אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס

המלנין עוריות הוא מושרה על ידי יישום מקומי של forskolin במודל עכברי של אדם UV רגיש בהיר עור. מניפולציה תרופתי של רמות cAMP בעור ואפידרמיס המחשיכים מאוד להגן מפני דלקות בתיווך UV (כוויות שמש), כפי שנמדד על ידי מינון erythematous מינימום assay (MED).

הגינות של עור, רגישות UV וסיכון לסרטן העור בכל לתאם עם הפונקציה הפיזיולוגית של הקולטן melanocortin 1, חלבון איתות _יחד-S G נמצא על פני השטח של מלנוציטים. MC1R מגרה cyclase adenylyl וייצור cAMP אשר, בתורו, מעלה מווסת את ייצור melanocytic של מלנין בעור. על מנת ללמוד את המנגנונים שבאמצעותם איתות MC1R מגנה על העור מפני פגיעת UV, מחקר זה מסתמך על מודל של עכברים עם "עור אנושי", המבוסס על ביטוי אפידרמיס של גורם בתאי גזע (SCF). עכברים הטרנסגניים K14-SCF לשמור מלנוציטים ב יש לי האפידרמיס ולכן היכולת להפקיד המלנין באפידרמיס. במודל חיה זו, תוצאות מצב MC1R סוג בר בתצהיר חזק של פיגמנט אומלנין השחור ופנוטיפ מוגן UV. לעומת זאת, בעלי החיים K14-SCF עם תערוכה פגומה MC1R איתות יכולת פיגמנטציה אדומה / בלונדינית, אומלנין מעט מאוד בעור ופנוטיפ UV-רגיש. הנמקה כי בתצהיר אומלנין עלול להיות מוגבר על ידי סוכנים מקומיים המחקים איתות MC1R, מצאנו כי יישום ישיר של תמצית forskolin לעור של עכברים בהירי עור MC1R פגומים גרם לאינדוקצית אומלנין החזקה והגנת UV ^1. כאן אנו מתארים את השיטה להכנה ויישום תמצית שורש טבעית המכיל forskolin לעכברים בהירי עור K14-SCF ומדווח על שיטה למדידת רגישות UV על ידי קביעת מינון erythematous מינימאלי (MED). שימוש במודל זה חי, זה אפשרי ללמוד איך האינדוקציה cAMP אפידרמיס וmelanization של העור משפיעים על תגובות פיזיולוגיות לחשיפה לקרינת UV.

השכיחות של מלנומה, הצורה הקטלנית ביותר של סרטן העור, גדלה באופן דרמטי בעשורים האחרונים בארצות הברית, במיוחד בקרב אנשים בהירי עור. ראיות מולקולריות ואפידמיולוגיים חזקות מפלילות קרינת UV כגורם סביבתי עיקרי סיבתי ^2-5. חשיפת UV מוגברת בצורה של חשיפה לשמש ושימוש במיטת השיזוף עשויה להיות אחראי לחלק גדול מעלייה בשכיחות מלנומה ^6-7. הסיכון למלנומה נראית קשור במיוחד עם כוויות שמש ^8, במיוחד אלה בשלב מוקדם בחיי ^9-10. סיכון לכוויות השמש קשורה לא רק למינון ועוצמה של חשיפה לקרינת UV, אלא גם על ידי גורמים תורשתיים המשפיעים על תגובה עורית לקרינת UV. פיגמנטציה של עור היא אחד הגורמים החשובים ביותר של רגישות UV, סיכון לכוויות שמש וסיכון לסרטן. מלנומה מתרחש בערך עשרים פעמים בתדירות גבוהה יותר באנשים בהירים עור בהשוואה לindividua כהה עורls ^11-13.

המלנין, הפיגמנט המיוצר על ידי מלנוציטים באפידרמיס, הוא הקובע העיקרי של גוון עור. המלנין מגיע בשני סוגים עיקריים: (1) אומלנין, פיגמנט חום / שחור כהה יעיל בספיגת האנרגיה של קרינת UV, ו (2) pheomelanin, אדמדם / פיגמנט בלונדינית פחות יעיל במניעת חדירה של פוטונים UV אל העור. צבע עור, רגישות UV והסיכון למלנומה נקבעים בעיקר על ידי תוכן אומלנין אפידרמיס ^14-15. יותר אומלנין באפידרמיס, הפוטונים UV פחות יכול לחדור לתוך העור. בגלל הרמות נמוכות של אומלנין מולדים, אנשים בהירי עור הם הרבה יותר פגיע להשפעות אקוטיות וכרוניות של קרינת UV ^16-18.

