Bir Insanlaşmış Fare Modeli epidermal melanin ve Karşı Koruma yanığı Farmakolojik İndüksiyon

Epidermal melanin tenli UV duyarlı insan bir fare modelinde forskolin topik uygulanmasıyla elde edilir. En az eritematöz doz (MED) deneyi ile ölçüldüğü gibi güçlü bir UV aracılı enflamasyonun (güneş yanığı) karşı koruma koyulaşması deri ve epidermal cAMP düzeyleri farmakolojik manipülasyonu.

Cilt, UV duyarlılığı ve cilt kanseri riskinin Adil tüm melanokortin 1 reseptörünün fizyolojik işlevi, melanosit yüzeyinde bulunan bir G _{s-bağlanmış} bir sinyal gönderme proteini ile ilişkilidir. MC1R da, ciltteki melanin melanositik üretimini düzenler, adenilil siklazı ve cAMP üretimini uyarır. MC1R sinyal UV yaralanmalara karşı korur hangi mekanizma ile incelemek için bu çalışma, kök hücre faktörü (SCF) ve epidermal ifade göre "hümanize deri" ile, bir fare modelinde dayanır. K14-Scf transgenik fareler de melanosit korumak Bu nedenle epidermis ve epidermiste melanin yatırmak yeteneğine sahiptir. Bu hayvan modelinde, siyah eumelanin pigment ve bir UV-korumalı fenotip sağlam birikimi yabani tip MC1R durumu ile sonuçlanır. Bunun aksine, arızalı MC1R sinyal yeteneğini sergilerler bir sarı / kırmızı bir pigmentasyon, deride çok az eumelanin ile K14-Scf hayvanlarBir UV duyarlı fenotip. Bu eumelanin birikmesini akıl MC1R sinyali taklit topik maddeler ile geliştirilmiş olabilir, biz MC1R arızalı tenli farelerin derisine forskolin özü doğrudan uygulama sağlam eumelanin indüksiyon ve UV koruması ¹ neden olduğunu bulduk. İşte biz hazırlıyoruz ve K14-Scf tenli farelere bir forskolinle içeren doğal kök ekstresi uygulanması ve minimal eritem dozu (MED) belirlenerek UV duyarlılığını ölçmek için bir yöntem bildirmek için yöntem açıklanmaktadır. Bu hayvan modeli kullanılarak, bu cildin epidermal cAMP indüksiyon ve melanizm UV maruziyeti fizyolojik tepkileri nasıl etkilediğini incelemek mümkündür.

Melanom insidansı, cilt kanserinin en ölümcül formu, özellikle açık tenli bireyler arasında, Amerika Birleşik Devletleri'nde son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır. Güçlü ve moleküler epidemiyolojik kanıtlar önemli bir etken çevresel faktör ^2-5 gibi UV radyasyonu implicates. Güneşe maruz kalma ve bronzlaşma yatak kullanım şeklinde artan UV ışınlarına maruz kalma melanom insidansında ^6-7 artışların çok sorumlu olması muhtemeldir. Melanom riski özellikle güneş yanığı ^8, hayatında ^9-10 erken özellikle de bağlantılı görünüyor. Güneş yanığı tehlikesi dozu ve UV ışınlarına maruz kalma yoğunluğu, aynı zamanda UV ışınlarına cilt cevabı etkileyen kalıtsal faktörler tarafından sadece bağlantılıdır. Cilt pigmentasyon UV duyarlılığı en önemli belirleyicilerinden biri, güneş yanığı ve kanser riski riskidir. Melanom koyu tenli individua göre açık tenli kişilerde yaklaşık yirmi kat daha sık görülür^11-13 ls.

Melanin, epidermis melanositler tarafından üretilen bir pigment, cilt cilt temel belirleyicisidir. (1) eumelanin, UV radyasyon enerjisini emici etkili bir koyu kahverengi / siyah pigment, ve (2) Pheomelanin, deri içine UV foton nüfuz etmesini engelleyen daha az etkili olan bir kırmızı / sarı pigment: Melanin iki ana çeşitleri geliyor. Cilt rengi, UV duyarlılığı ve melanom riski büyük ölçüde epidermal eumelanin içeriği ^14-15 tarafından belirlenir. Epidermiste daha eumelanin, daha az UV foton deri içine nüfuz edebilir. Çünkü eumelanin düşük doğuştan düzeyleri, açık tenli bireyler çok daha fazla eğilimli UV radyasyonunun ^16-18 akut ve kronik etkileri vardır.

