumentando o número de Z-pilhas ou de imagens por longos períodos de tempo versus o que está descrito neste protocolo pode não ser possível em um sistema de campo amplo.
A im baseado em Javaprograma de processamento de idade (ImageJ, NIH) pode ser usado para processar imagens recolhidas pelos diferentes microscópios e as imagens podem ser exportados como arquivos TIFF. No entanto, dependendo do software utilizado para a aquisição, os ficheiros poderão já ser compatível com o software de processamento. É melhor abrir os arquivos originais vs imagens exportadas (por exemplo, TIFFs), uma vez que os metadados é mantida com os arquivos originais. Software de processamento pode ser usado para manipular imagens para fazer figuras ou filmes. Além disso, as análises quantitativas também pode ser realizada, tal como medindo intensidades de pixel em regiões seleccionadas. Software ideal deve ser selecionado de acordo com a análise, tais como Imagem Processing Toolbox (MathWorks, Matlab) ou 3D e 4D em tempo real Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane).
Usando este protocolo, foi demonstrado ani-1 a ser necessária para neuroblastos citocinese, mesmo que ele não é necessário para a citocinese no embrião inicial. Curiosamente, controlando o number e posição de neuroblastos, ani-1 pode regular a migração das células da epiderme ventral para recinto ventral, porque os neuroblastos proporcionar estímulos químicos ou mecânicos para as células epiteliais sobrepostas. No entanto, não se sabe se é necessária uma ani-1 para a divisão ou a alteração da forma de outros tipos de células durante o meio embriogénese tardia. Mostrando como a composição total de um tecido afeta os tecidos vizinhos enfatiza a importância da comunicação de tecidos durante o desenvolvimento metazoan.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores gostariam de reconhecer que este trabalho foi apoiado pelas Ciências Naturais e Council of Canada (NSERC) concessão de Pesquisa de Engenharia.