פיגמנטציה של עור, סיכון למלנומה והיכולת "שיזוף" לאחר חשיפה לקרינת UV כל לתאם עם יכולת האיתות של הקולטן melanocortin 1 (MC1R), הטרנסממברני של _{מצמידים-S} G שבעקולט urface על המלנוציטים ^19-22. כאשר MC1R נקשר ליגנד מאותו המקור גבוהה זיקה, הורמון מגרה α-מלנוציט (α-MSH), יש הפעלה של cyclase adenylyl וייצור של cAMP השליח השני ^23. התגובה הפיזיולוגית הנורמלית של העור לאחר חשיפה לקרינת UV כוללת ייצור אפידרמיס של α-MSH ידי קרטינוציטים ^24-29. אנו ואחרים משערים כי מקורם בkeratinocyte α-MSH נקשר MC1R במלנוציטים באפידרמיס, ייזום ייצור במורד הזרם של השליח השני המחנה דרך הפעלה של cyclase adenylyl ^30. רמות cAMP לשלוט בהיבטים רבים של בידול מלנוציט, כוללים מסלולי הישרדות, תיקון DNA וסינתזת הפיגמנט. איתות MC1R וcAMP בבירור לגרום לרמות אנזים פיגמנט וייצור אומלנין. כאשר איתות MC1R היא שלמה ורמות cAMP melanocytic הם חזקות, אומלנין מופק והעור מתכהה. עם זאת, אם איתות MC1R היא פגומה ורמות cAMP cytoplasmic יישארו נמוכות, pheomelanin מיוצר במקום ^1. סינתזת eumelanin יכולה להיות מגורה פרמקולוגית על ידי סוכנים שמעלים את רמות cAMP ^1,14,31-35.

מאז חלבון MC1R הוא וסת עיקרי לסיכון למלנומה בבני אדם ^36-46, אנו מעוניינים במנגנונים שבאמצעותם MC1R מגן מלנוציטים נגד היווצרות הסרטן ע"י-UV. כבסיס למחקרים שלנו, אנחנו שנוצרנו מודל עכברי MC1R-גרסה מהונדס על רקע ¹ טהור C57BL / 6 גנטי. במודל זה, נובע גורם תא (SCF) בא לידי ביטוי constitutively באפידרמיס הבסיסי ומלנוציטים interfollicular אפידרמיס נשמרים בעור לאורך כל חיים ^47, בניגוד לעכברים שאינם מהונדסים שבו מלנוציטים בתרגום לדרמיס בזקיקי שיער. עם transgene K14-SCF משולב, האפידרמיס הופך פיגמנט עם מאפיין פיגמנטים המלנין המסוים של פיגמנטזן של בעלי החיים ^1. עכברי K14-SCF על הרקע הגנטי C57BL / 6 עם איתות MC1R סוג בר שהעור שחור משחור מתאפיינים ברמות גבוהות מאוד של הפיגמנט אומלנין. באופן לא מפתיע, בעלי החיים אלה הם מאוד UV עמיד. לעומת זאת, יש לי C57BL / 6 בעלי החיים K14-SCF התאמה גנטית כי נמל MC1R פעיל מוטציה כמעט שלא אומלנין באפידרמיס. במקום זאת, יש בעלי החיים אלה "הסיומת" ^(ה MC1R ^{/ ה)} גוון עור בהיר הנגרם על ידי בתצהיר של פיגמנט pheomelanin (איור 1 א) והם הרבה יותר רגיש לקרינה UV ^48-49.

תרכובות תרופתיות עם תכונות כימיות שמאפשרות חדירה לתוך העור הוכחו לגרום potently אומלנין בהארכה ^(ה MC1R ^{/ ה)} מודל החיה K14-SCF ישירות על ידי המניפולציה רמות cAMP במלנוציטים באפידרמיס בעור. גברת ביטוי מלנין במודל זה כבר reported ידי הפעלת cyclase adenylyl ^1, כמו גם phosphodiesterase 4 עיכוב ^35. במאמר זה, אנחנו מדגימים את ההכנה והיישום מקומי של forskolin בהארכה ^(ה MC1R ^{/ ה)} בעלי החיים K14-SCF איזה דגם האנושי UV רגיש בהירת עור. אנו מראים כי יישום פעמיים ביום של התרופה מקדם melanization המואץ, שמחשיך העור בשל תצהיר אפידרמיס של פיגמנט המלנין, וכי מלנין אפידרמיס המושרה מגן מפני כוויות שמש נגרם UV באמצעות מדידה של "מינון המינימלי erythematous" (MED) ^48.

1. הכנת Forskolin למקומי מנהל מתמצית שורש גולמי של צמח Plectranthus barbatus (forskohlii Cohleus)