Cilt pigmentasyon, melanoma risk ve "tan" UV maruz kaldıktan sonra tüm melanokortin reseptörü 1 (MC1R) sinyalleme yeteneği ile ilişkili, bir G _s birleştirilmiş yedi transmembran s yeteneğimelanosit ^19-22 sert bir yere reseptör. MC1R aynı kökten gelen yüksek afiniteli bir ligandın, α-melanosit uyarıcı hormon (α-MSH) bağlanan, ikinci haberci cAMP'nin ²³ adenilil siklaz ve üretim aktivasyonu mevcuttur. UV ışınlarına maruz kalan cilt, normal fizyolojik bir cevap keratinositler ^24-29 tarafından α-MSH epidermal üretimi içerir. Biz ve diğerleri keratinosit kaynaklı α-MSH adenilil siklaz ³⁰ aktivasyonu ile cAMP ikinci haberci aşağı üretimini başlatarak, epidermal melanositler MC1R bağlar varsayımında. cAMP seviyeleri hayatta kalma yollar, DNA tamiri ve pigment sentezi gibi melanosit farklılıkların birçok yönünü kontrol. MC1R sinyalizasyon ve cAMP açıkça pigment enzim düzeylerini ve eumelanin üretimini uyarmaktadır. MC1R sinyalizasyon sağlam ve melanositik cAMP düzeyleri sağlam olduğunda, eumelanin üretilen ve cilt karartan. Ancak, MC1R sinyal arızalı olup olmadığını vesitoplazmik cAMP düzeyleri düşük kalması, Pheomelanin ¹ yerine üretilmektedir. Eumelanin sentez cAMP düzeylerini yükseltmek ^1,14,31-35 ajanları tarafından farmakolojik teşvik edilebilir.

MC1R proteini insanlarda ^36-46 melanom riski önemli bir düzenleyici olduğundan, MC1R UV-kaynaklı kanser oluşumuna karşı koruyan melanosit hangi mekanizmalar ilgilendi. Bizim çalışmalar için bir temel olarak, biz saf C57BL / 6 genetik birikimine ¹ bir transgenik MC1R-varyant fare modeli oluşturulur. Bu modelde, kurucu bazal epidermis içinde ifade edilir ve epidermal interfolliküler melanosit saç folikülleri dermise lokalize melanosit edildiği transjenik olmayan farelerde aksine, yaşam ⁴⁷ boyunca deri korunur hücre faktörü (SCF) kaynaklanıyor. K14-Scf transgen dahil ile, epidermis pigmentin özellikle melanin pigmentleri ile pigmentli hale karakteristikhayvanın ¹ suşu. vahşi tip MC1R sinyalizasyon ile C57BL / 6 genetik birikimine K14-Scf fareler jet-siyah deri eumelanin pigment çok yüksek düzeylerde olması. Şaşırtıcı olmayan bu hayvanlar yüksek UV ışınlarına dayanıklıdır. Buna karşılık, mutant etkin MC1R barındıran genetik olarak uyumlu K14-Scf C57BL / 6 hayvan epidermiste hemen hemen hiç eumelanin vardır. Bunun yerine, bu "uzantısı" hayvanlar (MC1R ^{e / e)} Pheomelanin pigment (Şekil 1A) birikimi neden adil bir cilt cilt var ve çok daha fazla UV-duyarlı ^48-49 vardır.

Deri içine nüfuz etmesini kimyasal özelliklere sahip farmakolojik bileşikler, potansiyel olarak doğrudan deri epidermal melanositlerin cAMP seviyelerini işleyerek uzantısı (MC1R ^{e / e)} K14-Scf hayvan modeli olarak eumelanin neden olduğu gösterilmiştir. Bu modelde Melanin upregülasyonu r olmuşturadenilat siklaz aktive ¹ hem de fosfodiesteraz 4 inhibisyon ³⁵ tarafından görülen EPO kaynaklı. Bu yazıda, uzantısı (MC1R ^{e / e)} K14-Scf hayvanlar modeli tenli UV duyarlı insan olarak hazırlanması ve forskolın topikal uygulama göstermektedir. Bu ilacın günde iki kez uygulanması, hızlandırılmış melanization teşvik ettiği cilt koyulaşması melanin pigmentinin epidermal birikimi nedeniyle ve bu neden olduğu epidermal melanin "minimal eritem dozu" (MED) ⁴⁸ ölçümü ile UV uyarımlı güneş yanığı karşı koruduğunu göstermektedir.

1.. Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Fabrikası'nın bir Ham Kök Özü Topikal İdaresi Forskolin hazırlanması

