Induction pharmacologique de mélanine épidermique et la protection contre les coups de soleil dans un modèle humanisé de souris

Mélanine épidermique est induite par l'application topique de la forskoline dans un modèle murin de la sensible aux UV humain à la peau claire. Manipulation pharmacologique du taux d'AMPc dans la peau et l'épiderme assombrissant fortement protéger contre l'inflammation médiée par les UV (coups de soleil), telle que mesurée par la dose érythémateuse minimale (DEM) de dosage.

Équité de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de cancer de la peau tout en corrélation avec la fonction physiologique du récepteur de la mélanocortine 1, une protéine de signalisation G _s couplé trouve à la surface des mélanocytes. Mc1r stimule l'adénylyl cyclase et la production d'AMPc qui, à son tour, régule à la hausse la production de mélanine dans les mélanocytes de la peau. Afin d'étudier les mécanismes par lesquels la signalisation Mc1r protège la peau contre les dommages UV, cette étude s'appuie sur un modèle de souris avec "peau humanisé" basé sur l'expression épidermique du facteur de cellules souches (SCF). Souris transgéniques K14-SCF conservent mélanocytes dans le épiderme et ont donc la possibilité de déposer la mélanine dans l'épiderme. Dans ce modèle animal, type sauvage résultats de l'état Mc1r en dépôt solide de pigment noir de l'eumélanine et un phénotype anti-UV. En revanche, les animaux K14-SCF avec signalisation défectueux Mc1r capacité présentent une pigmentation rouge / blonde, très peu d'eumélanine dans la peau etun phénotype sensible aux UV. Raisonnement que le dépôt de l'eumélanine pourrait être renforcée par des agents topiques qui imitent signalisation Mc1r, nous avons constaté que l'application directe de l'extrait de la forskoline sur la peau de souris à la peau claire Mc1r défectueux a entraîné robuste induction de l'eumélanine et la protection UV ^1. Nous décrivons ici la méthode pour la préparation et l'application d'un extrait de racine naturelle contenant la forskoline à des souris à la peau claire K14-SCF et signaler une méthode pour mesurer la sensibilité aux UV par déterminer la dose érythémateuse minimale (DEM). En utilisant ce modèle animal, il est possible d'étudier comment épidermique AMPc induction et la mélanisation de la peau affectent les réponses physiologiques à l'exposition aux UV.

L'incidence du mélanome, la forme la plus mortelle de cancer de la peau, a considérablement augmenté au cours des dernières décennies aux États-Unis, en particulier chez les personnes à peau claire. Preuve moléculaire et épidémiologique forte implique rayonnement UV comme un facteur causal majeur de l'environnement ^2-5. L'exposition aux UV renforcée sous forme d'exposition au soleil et l'utilisation des lits de bronzage est susceptible d'être responsable de la plupart des augmentations de mélanome incidence ^6-7. risque de mélanome semble particulièrement liée à des coups de soleil ^8, en particulier ceux au début de la vie ^9-10. Le risque de coup de soleil est liée non seulement à la dose et l'intensité de l'exposition aux UV, mais aussi par des facteurs héréditaires qui influencent la réponse cutanée à un rayonnement UV. pigmentation de la peau est l'un des déterminants les plus importants de la sensibilité aux UV, le risque de coups de soleil et le risque de cancer. Le mélanome se produit environ vingt fois plus souvent chez les personnes à peau claire par rapport à individua peau foncéels ^11-13.

La mélanine, un pigment produit par les mélanocytes de l'épiderme, est le principal déterminant de teint de la peau. La mélanine est disponible en deux variétés principales: (1) l'eumélanine, un pigment brun / noir foncé efficace pour absorber l'énergie du rayonnement UV, et (2) phéomélanine, un rouge / pigment blond moins efficace pour prévenir la pénétration de photons UV dans la peau. couleur de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de mélanome sont en grande partie déterminées par le contenu épidermique eumélanine ^14-15. Le plus eumélanine dans l'épiderme, les photons UV moins peut pénétrer dans la peau. En raison de faibles niveaux innées de l'eumélanine, les personnes à la peau claire sont beaucoup plus sujettes à des effets aigus et chroniques du rayonnement UV ^16-18.