1. פרוטוקולים לניסויים עכבריים בעקבות ההנחיות להתנהגות אתית בטיפול ושימוש בבעלי החיים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קנטאקי (פרוטוקול # 00768M2004). תמצית השורש מורכבת ב40% במשקל / נפח בבסיס סטנדרטי דרמטולוגיים של 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול.
2. שוקל 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי ולהעביר אותו לכוס. כדי להפוך 500 מיליליטר של 40% (w / v) פתרון, resuspend 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי על ידי הוספה ביותר, אבל לא כל הנפח של הרכב (70% אתנול, פרופילן גליקול 30%) ולהביא הפתרון ל בערך 450 מיליליטר.
3. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת חדר. הפתרון יהיה צמיג במידה מסוימת והן עשוי לחייב תסיסה ידנית כדי "להרים" את התמצית לפתרון לפניבר והמערבב הוא מסוגל להשתלט.
4. , אחרי שעה של ערבוב יוצק את התערובת לתוך גליל סיים ולהביא את הנפח 500 מיליליטר שימוש ברכב שבו נעשה שימוש כדי "לשטוף את" הכוס ששימשה לעורר את התרחיף (על מנת למקסם את ההתאוששות של forskolin מהכוס) .
5. העבר את התרחיף ל50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר פוליפרופילן. צנטריפוגה (1,500 XG, טמפרטורת חדר, 15 דקות) באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה. בשלב זה, את החומר מסיס יהיה די דחוס, המאפשר את supernatant למזוג לכוס בקלות.
6. סנן את הפתרון דרך קרום אצטט תאית 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל חומר מסיס שיורי מהתמצית. אנו משתמשים במערכת בקבוק העליונה המיועדת לתרבית תאים, יחד עם השימוש בטרום מסננים שמגיעים עם היחידה למניעת סתימה מוקדמת של הקרום ממרכיבים מסיסים של תמצית השורש. בעת ביצוע כמויות גדולות של התמצית, לסנן בערך 100 מיליליטר בכל פעם, שינוי ההימור לסנן מראשWeen כל כרך הוסיף.
7. כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת חדר, התמצית שומרת את פעילות ביולוגית לעד שנה.

2. הכנת C57Bl / 6 העכברים K14-SCF לטיפולים מקומיים

1. הסרת פרווה גב מבעלי החיים על ידי גז חשמלי. בקצרה להרדים את החיות עם isoflurane שהאיפה להקל על מריחה של פרווה הגבי עם מזמרה חשמלית לבוש עם ראש 0.25 מ"מ כירורגית הכנה (פישר סיינטיפיק). רצוי להשתמש רק בסוג אחד של הרדמה (למשל קטמין / xylazine) כדי למזער את הסיכון של מנת יתר של חומר הרדמה. קאמרי משאיפת רוויה נושא בעיסוק סיכון בעת ​​שימוש מחוץ למכסה המנוע קטר ומספק כמויות לא ידועות של חומר הרדמה לבעלי חיים. באופן אידיאלי יש להשתמש במכשיר אדי דיוק.
2. כדי להסיר שיער זיפי שייר, טיפול בבעלי החיים עם מקריח כימי. לנהל הרדמה לבעלי החיים עם הזרקת ה-IP של קטמין 40 מ"ג / קילוגרם ו xylazine 4 מ"ג / קילוגרם
3. ברגע שחיות מורדמים כראוי (כפי שנשפט על ידי קמצוץ הבוהן), להחיל כמות אצבע בגודל של קרם מקריח לעור גב טעון באמצעות אצבע עטויה בכפפה. למרוח את הקרם לתוך העור ל30-60 שניות או עד שניתן לראות בבירור שערות בקרם בזמן שהוא עבר בסביבה. השאר את הקרם על רק לכמות המינימלית של זמן הדרוש להסרת שיער כמו חשיפה ממושכת גורמת לצריבה כימית של העור, התמוטטות אפידרמיס ומוות מאובדן השלמות באפידרמיס.
4. נגב את עור הגב עם פדה גזה ספוגה במים שוב ושוב עד שכל השמנת הוסרה. חיות יבשים באמצעות מגבות נייר רכות, ולאפשר להם להתאושש במיקום מבודד חם (למשל כלובים נקיים הונחו על כרית חימום). להשיר שער חיות אחד על אחד ולעקוב מקרוב לאורך כל ההליך.

3. מנהל אקטואלי של Forskolin או רכב בקרה

1. יש להתייחס לבעלי חיים אחד בכל פעם. בקצרה להרדים עם שאיפהisoflurane ד על ידי הצבת העכבר על החלק העליון של מסנן אוויר חדיר ניילון מצויד טופס לפיו הושם מגבת נייר רווי isoflurane בצנצנת רווי isoflurane עפעפיים ברורה זכוכית במנדף. לחשוף את העכבר כדי isoflurane למספיק זמן כדי לדכא את תנועות שרירים מרצון, אבל כדי לשמור על נשימה ספונטנית (בדרך כלל 10-20 שניות). השארת בעלי החיים בisoflurane ארוכה מדי תגרום לדיכוי ומוות בדרכי הנשימה. עדיף לטעות בצד של "הולך אור" ויש להם מחדש לחשוף את העכבר לזמן קצר ליותר isoflurane ולא אל מעל לחשוף את בעלי החיים למוות הסמים וסיכון.
2. הסר את החיה מבית הבליעה isoflurane ומניח על משטח ספסל סופג נקי.
3. באמצעות micropipette 1,000 μl לבוש עם טיפ פוליפרופילן חד פעמי, להכין 400 μl 40% תמצית forskolin הגולמי (בעלי חיים שליטה ברכב יקבלו 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול לבד).
4. העבר את התמצית עלאחורי של בעלי החיים על ידי מטפטף אותו על העור ולאחר מכן, תוך שימוש בצד של קצה פיפטה, מורח את התמצית על עור הגב עד שכל העור כבר מכוסה. אין צורך למחוק את העור לאחר יישום.
5. להחזיר את העכבר לכלוב שלה, ולבחון בזהירות עד שהוא מתאושש מהרדמה.
6. על מנת שתופעות cAMP אינו פיגמנט לא צריכה לבלבל את ניסויי רגישות UV, להפסיק את כל הטיפולים אקטואליים 2 ימים לפני חשיפה לקרינת UV (אפקט הפיגמנט נמשך כמה ימים מעבר לטיפול מקומי שעבר).