1. Kemirgen deneyler için Protokoller hayvanların bakımı ve kullanımında etik davranış için yönergeleri takip ve Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (Protokol # 00768M2004) tarafından onaylanmıştır. Kök ekstresi% 70 etanol, standart bir dermatolojik bazında,% 30 propilen glikol içinde% 40 ağırlık / hacim olarak oluşur.
2. Ham forskolin kök ekstresi 200 g tartılır ve bir şişeye aktarın. % 40'lık 500 ml (w / v) solüsyonu, aracın tüm miktar (% 70 etanol,% 30 propilen glikol) en değil eklenerek ham forskolin kök ekstresi, 200 g yapmak ve tekrar süspansiyon için çözüm getirmek için, yaklaşık 450 ml.
3. Oda sıcaklığında bir saat boyunca karıştırılır. Çözelti, biraz yapışkan olacak ve daha önce çözelti haline "kaldırma" özüt için elle çalkalama gerektirebilirkarıştırma çubuğu devralması mümkün değildir.
4. Karıştırılarak bir saat sonra, dereceli bir silindir içine dökün ve (kaptan forskolin kurtarma üst düzeye çıkarmak için) bulamacı karışmaya için kullanılan beher "durulama" olarak kullanılmıştır araç kullanarak 500 ml hacim getirmek .
5. 50 ml polipropilen santrifüj tüplerine bulamacı aktarın. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak santrifüj (1500 xg, oda sıcaklığı, 15 dk). Bu noktada, çözünmeyen madde yüzer kolayca dökülerek izin vererek, oldukça yoğun olacaktır.
6. Ekstreden kalan çözünmez malzemenin çıkarılması için 0.22 um selüloz asetat zarından solüsyonu filtre. Bu kök ekstresi çözünmeyen bileşenlerden zarın erken tıkanmasını önlemek için ünite ile birlikte ön filtrelerin kullanımı ile birlikte, hücre kültürü için tasarlanmış bir şişe-top sistemi kullanırlar. Ekstrenin geniş hacimli yaparken, ön filtre bahis değiştirme, bir seferde yaklaşık olarak 100 ml filtreHer ekledi hacmi arasında bir aracıdır.
7. Oda sıcaklığında depolandığında, özüt kadar bir yıl için biyolojik faaliyeti tutar.

2. Topikal Tedaviler için C57BI / 6 K14-Scf Farelerin hazırlanması

1. Elektrik kesme ile hayvanlardan dorsal kürk çıkarın. Kısaca 0.25 mm cerrahi hazırlık kafa (Fisher Scientific) ile donatılmış elektrikli makas ile dorsal kürk kesme kolaylaştırmak için inhalasyon izofluran ile hayvanları uyutmak. Tercihen sadece anestezik doz aşımı riskini en aza indirmek için anestezi bir tür (örneğin, ketamin / ksilizin) kullanın. Doymuş teneffüs odası davlumbaz dışında kullanıldığında mesleki risk taşır ve hayvanlara anestezik bilinmeyen miktarda sunar. İdeal olarak hassas bir buharlaştırıcı kullanılmalıdır.
2. , Artık saç anız kaldırmak kimyasal bir dökücü olan hayvanları tedavi etmek. Ketamin 40 mg / kg ksilazin ve 4 mg / kg 'lik bir ip enjeksiyonu ile hayvana anesteziklere
3. Hayvanlar yeterince (ayak tutam tarafından değerlendirilecek gibi) anestezi sonra, eldivenli parmak kullanılarak makaslanmış dorsal deri tüy dökücü krem ​​parmak ucu büyüklüğünde uygulayın. 30-60 saniye için ya da etrafında taşınırken olarak kıllar açık krem ​​görülebileceği kadar, deri içine krem ​​sürün. Uzun süre maruz kalma epidermal bütünlüğü kaybı deri, epidermal arıza ve ölüm kimyasal yakma neden olarak sadece epilasyon için gereken zaman en az miktarda üzerinde krem ​​bırakın.
4. Tüm krem ​​kaldırıldı kadar tekrar tekrar su ile ıslatılmış gazlı bez ile dorsal cildinizi silin. Yumuşak kağıt havlu kullanarak ve onları sıcak bir tenha bir yerde (örn. temiz kafesler bir ısınma pad yerleştirilen) kurtarmak için izin kuru hayvanlar. Tek-tek hayvanların tüylerini ve işlem boyunca yakından izlemek.

3. Forskolin veya Araç Kontrol topikal uygulaması

1. Hayvanlar, her seferinde bir tedavi edilmelidir. Kısaca nefes ile uyutmakaltında bir form takılmış naylon hava geçirgen filtrenin üstüne fare koyarak d izofluran bir davlumbaz izofluran-doymuş kapaklı şeffaf cam kavanozda bir izofluran-doymuş kağıt havlu yerleştirilir olmuştur. Istemli kas hareketleri bastırmak için ama spontan solunumu (genellikle 10-20 sn) korumak için yeterli bir süre için izoflurana fareyi Açığa. Çok uzun izofluran olarak hayvan bırakmak solunum bastırılması ve ölüme neden olur. Bu "ışık olacak" ve uyuşturucu ve risk ölüme hayvan maruz aşırı fazla izofluran yerine kısaca fareyi yeniden ortaya çıkarmak için sahip tarafında err daha iyidir.
2. Izofluran odasından hayvan çıkarın ve temiz bir tezgah emici ped üzerine yerleştirin.
3. Bir tek polipropilen ucu ile donatılmış 1.000 ul mikropipet,% 40 ham forskolinle ekstresinin 400 ul çizmek kullanma (araç kontrol hayvanları% 70 etanol, tek başına% 30 propilen glikol alacaksınız).
4. Üzerine özü aktarınTüm cilt kapalı edildikten sonra tekrar pipet tarafını kullanarak, sonra derinin üzerine damlayan tarafından hayvan, dorsal cilt üzerinde özü smear. Uygulamadan sonra deri leke hiç gerek yoktur.
5. Kendi kafesine fare dönün, ve anestezi kurtarır kadar dikkatle gözlemlemek.
6. Non-pigment cAMP etkileri UV duyarlılık deneyleri yıkmak gerektiğini amacıyla, UV ışınlarına maruz kalma (pigment etkisi son topikal tedavi ötesinde birkaç gün sürer) 2 gün önce tüm topikal tedaviler durdurma.

4. Yansıtıcı Kolorimetre Göre Renk Ölçüm Cilt

1. Kısaca inhale izofluran (yukarıya bakınız) ile fare uyutmak.
2. Kolorimetresi ile sağlanan standart beyaz bir yüzeye taşınabilir başını koyarak bir Minolta renk ölçer kalibre.
3. Sağlanması hayvanın sırt deri ile kolorimetre floş portatif ölçüm kafasını yerleştirin bu 1 cm ² yuvarlak aperture tam olarak deri üzerine bastırılır. Dorsal deri farklı alanlarında, en az üç ayrı ölçüm al.
4. Hayvan başına ve tedavi grubu başına ortalama ± SD L * puanı hesaplayabilirsiniz. Yansıtıcı kolorimetre deneyde herhangi bir noktasında yapılabilir.

5. "Minimal eritem Doz" (MED) Hesaplama UV Hassasiyet Belirlenmesi

1. Araç ya da yukarıda tarif edildiği gibi ya da forskolin ile ön-muamele edilmiş hayvanlar kullanın. Ketamin ve ksilazin (yukarıya bakınız) standart bir karışımın peritoneal içi enjekte hayvanları anestezisi.
2. MED test için UV-tıkayıcı bir parça bant hazırlayın. , Bant delik oluşturmak bir 1 cm ² dairesel kesme ile ağır delgi (Şekil 2A ve B) kullanın. Bandın bir tanımlanmış boyut ve simetrik düzeneğinin delikleri sahip ışınlama sonrası cilt değişikliklerinin fark edilmesini kolaylaştırır. Bant her delik üzerinde, bir küçük ama kolayca sökülebilir parça geçerlidir UV farklı dozlarda uygulanmasını sağlamak için UV ışınlarına maruz kalma sırasında belirli zaman aralıkları ile kaldırılabilir bant.
3. Hayvanlar yeterince sedasyon sonra, dorsal yüzeyinde bant yer. Göz yağ zaman anestezi altında kullanılmalıdır.
4. İki Westinghouse F15T8UV-B, aşağıdakilerden oluşan UV kaynağı açın 313 nm'lik bir zirve çıkış ve 280-370 nm bir dizi lambalar. (Genellikle ısınmak için lambalar için birkaç dakika sürer) bir UVB sensörü ile UV fotometre ile ölçülen lambası sürekli UV çıkışına gelmesini sağlayın.
5. UV Fotometresi ile ölçülen UV aktarım oranına göre, arzu edilen her bir doz için UV ışınlarına maruz kalma süresini hesaplamak. Örneğin, lambanın UVB çıkışı önlemleri 2.4 mW / cm ^2. Bu yüzden, 5 kJ / m ² 'yönetmek için, cilt altındaki hesaplanan, UVB radyasyon (3 dakika ve 28 saniye olan) 208 saniye maruz kalması gerekir:
   upload/50670/50670eq1.jpg "/>
6. Hatta UV pozlama sağlamak için ventral yüzeyi aşağı sakinleşmiş hayvanları (yerinde tıkayıcı bant ile her biri) yerleştirin. UV radyasyon seçilmiş dozları uygulama için, ardışık olarak radyasyon doğru doz 1 cm'lik deri ² alanlarını açığa çıkarmak için küçük bir delik içeren tıkayıcı bantları çıkarın. 40 kJ / m ² deneyinde en yüksek dozu ise, Bu nedenle, yukarıdaki örneği kullanarak, daha sonra herhangi bir hayvan olurdu 40 kJ / m ² 'bir durumda 27 dakika ile 47 saniye toplam ve cilt için lamba altında olacaktır bantlamayın süre boyunca örten. Maruz kalan 208 saniye olduğu, ancak, 5 kJ / m ² durum üzerinde uzanan bant çıkarılır. Her koşul aynı anda biter böylece kaset çıkarma zamanlaması yapılmalıdır.
7. UV ışınlarına maruz kalan, ani ya da aşırı güçlü hareketleri ile cilde rip özen dikkatle dorsal cilt şeridi sıyırın. Izin vermek için bir sıcak, sakin bir yerde hayvanları yerleştirinanestezi kurtarma.
8. Eritem (kızarıklık) veya ödem gizli alanları aramak için 24-48 saat boyunca fareler Monitör (şişme) UV ışınlama özel doza maruz kalan anatomik sitelerine karşılık gelmektedir. Fotografik cilt bulguları belgelemek.
9. MED değer eritem ve / veya derinin bütün maruz çemberin ödem ile tanımlanan iltihabı neden UV en az doza karşılık gelir. Cilt pigmentasyon Ancak eritem ve ödem yine genel olarak doğru, kısmen, UV ışınlarına maruz kalma sırasında bant açıklıkların tanımlanan şekli sayesinde değerlendirilebilir, MED belirlenmesi meydan unutmayın.