4. צבע עור מדידה על ידי רפלקטיבית colorimetry

1. בקצרה להרדים את העכבר עם isoflurane בשאיפה (ראה לעיל).
2. לכייל קולורימטר Minolta ידי הנחת הראש הנייד על המשטח הלבן האחידים מסופק עם קולורימטר.
3. הנח את ראש המדידה הנייד של סומק קולורימטר עם עור הגב של בעלי החיים על מנת להבטיח כי apertur העגול 1 סנטימטר ²דואר נלחץ לחלוטין על גבי העור. קח לפחות שלוש מדידות נפרדות באזורים שונים של עור גב.
4. חישוב ציון * L ממוצע ± SD לכל בעלי חיים וכל קבוצת טיפול. colorimetry רפלקטיבית יכולה להיעשות בכל נקודה בניסוי.

5. קביעת UV הרגישות על ידי חישוב של "מינימל erythematous המנה" (MED)

1. להשתמש בבעלי חיים, כי כבר מראש שטופלו גם עם רכב או forskolin כפי שתואר לעיל. הרדימי חיות עם זריקת intraperitoneal של תערובת סטנדרטית של קטמין ו xylazine (ראה לעיל).
2. הכן את נייר דבק UV-אוטם לבדיקת MED. כדי ליצור חורים בקלטת, להשתמש בניקוב חורים כבד עם 1 סנטימטר ² מעגלי מגזרת (2A דמויות ו-B). יש חורים בגודל מוגדר וסידור סימטרי בקלטת מאפשר זיהוי של שינויים בעור לאחר הקרנה. על כל חור בקלטת, להחיל חתיכה קטנה אבל בקלות להסרה מקלטת שניתן להסיר בזמנים מוגדרים במהלך חשיפה לקרינת UV כדי לאפשר לממשל של מינוני UV שונים.
3. ברגע שבעלי חיים הם מסוממים כראוי, הניחו את הקלטת על פני השטח הגבי. חומר הסיכה העין תמיד צריכה להיות מנוצל בהרדמה.
4. הפעל את מקור UV המורכב משני Westinghouse F15T8UV-B מנורות עם תפוקת שיא של 313 ננומטר ומגוון של 280-370 ננומטר. לאפשר את המנורה לאזן לפלט UV קבוע כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV עם חיישן UVB (בדרך כלל לוקח כמה דקות למנורות להתחמם).
5. בהתבסס על קצב שידור UV כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV, לחשב UV זמן חשיפה לכל מינון רצוי. לדוגמא, אמצעי פלט UVB של מנורתנו 2.4 mW / ² סנטימטר. לכן, כדי לנהל 5 kJ / מ ^2, העור היה צריך להיות חשוף ל208 שניות (שהוא 3 דקות ושניות 28) של קרינת UVB, כפי שמחושב שלהלן:
   upload/50670/50670eq1.jpg "/>
6. הנח חיות המסוממות (כל אחד עם קלטת אוטמת במקום) הגחון פני השטח למטה כדי להבטיח חשיפה אפילו UV. כדי לנהל את המנות הנבחרות של קרינת UV, ברצף להסיר את הקלטות אוטמות קטנות המכסות את החורים לחשוף סנטימטר 1 ² אזורים של עור למינונים הנכונים של קרינה. לכן, שימוש בדוגמא לעיל, אם 40 kJ / m ² הוא המנה הגדולה ביותר בניסוי, ולאחר מכן בעלי החיים יהיו תחת המנורה ל27 דקות ו47 כולל שניות והעור במצב 40 kJ / m ² לא יהיו כל שמעליה קלטת כל הזמן. עם זאת, סרט שכיסה את מצב 5 kJ / m ² יוסר כאשר יש 208 שניות שנותרו בחשיפה. תזמון של הסרת קלטת צריך להיעשות כך שכל מצב מסתיים בו זמנית.
7. לאחר חשיפה לקרינת UV, לקלף את הסרט מעור הגב בזהירות, נזהר שלא לקרוע את העור בתנועות פתאומיות או יתר על המידה, בכוח. הנח בעלי חיים במקום שקט חם כדי לאפשרהתאוששות מן ההרדמה.
8. לפקח על עכברים ל24-48 שעה לחפש אזורים דיסקרטיים של אריתמה (אדמומיות) או בצקת (נפיחות) מתאים לאתרים אנטומיים נחשפו למינון המסוים של קרינת UV. לתעד את ממצאי עור photographically.
9. ערך MED תואם את המינון המינימאלי של UV שגורם לדלקת כפי שהוגדר על ידי אודם ו / או בצקת של המעגל נחשף כולו של עור. שימו לב כי פיגמנטציה של העור יכולה לאתגר את הנחישות של MED, לעומת זאת, אודם ובצקת עדיין יכולים בדרך כלל להעריך במדויק, בין שאר הודות לצורה מוגדרת של הפתחים בקלטת במהלך חשיפה לקרינת UV.