6. İstatistiksel Analiz

Bonferroni sonrası testinde (Graph Pad PRISM). P değerleri <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmektedir ile tek yönlü ANOVA ile farelerin kohort arasındaki verileri analiz.

C57BL / 6 fareleri, tarif edildiği gibi (Şekil 1A) halinde K14-Scf transgen içeren, eumelanotic pheomelanotic veya amelanotik arka üzerinde elde edildi. Tenli uzatma kohortu (MC1R ^{e / e,} Tyr ^{+ / +)} fareler araç (% 70 etanol,% 30 propilen glikol) veya% 40 ham Coleus forskohlii kök ekstresi (80 uM başına ya da günde iki kez dozları ile topik olarak tedavi edilmiştir 5 gün (Şekil 2B) için) doz. Epidermal pigmentasyon topikal tedavilerin etkileri görsel muayene ile ve yansıtıcı kolorimetresi (Şekil 1 B) ile her ikisi de tespit edilmiştir. Kök ekstresi uygulanması K14-Scf transgenik arka ancak genetik olarak uyumlu olmayan transgenik hayvanlarda sağlam epidermal kararması ile ilişkilendirilmiştir. Biz farmakolojik kaynaklı melanin epidemiyolojik yatırılacak için interfolliküler epidermal melanosit için mevcut olması gerektiğini belirtmek için bu sonuçları yorumlamakrmis. Kök ekstresi derin için forskolin yanı sıra bitki fitokimyasallar varlığı renkli rağmen olmayan transgenik hayvanlar, kök ekstresi (Şekil 1 B) ile koyulaştırarak cilt sergilemek için başarısız olarak, cilt koyulaşması nedeniyle ilaçtan bir boyama etkisi sadece olamaz. Günde iki kez bir şekilde uygulandığında, maksimal karanlık birkaç gün daha fazla (Şekil 1C) sonra gerçekleştirilir, ancak topikal olarak uygulanan forskolin melanizing etkileri, en az 2 gün kaydedilmiştir. İlacın (Şekil 1D) farklı konsantrasyonları ile işleme tabi sırt derisi bölme Fontana-Masson melanin lekelemesi ile gösterildiği gibi, melanizasyon derecesi, doza bağlıdır.

(Şekil 2 A ve B), yukarıda belirtildiği gibi Daha sonra, UV duyarlılığı üzerine topikal olarak uygulanan forskolin uzatma etkisi, farelerde test MED (MC1R ^{e / e,} Tyr ^{+ / +)} ile belirlenmiştir. MED belirlenmesi ani arasında karşılaştırıldı(15 gün, 15 toplam dozları günde bir kez uygulama), bir standart yaklaşıma karşı (5 gün, toplam 10 doz için günde iki kez uygulama), hızlandırılmış bir ilaç tedavisi ile tedavi mals. Non-transjenik farenin olmayan melanin ilaç etkileri kontrol etmek için dahil edilmiştir. Her iki tedavi forskolin ile tedavi edilen K14-Scf hayvanlarda koyulaşma deri benzer miktarları ile sonuçlanmıştır. Özellikle forskolinle maruz kalan hayvanlar için L * (yansıtıcı Kolorimetri beyaz-siyah ölçek) değerleri 31.9 ± 1.8 ve standart uygulama vs hızlandırılmış uygulama için 31.1 ± 1.6, sırasıyla. Her iki tedavi grubunda forskolin maruz belirgin bir toksik etkileri vardı, bu yüzden, bunu daha önce kullanıldığı haliyle, hızlandırılmış bir uygulama forskolin (10 total doz, doz başına 80 uM için günde iki kez) kadar etkili dorsal deri güvenli melanization teşvik sonucuna (15 total doz günde bir kez, doz başına 80 uM).

Forskolin ile uyarılan epidermal melanizm sonuçlandıMED (Şekil 2C-D) tarafından değerlendirilecek derin UV koruması. Bu nedenle, oysa MED araç ile 5 gün boyunca iki kez tedavi K14-Scf uzatma fareler için 0.0 kJ / m ² ± 5,0 idi, topikal forskolin ile muamele grupları için ortalama MED> 30.0 ± 0.0 kJ / m ² (Şekil 2 A ve C). Aslında, 30.0 kJ / m ² 'lık bir doz, bu deneyde eritem oluşturmak için yetersizdi. (15 total doz, doz başına 80 uM için günde bir kez) standart bir dozaj forskolin kullanarak, forskolin ile muamele K14-Scf uzatma fareler için ortalama bir değer MED kJ / m ² (Şekil 2 B, D) 50.0 ± 7.1 olduğu bulunmuştur. Önemli olarak, forskolin ön-muamele için K14-Scf aracılı epidermal melanositlerin (Şekiller 2C, D) eksikliği nedeniyle ya da tirozinaz eksikliği (Şekil 2E) birini, melanizasyon aciz hayvanların MED etkilemedi. Forskolin uygulamalar dis olduklarından2 gün önce UV ışınlarına maruz kalma devam etti ve UV ışınlarına maruz kalan devam edildi, biz olmayan pigment cAMP etkileri MED sonuçlarında bir rolü yoktu sonucuna varıldı. Bunun yerine, veri epidermal melanizm, bu modelde hangi forskolin kaynaklı UV koruması tarafından mekanizma olduğunu öne sürmektedir.