6. ניתוח סטטיסטי

לנתח נתונים בין קבוצות של עכברים בדרך ANOVA אחד עם מבחן Bonferroni הודעה (גרף Pad PRISM). ערכי p <0.05 נחשבים משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

C57BL / 6 עכברים שנוצרו על רקע eumelanotic, pheomelanotic או amelanotic שילוב transgene K14-SCF כ( איור 1 א) תאר. קבוצות של הארכה בהירת עור ^(ה MC1R ^{/ e, + / +} Tyr) טופלו עכברים למריחה עם מינונים של פעמיים ביום או ברכב (70% אתנול, 30% פרופילן גליקול) או 40% תמצית שורש forskohlii Coleus הגולמי (80 מיקרומטר לכל מינון) במשך 5 ימים (איור 2). השפעות של טיפולים אקטואליים בפיגמנטציה באפידרמיס נקבעו הן על ידי בדיקה ויזואלית ועל ידי colorimetry רעיוני (איור 1). יישום של תמצית השורש היה קשור עם מחשיך אפידרמיס חזק ברקע המהונדס K14-SCF אך לא בבעלי חיים שאינם מהונדסים גנטית בהתאמה. אנו מפרשים את התוצאות הללו כדי לציין שמלנוציטים באפידרמיס interfollicular חייבים להיות נוכחים על מנת שהמלנין פרמקולוגית-Induced שיופקד בepidermis. למרות תמצית השורש היא בצבע עמוק בגלל הנוכחות של פיטוכימיקלים צמח מלבד forskolin, מחשיך עור לא יכול להיות אך ורק בשל אפקט צביעה מהסמים, כפי שבעלי חיים שאינם מהונדסים מצליחים להפגין עור מתכהה עם תמצית השורש (איור 1). כאשר מיושמים באופן פעמיים ביום, melanizing השפעות של forskolin מריחה להחיל ניתן לציין זאת בקטן כמו 2 ימים, אם כי מחשיך מקסימאלי הוא הבין אחרי כמה ימים נוספים (איור 1 ג). מידת melanization היא תלויה מינון, כפי שמוצג על ידי מכתים מלנין Fontana-מסון סעיפים עור גב שטופלו בריכוזים שונים של התרופה (1D איור).

בשלב בא, את ההשפעה של forskolin מריחה להחיל על רגישות UV נקבעה על ידי בדיקות MED בעכברי סיומת ^(ה MC1R ^{/ דואר,} Tyr ^{+ / +)} כפי שתוארה לעיל (איורים 2 ו-B). נחישות MED הושוותה בין aniMals שטופלו בטיפול מואץ בסמים (פעמיים בממשל יום במשך 5 ימים, 10 מינוני סך הכל) לעומת גישה סטנדרטית (מנהלת פעם ביום למשך 15 ימים, 15 מנות בסך הכל). עכברים ללא מהונדסים נכללו לשלוט על השפעות תרופה שאינה מלנין. שני הטיפולים הביאו לכמויות דומות של עור מתכהות בבעלי החיים K14-SCF טופלו forskolin. באופן ספציפי, ערכים * L (colorimetry רעיוני קנה מידה הלבנה שחורה) לבעלי חיים שנחשפו לforskolin היו 31.9 ± 1.8 ו31.1 ± 1.6 ליישום מואץ לעומת יישום סטנדרטי, בהתאמה. לא היו השפעות רעילות ברורות מחשיפת forskolin בשתי קבוצות טיפול, ובכך, הגיע למסקנה שממשל forskolin המואץ (שתי פעמים ביום למשך 10 מינוני סך הכל, 80 מיקרומטר לכל מנה) קידמו melanization הבטוח של עור הגב בצורה יעילה כמו שהשתמש בעבר (פעם ביום למשך 15 מינוני סך הכל, 80 מיקרומטר לכל מנה).

melanization אפידרמיס-Induced forskolin הביאהגנת UV עמוקה כמו להישפט על ידי MED (איורים 2C-D). לפיכך, בעוד שהממוצע MED לעכברי הארכת K14-SCF טופלו פעמיים במשך 5 ימים עם רכב היה 5.0 ± 0.0 kJ / מ ^2, MED הממוצע לקבוצות שטופלו בforskolin אקטואלי היה> 30.0 ± 0.0 kJ / m ² (איורים 2 ו ג). למעשה, במינון של 30.0 kJ / m ² היה מספיק כדי לייצר אריתמה בניסוי זה. שימוש במינון סטנדרטי forskolin (פעם ביום למשך 15 מינוני סך הכל, 80 מיקרומטר לכל מנה), מצאנו כי MED הממוצע לעכברי הארכת K14-SCF טופלו forskolin היה 50.0 ± 7.1 kJ / m ² (איור 2 ב ', ד'). חשוב לציין, שלפני הטיפול forskolin לא השפיע על MED של בעלי חיים שאינם מסוגלים melanization, אם בשל חוסר מלנוציטים באפידרמיס בתיווך K14-SCF (2C דמויות, D) או בגלל מחסור טירוסינאז (2E איור). מאז יישומי forskolin היו דיסהמשיך 2 ימים לפני החשיפה לקרינת UV ולא המשיכו לאחר חשיפה לקרינת UV, אנו מסיקים כי השפעות cAMP אינו פיגמנט לא משחקות תפקיד בתוצאות MED. במקום זאת, הנתונים מראים כי melanization אפידרמיס היה המנגנון שבאמצעותו הגנת UV forskolin מושרה במודל זה.

איור 1. טיפול מקומי של forskolin מקדם מחשיך עור בהארכה בהירת עור ^(ה MC1R ^{/ ה)} עכברים. תמונות (א) לC57BL / 6 בעלי חיים המשמשים במחקר זה. בעלי חיים מותאמים גנטי אלא בקולט melanocortin 1 (MC1R) וטירוסינאז לוקוסים (Tyr). שים לב שפיגמנטציה היא eumelanotic (שחור) כאשר MC1R הוא פונקציונלי, אלא pheomelanotic (בלונדיני), כאשר MC1R פגום, כמו במקרה עםמוטציה סיומת ^(ה MC1R ^{/ ה).} פיגמנטציה עוריות תלויה בשייר של מלנוציטים באפידרמיס interfollicular בעור על ידי transgene K14-SCF, ויכולה בקלות לראות באוזניים. תמונות (ב) להארכה ^(ה MC1R ^{/ ה)} K14-SCF או בעלי חיים שאינם מהונדסים שטופלו 400 μl של שליטה ברכב (70% 30% גליקול propyl אתנול) או 40% forskolin w / v (80 מיקרומטר) מיושם פעמיים ביום לעור הגב המגולח במשך 5 ימים, סך של 10 יישומים. מדידות צבע עור על ידי colorimetry רעיוני בוצעו עבור כל קבוצה. תוצאות colorimetry רפלקטיבית מדווחות כיחידות ממוצעת (± סטיית תקן) reflectometry ב* L ציר צבע (שחור לבן). שים לב שהממשל מקומי של forskolin גרם עור חזק המחשיך בבעלי חיים מהונדסים K14-SCF אך לא בעכברים שאינם מהונדסים. ניסוי כמובן (C) זמן מראה מחשיך של האוזן שטופלה forskolin של K14-SCFעכברי ארכה לזמנים מצויינים (אוזניים שטופלה forskolin מסומנים על ידי המשולשים הכחולים). הרכב היה מוחל על אוזן ימין להשוואה. (ד) סעיפי פונטנה-מסון מוכתם עור שנלקחו מבעלי החיים שטופלו במינונים המצוין של forskolin כמתואר. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. melanization-Induced forskolin מגן מפני דלקת בתיווך UV כפי שנקבע על ידי מינון מינימאלי erythematous בדיקות (MED). מיקום (A, B) של מינוני קלטת האוטמת UV ו UVB של בעלי חיים שטופלו פעמיים ביום במשך 5 ימים (A, C) או פעם ביום למשך 15 ימים (B, D, E) גם עם רכב או forskolin. ה דואר הטיפול מקומי האחרון יושם 48 שעה לפני ההקרנה. עור גב נחשף למינונים שונים של הקרינה UVB באמצעות קלטת UV-אוטם עם 1 סנטימטר חבט החוצה ² פתחים עגולים, ומשתנה זמני חשיפה להניב את המינון המתאים. לאחר הקרנה, עיגולים של עור חשוף תויגו עם עט בכמה ניסויים. MED של, שהוגדר על ידי אודם ו / או בצקת של כל העיגול של עור נחשף למינון מסוים, היו נחוש 48 שעות לאחר חשיפה. MED ± תוצאות SD מדווחים כkJ / m ² UVB, * p ≤ 0.001. (E) reflectometry צבע עור וערכי MED לעכברי הארכת בקן טירוזין הלקוי K14-SCF טופלו במשך 10 ימים עם רכב או forskolin. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

"Src =" 70fig3highres.jpg / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
איור 3. סכימה כללית של הניסוי. קבוצות של הארכה ^(ה MC1R ^{/ ה)} K14-SCF או בעלי החיים שאינם מהונדסים הוכנו על ידי הסרת הפרווה הגבי על ידי גז חשמלי ו / או אפילציה הכימית. בעלי חיים ולאחר מכן טופלו ביישומים אקטואליים של שני כלי רכב (70% אתנול, 30% פרופילן גליקול) או עם 40% תמצית forskolin הגולמי על ידי לוחות הזמנים מינון מצויינים. השפעות על פיגמנטציה של עור תועדו בתצלום, colorimetrically ועל ידי צביעת מלנין Fontana-מסון. רגישות UV נקבעה על ידי מינון מינימאלי erythematous בדיקות (MED).