Şekil 1. Forskolin topikal tedavi tenli uzantısı (MC1R ^{e / e)} farenin cilt koyulaşması teşvik etmektedir., Bu çalışmada kullanılan C57BL / 6 hayvan (A) fotoğrafları. Hayvanlar Genetik olarak melanokortin reseptörü 1 (MC1R) ve tirozinaz (Tyr) loci hariç eşleştirilir. Ile olduğu gibi MC1R, arızalı olduğunda MC1R (blondish) fonksiyonel ama pheomelanotic olduğunda pigmentasyon (siyah) eumelanotic olduğunu unutmayınuzantısı (MC1R ^{e / e)} mutant. Epidermal pigmentasyon K14-Scf transgen ile deride interfolliküler epidermal melanositlerin tutma bağlıdır ve kolayca kulak görülebilir. Uzantısının (B) Fotoğraflar (MC1R ^{e / e)} K14-Scf olmayan transgenik hayvanlar ile muamele araç kontrolü (% 70 etanol% 30 propil glikol) veya% 40 a / h (80 uM) forskolin 400 ul, 5 gün boyunca traş dorsal cilde günde iki kez uygulanan 10 uygulamalar toplam. Yansıtıcı kolorimetri ile deri renk ölçümleri, her bir grup için yapıldı. Yansıtıcı Kolorimetri sonuçları L * (siyah-beyaz) renkli eksen üzerine ortalama (± SD) reflektometre birimleri olarak raporlanır. Forskolin topikal uygulama değil, transjenik olmayan farelerde K14-Scf transgenik hayvanlarda koyulaşma sağlam deri neden olduğunu not edin. K14-SCF'nin forskolin ile muamele edilmiş kulak koyulaşma arası (C) Zaman deneyibelirtilen zamanlar için uzatma farenin (forskolin ile muamele edilmiş kulaklar mavi üçgenlerle belirtilmiştir). Araç karşılaştırma için sağ kulağa uygulanmıştır. (D) 'de anlatıldığı gibi forskolin belirtilen dozları ile tedavi edilmiş hayvanlardan alınan Fontana-Masson lekeli deri kesitleri. büyük rakam görüntülemek için .

Şekil 2. Eritematöz minimal dozu (MED) test ile belirlendiği gibi Forskolin ile uyarılan melanizm UV aracılı iltihap karşı korur. 5 gün (A, C) ya da günde bir kez ya da forskolin araç ya da 15 gün (B, D, E) boyunca günde iki kez tedavi edilen hayvanların UV tıkayıcı bant ve UVB doz (A, B) konumu. Th e son topikal tedavi ışınlama önce 48 saat uygulandı. Dorsal cilt ^2, dairesel delikler açılmış Çıkış 1 cm UV-tıkayıcı bant kullanarak ve uygun bir doz elde etmek için maruz kalma süreleri değiştirilerek UVB çeşitli dozlarda maruz bırakılmıştır. Radyasyondan sonra maruz kalan deri halkaları, bazı deneylerde, bir kalem ile işaretlenmiştir. MED en, eritem ve / veya belirli bir doza maruz kalan deri, tüm çemberin ödem ile tanımlanan, 48 saat maruz kaldıktan sonra belirlenmiştir. SD sonuçlar ± MED kJ / m ² UVB olarak rapor edilir, * p ≤ 0,001. (E) Ten rengi reflektometri ve araç ya da forskolin ile 10 gün boyunca tedavi tirosin-eksikli K14-Scf uzatma albino fareler için MED değerleri. için tıklayın büyük rakam görmek .

70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Deneyin genel şema. Uzantısı kohortu (MC1R ^{e / e)} K14-Scf ya da olmayan transgenik hayvanlar, elektrikli kesme ve / veya kimyasal depilasyon ile dorsal kürk kaldırılarak hazırlandı. Hayvanlar daha sonra belirtilen dozlama programları ile araç (% 70 etanol,% 30 propilen glikol) ya da topik uygulama ile ya da% 40 ham forskolin özü ile tedavi edildi. Deri pigmentasyonu üzerine etkileri kalorımetrık ve Fontana-Masson melanin boyama ile, fotografik belgelenmiştir. UV duyarlılığı minimal eritem dozu (MED) testi ile belirlenmiştir.

Tenli insan bir hayvan modeli kullanarak, bir forskolinle zengin ham kök ekstresinin topikal uygulama sağlam deride melanin üretimini uyararak epidermis kararıyor bulabilirsiniz. Epidermal melanizm insan derisinde meydana geldiği gibi, bazal epidermis içinde kök hücre faktörü ifade bağlıdır, ancak genetik olarak modifiye edilmemiş bir fare deri. Genetik olarak modifiye edilmemiş farelerin sırt derisi cilde pigment vermek için interfolliküler melanosit yeterli sayıda yoksundur. Ancak bu tür kök hücre faktörü (kit ligandı) veya hepatosit büyüme faktörü (HGF) gibi bir büyüme faktörü melanosit yapısal ifade ayarında melanosit hayvanın ^50-51 ömrü boyunca, epidermisin bazal tabakasında muhafaza edilebilir. Tenli insan Bizim hayvan modeli C57BL / 6, kemirgen hattının dahili pigment varyantı içine K14-Scf transgenin dahil dayanmaktadır. Her yaştan hayvan olabilir, ancakkullanılan, bizim deneyler genellikle genç yetişkin (yaş 4-12 hafta) fareler içerir. Çünkü cAMP sinyal kaybına neden olan bir tepe bölümü kesik melanokortin reseptörü 1 (MC1R) nedeniyle, uzatma farenin yerine ^52-54 eumelanin göre (K14-Scf ya da HGF-Met transgenik devletlerde) kat ve deride tercihen feomelanin ifade eder. Değiştirilmiş melanin ekspresyonunun bir sonucu olarak, K14-Scf uzatma farenin çok fazla UV-duyarlı nedeniyle epidermal eumelanin pigment ¹ bol çökeltilmesinden jet siyah bir cilde sahip kendi MC1R-vahşi tip muadilleri, daha vardır. Biz eumelanin üretim beri büyük ölçüde MC1R sinyalini taklit farmakolojik uyarıcılar eumelanin üretimini kurtarmak olabilir, bir mutant MC1R bir ortamda azaldığını gerekçeli. MC1R bir G _{s-bağlanmış} transmembran reseptör olduğundan, yüksek afiniteli bir ligandın bağlanması üzerine α-melanosit hormon (α-MSH), Melano için pro-farklılaşma sinyallerini ileten uyarıcıikinci haberci cAMP'nin adenilat siklaz aktivasyonuna ve üretim ile Eritrosit sitoplazma. Böylece, forskolin topikal bir şekilde uygulanması, adenilil siklaz güçlü bir doğrudan bir aktivatörü olan bir hücre-geçirgen diterpenoid, MC1R arızalı, pheomelanotic halde eumelanin üretimini teşvik etmek mümkün olabilir varsayıldı.

Bu çalışmalar için, saflaştırılmış forskolin kullanarak, ancak maliyet engelleyici olduğunu kanıtladı. K14-Scf uzantı modeli epidermal karartma için gerekli forskolin minimum miktarının belirlenmesi erken deneyler, en fazla% 20 oranında ihtiva karanlık ham ekstraktı (ağırlığa ağırlık) forskolin ile hacim çözeltisi başına% 40 ağırlık kullanımı ile meydana geldiğini göstermiştir. Biz,% 8 son forskolin 400 ul bu uygulama hesaplamak (ağırlık bölü hacim,% 40 x 20%) çözeltisi dorsal deri her uygulama için yaklaşık 80 uM forskolin teslim neden olacaktır. Tabii ki, dozun daha, cilt tarafından emilir değildir yerine kürk çevreleyen veya uygulama sırasında hayvanın düşme tarafından batırılmış. Böylece hayvanlar, ilacın her bir uygulama ile alma tesisinin gerçekleştirilen doz rapor zordur. Bununla birlikte, bu şekilde uygulandığında, eumelanin deri ve üretiminde pigment enzimlerin güçlü indüklenmesinde forskolin ile sonuçlanır. Aslında, K14-Scf transgenik hayvanlar uzantısı, ikinci uygulama (Şekil 1C) sonra cilt koyulaşması açık gösterdi.

Daha önce ilaç ^1,48-49 günlük uygulama ile kararan cilt yayınlanmış olmasına rağmen, biz burada farmakolojik kaynaklı melanizm verilmesi ile optimize edilebilir düşündüren, günde iki kez uygulama sağlam epidermal koyulaşma ve önemli UV koruma ile ilişkili olduğunu göstermektedir daha sık bir kez günde bir ilaç. Epidermiste eumelanin indüksiyon nedeniyle cilt koyulaşması, gibi sürerTopikal forskolin tedavileri devam etmektedir sürece. (Üç ay) aracılığıyla hatta kronik uygulama fareler ⁴⁹ tarafından iyi tolere gibiydi. Deri koyulaşmasına artış melanin sentezi yerine epidermis. ⁴⁹ melanosit yayılması kaynaklanmaktadır. Topikal tedaviler durdurulan bir kez epidermal melanin, normal keratinosit yenilenmesi ile kayıp olduğu gibi, cildin yavaş yavaş temel tenli (2-3 haftadan fazla) geri kaybolur. Cilt koyulaşması çok kolay bir ten rengi yansıtma kolorimetresi kullanılarak ^55-56 objektif olarak belirlenebilir, farelerin basit bir görsel muayene ile belirlenebilir. Bu yöntem, cilt rengini ölçmek için bir non-invaziv, hızlı ve ağrısız bir yöntemdir. Renk doğru L * a * b * (LAB) renk uzayı modeli ^57-58 kullanarak tarif olabilir.