שימוש במודל חיה של האדם בהיר עור, אנו מוצאים כי יישום מקומי של תמצית שורש הגולמי forskolin עשיר וחסונה מכהה את העור על ידי המרצת ייצור המלנין בעור. melanization עוריות תלוי בביטוי של גורם בתאי גזע בעור הבסיסי, כפי שקורה בעור אדם, אך לא בעור עכבר גנטי ללא שינוי. עור הגב של עכברים גנטיים ללא שינוי חסר בכמות מספקת של מלנוציטים interfollicular להקנות פיגמנט בעור. רק בהגדרה של ביטוי המכונן של גורם גדילת מלנוציט כגון גורם תאי גזע (יגנד ערכה) או גורם גדילת hepatocyte (HGF) יכול מלנוציטים להישמר בשכבת הבסיס של האפידרמיס לכל אורך חייו של בעל החיים ^50-51. מודל החיה שלנו של האדם בהיר עור מבוסס על שילוב של transgene K14-SCF לגרסת פיגמנט הארכת הקו העכברי C57BL / 6. למרות שבעלי חיים בכל גיל יכולים להיותמשמש, הניסויים שלנו בדרך כלל כרוכים בוגרים צעירים (4-12 שבועות של גיל) עכברים. בגלל קולט קטוע melanocortin 1 (MC1R) שמוביל לאובדן של איתות cAMP, עכברי הארכה להביע pheomelanin מעדיפים במעיל העור (במדינות מהונדסים K14-SCF או HGF-Met) ולא eumelanin ^52-54. כתוצאה מכך ביטוי מלנין שהשתנה, עכברי הארכת K14-SCF הם הרבה יותר UV רגיש יותר מאשר עמיתיהם MC1R פראי הסוג, שיש להם עור שחור משחור בשל תצהיר שפע של פיגמנט אומלנין אפידרמיס ^1. אנחנו סברנו כי מאז ייצור אומלנין הוא פחתה מאוד בהגדרה של MC1R מוטציה, שממריצים תרופתיים המחקים איתות MC1R אולי יצילו ייצור אומלנין. MC1R הוא קולטן הטרנסממברני _יחד-S G ש, על הכריכה של ליגנד גבוה זיקתה α-מלנוציט הורמון מגרה (α-MSH), משדר אותות פרו בידול לmelanoציטופלסמה cyte באמצעות הפעלת adenylyl cyclase וייצור של cAMP השליח השני. לפיכך, שערנו כי יישום מקומי של forskolin, diterpenoid תא חדיר שהוא activator ישיר חזק של cyclase adenylyl, ייתכן שתוכל כדי לקדם את ייצור אומלנין ב, מדינת pheomelanotic MC1R-פגום.

שימוש forskolin מטוהר ללימודים אלה, עם זאת, הוכיח עלות אוסרני. ניסויים מוקדמים קביעת סכום המינימום של forskolin נדרש למחשיך אפידרמיס במודל הארכת K14-SCF הציעו כי מחשיך מקסימאלי התרחש עם השימוש במשקל 40% לפתרון עוצמת קול באמצעות תמצית גולמי שהכילה 20% (במשקל למשקל) של forskolin. אנו מחשבים כי יישום של 400 μl של 8% forskolin הסופי (משקל לכל נפח; 40% x 20%) פתרון יביא במשלוח של כ 80 מיקרומטר של forskolin לעור הגב כל יישום. כמובן, הרבה יותר של המינון נמסרלא נספג בעור, במקום שנספג על ידי הסובב פרווה או נופלים מבעלי החיים בעת הגשת הבקשה. לכן קשה לדווח על המינון המדויק הבין שבעלי החיים מקבלים עם כל יישום של התרופה. עם זאת, כאשר מיושם באופן זה, תוצאות forskolin באינדוקציה חזקה של אנזימי הפיגמנט בעור והייצור של אומלנין. למעשה, בעלי חיים מהונדסים הארכת K14-SCF הפגינו מחשיך ברור של העור לאחר היישום השני (איור 1 ג).

אמנם יש לנו שפורסמו עור מתכהה עם יישום יומיומי של התרופה ^1,48-49 בעבר, כאן אנו מראים כי יישום פעמיים ביום קשור מחשיך אפידרמיס חזק והגנת UV משמעותית, המצביעים על כך melanization המושרה התרופתי יכול להיות מותאם על ידי ממשל של תרופה בתדירות גבוהה יותר מאשר פעם אחת ביום. מחשיך עור, אשר עקב האינדוקציה אומלנין באפידרמיס, נמשך כעוד טיפולי forskolin אקטואליים הם המשיכו. אפילו יישום כרוני (באמצעות שלושה חודשים) נראה נסבל היטב על ידי העכברים ^49. העלייה במחשיך עור בשל סינתזת המלנין ולא ריבוי של מלנוציטים באפידרמיס. ^49. ברגע שטיפול מקומי הופסק, העור נמוג בהדרגה בחזרה לגוונה בסיס ההוגן (מעל 2-3 שבועות) כמלנין אפידרמיס הולך לאיבוד עם חידוש keratinocyte נורמלי. מחשיך של העור ניתן לקבוע בקלות על ידי בדיקה ויזואלית פשוטה של העכברים, אולם צבע עור ניתן לכמת באופן אובייקטיבי באמצעות colorimetry רעיוני ^55-56. שיטה זו היא שיטה מהירה ונטולת כאבים בלתי פולשני למדידת צבע עור. צבע יכול להיות תאר במדויק באמצעות L * מודל מרחב צבעים * ב * (LAB) ^57-58.

בניסויים אלה שהסתמכנו על תמצית שורש גולמי של צמח forskolii Coleus, המקור הטבעי של forskolin. הכנה זוהיה בשימוש בגלל העלות הגבוהה של ביצוע הניסויים האלה עם forskolin מטוהר. ניסוי זה, למשל, נדרש בערך 2 גרם בסך הכל forskolin ליישום פעמיים ביום לשישה בעלי חיים למשך חמישה ימים. 2 גרם של forskolin המטוהר HPLC, זמין מסחרי יעלה יותר מ 20,000 $, לעומת פחות מ -5 דולרים לתמצית הגולמי. למרות forskolin מטוהר מושרה מלנין אפידרמיס במודל החיה שלנו ^1, אנחנו לא יכולים לשלול את השפעות אפשריות של תרכובות צמחיות אחרות בתמצית השורש הגולמי כוללים אלקלואידים, פנולים וטאנינים. למעשה, עבודה לפני השימוש בפן ניסיונות או explants עור האנושי הציעה כי תרכובות בתמצית השורש הגולמי עשויות לקדם את הספיגה עורית של forskolin ^59. עדיין, עם זאת, את זהותו ואת המנגנון של תרכובות אלה אינן ידועים. לכן, אנחנו לא יכולים לשלול את שינוי השפעות של תרכובות אחרות הנמצאות באופן טבעי בתמצית השורש הגולמי.

תערובת forskolin המורכב היאנוזל חום כהה עם הארומה כמו תבלינים אטרקטיבי שמוחלת בקלות על העור ליישום מקומי. בגלל החומרים מסיסים הוסרו, יישום יומיומי לא משאיר קרום נוצר או פיקדונות ספג פעם אחת על ידי העור. למרות תמצית השורש הגולמי היא בצבע חום כהה, כאשר הוכנו באופן זה, מחשיך עור הנגרם על ידי הסמים הוא לא רק אפקט צבע, כפי שהוכח על ידי עובדה כי יישום מקומי של המתחם על בעלי חיים לא מסוגלים melanization עור (טירוסינאז למשל MC1R ^{דואר / דואר} בעלי חיים לקויים לבקן או עכברים שאינם מהונדסים, כי חוסר מלנוציטים אפידרמיס) לא היו השפעה על עור מתכהה (איורים 1B ו 2E). אנו רואים בניסויים אלה כהוכחה של קונספט הפגנות שמניפולציה של cAMP בעור יכולה לגרום לפיגמנטציה של עור כהה UV-מגן. עם זאת, אין זה סביר שממשל מקומי של forskolin הוא אופציה טיפולית אפשרית או מעשית בגלל האופי הלא הספציפי של התרופה. אניndiscriminate והפעלה הלא ממוקדת של cyclases adenylyl ואינדוקציה של cAMP יכולים להיות צפויה לגרום לרעילויות מתקבלות על הדעת. חשוב לציין, אחרים הראו כי ממשל מקומי של מעכב phosphodiesterase 4 (Rolipram), בעצמה עד מוסדרים מלנין במודל החיה הארכת K14-SCF, המוכיח כי האינדוקציה cAMP עורית וmelanization יכולים להיות מושגת על ידי תרופתי חלופי מיקוד ^35. ברור, לפני מניפולציה אקטואלי של רמות cAMP בעור יכולה להיות מתורגמת לשימוש בבני אדם, בטיחותו תצטרך להעריך בזהירות. עם זאת, מהנתונים עולה כי melanization פרמקולוגית המושרה הוא UV-הגנה, כפי שנקבע על ידי מינון מינימאלי erythematous בדיקות (MED).

לסיכום, ממשל מקומי של forskolin, activator cyclase adenylyl, הביא melanization חזק של האפידרמיס של מודל עכברי של האדם בהיר עור המבוסס על cAMP הפגום איתות למטהזרם של קולט melanocortin 1 פגום (MC1R). melanization עוריות היה UV-הגנה, כפי שהיא נמדדת על ידי מינון מינימאלי erythematous בדיקות (MED). אנו משערים כי המניפולציה cAMP תרופתי יכולה לא רק eumelanization הצלת UV-הגנה של האפידרמיס, אבל תגובות UV-הגנת MC1R תלויות אחרות גם כן.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המחברים מבקשים להודות מלינדה קל תנועה לקבלת סיוע טכני. אנחנו גם מכירים מקורות מימון העבר ובהווה: המכון הלאומי לסרטן (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), וונדי וויל מקרה הקרן לחקר הסרטן, מרקי קרן הסרטן, נס הרשת של הילדים וג'ניפר ודיוויד דיקנס מלנומה קרן מחקר.