Bu deneyler için biz Coleus forskolii bitki, forskolin doğal kaynağında bir kaba kök ekstresi dayanıyordu. Bu preparat,çünkü arıtıldı forskolin bu deneyler yüksek maliyetli kullanılmıştır. Bu deney, örneğin, beş gün boyunca altı hayvanlara, günde iki kez uygulama için forskolin toplam yaklaşık 2 g gerekmektedir. Piyasada bulunan HPLC-saflaştırılmış forskolın 2 g ham ekstresi için en az 5 $ ile karşılaştırıldığında, fazla 20.000 $ mal olacak. Saflaştırılmış forskolin bizim hayvan modelinde ¹ epidermal melanin kaynaklı olsa da, biz alkaloidler, fenoller ve tanenler de dahil olmak üzere ham kök ekstresi diğer bitki kaynaklı bileşiklerin olası etkilerini ekarte edemez. Aslında, kobay veya insan derisi eksplantlarındaki önce iş ham kök ekstresi bileşikler forskolın ⁵⁹ cilt emilimini teşvik düşündürmektedir. Henüz olarak, ancak, kimlik ve bu bileşiklerin mekanizması bilinmemektedir. Böylece, ham kök ekstresi doğal olarak bulunan diğer bileşiklerin etkilerini değiştirerek ekarte edemez.

Bileşik forskolin karışımıdır;topik uygulama için kolayca deriye uygulandığında çekici baharat gibi bir aroma ile koyu kahverengi sıvı. Çözünmeyen maddeler kaldırılmış olduğundan, günlük uygulama bir kez cilt tarafından emilir hiçbir kabuklanma ya da mevduat bırakır. Bu şekilde hazırlanan zaman ham kök ekstresi, koyu kahverengi olmasına rağmen aslında gösterildiği gibi, ilacın neden olduğu cilt koyulaşması, sadece bir boya etkisi olmadığını deri melanizasyon aciz hayvanlar üzerinde bileşiğinin (örneğin MC1R ^{e / e} tirozinaz topikal uygulama epidermal melanositlerin eksikliği eksikliği albino hayvan ya da transjenik olmayan fare) (Şekil 1B ve 2E) koyulaşması cilt üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Biz kanıt-of-concept gösterilerde deride cAMP manipülasyon UV koruyucu koyu cilt pigmentasyonu neden olabilir gibi bu deneyler görüntüleyebilirsiniz. Bununla birlikte, forskolin topikal uygulama için, ilacın spesifik olmayan doğası uygun bir ya da pratik bir tedavi seçeneğidir olası değildir. Benndiscriminate ve adenilil siklaz ile cAMP indüksiyon hedefli olmayan aktivasyon kabul edilemez toksisiteye neden olması beklenebilir. Önemli olarak, diğerleri deri cAMP indüksiyonu ve melanizm ³⁵ hedef alternatif farmakolojik elde edilebilir olduğunu kanıtlayan, K14-Scf uzatma hayvan modelinde melanin up-regüle potansiyel olarak, bir fosfodiesteraz 4 inhibitörünün (Rolipram) bu topikal olarak uygulanmasını da göstermiştir. Deride cAMP seviyelerinin lokal manipülasyon beşeri tercüme edilebilir önce Açıkçası, emniyet dikkatli bir şekilde değerlendirilmelidir gerekecektir. Bununla birlikte, verilerimiz güçlü bir minimal eritem dozu (MED) test ile belirlendiği gibi farmakolojik-kaynaklı melanizm UV-koruyucu olduğunu göstermektedir.

Özet olarak, forskolin, bir adenilat siklaz aktivatörü topikal uygulama, kusurlu cAMP aşağı sinyal göre açık tenli insan bir murin modelinde epidermisi güçlü bir melanizasyon sonuçlandıKusurlu bir melanokortin reseptörü 1 (MC1R) akımı. Eritematöz minimal dozu (MED) testi ile ölçülen epidermal melanizm, UV-koruyucu oldu. Biz varsayımında bu farmakolojik cAMP manipülasyon yanı sıra kurtarma epidermis UV koruyucu eumelanization, ancak diğer MC1R bağımlı UV koruyucu tepkiler değil sadece olabilir.

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Yazarlar, teknik yardım için Malinda SPRY teşekkür etmek istiyorum. Biz de mevcut ve geçmiş finansman kaynaklarını kabul: Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will Vaka Kanser Araştırma Fonu, Markey Kanseri Vakfı, Çocuk Miracle Ağ ve Jennifer ve David Dickens Melanom Araştırma Vakfı.