la pigmentation de la peau, le mélanome et le risque de la capacité de "bronzage" après l'exposition aux UV tout en corrélation avec la capacité de signalisation du récepteur de la mélanocortine 1 (Mc1r), une _s-G à sept domaines transmembranaires couplés srécepteur de urface sur les mélanocytes ^19-22. Lorsque Mc1r se lie à son ligand apparenté à haute affinité, α-mélanocyte stimulating hormone (α-MSH), il est l'activation de l'adénylcyclase et la production de la deuxième camp de messager ^23. La réponse physiologique normale de la peau après exposition aux UV comprend la production de l'épiderme de α-MSH par les kératinocytes ^24-29. Nous émettons l'hypothèse que d'autres et de kératinocytes dérivées de α-MSH se lie à Mc1r sur les mélanocytes épidermiques, s'engageant dans la production en aval du second messager AMPc par l'activation de l'adénylcyclase ^30. taux d'AMPc contrôlent de nombreux aspects de la différenciation des mélanocytes, y compris les voies de survie, réparation de l'ADN et de la synthèse du pigment. signalisation de l'AMPc Mc1r et induisent clairement les niveaux de l'enzyme de pigments et de la production de l'eumélanine. Lorsque la signalisation Mc1r est intacte et les taux d'AMPc mélanocytaires sont robustes, l'eumélanine est produite et la peau s'assombrit. Toutefois, si la signalisation Mc1r est défectueux etles taux d'AMPc cytoplasmiques restent faibles, pheomelanin est produite à la place ^1. synthèse de eumélanine peut être stimulé pharmacologiquement par des agents qui augmentent le taux d'AMPc ^1,14,31-35.

Depuis la protéine Mc1r est un régulateur majeur du risque de mélanome chez l'homme ^36-46, nous sommes intéressés aux mécanismes par lesquels Mc1r protège les mélanocytes contre la carcinogenèse induite par les UV. En tant que fondation pour nos études, nous avons généré un Mc1r-modèle murin transgénique variante sur un pur C57BL / 6 génétique ^1. Dans ce modèle, facteur des cellules souches (SCF) est constitutivement exprimé dans l'épiderme basaux et des mélanocytes épidermiques interfolliculaires sont retenus dans la peau tout au long de la vie ^47, contrairement aux souris non-transgénique, dans lequel mélanocytes localiser au derme dans les follicules pileux. Avec le transgène K14-Scf incorporé, l'épiderme devient pigmenté avec notamment la caractéristique de la mélanine de pigments de pigmentsouche de l'animal ^1. souris K14-SCF sur le fond génétique C57BL / 6 de type sauvage signalisation Mc1r ont la peau noire de jais caractérisé par des niveaux très élevés de l'eumélanine pigment. Sans surprise, ces animaux sont très résistants aux UV. En revanche, génétiquement adaptés K14-SCF C57BL / 6 animaux qui abritent un inactif Mc1r mutant n'ont presque pas d'eumélanine dans l'épiderme. Au lieu de cela, ces animaux «d'extension» (Mc1r ^{e / e)} ont un teint de peau juste causée par le dépôt de pheomelanin pigment (figure 1A) et sont beaucoup plus sensibles aux UV ^48-49.

Composés pharmacologiques ayant des propriétés chimiques qui permettent la pénétration dans la peau ont été montré pour induire puissamment eumélanine dans le prolongement (Mc1r ^{e / e)} modèle animal K14-Scf en manipulant directement les taux d'AMPc dans les mélanocytes de l'épiderme de la peau. La mélanine régulation à la hausse dans ce modèle a été reported par adénylylcyclase activation ¹ ainsi que de la phosphodiestérase 4 inhibition ^35. Dans cet article, nous démontrons la préparation et l'application topique de la forskoline en extension (Mc1r ^{e / e)} animaux K14-SCF qui modèle la sensible aux UV humain à la peau claire. Nous montrons que l'application deux fois par jour du médicament favorise la mélanisation accélérée, ce noircissement de la peau est due au dépôt de l'épiderme de mélanine et qui induit la mélanine épidermique protège contre les coups de soleil induite par les UV à travers la mesure de la "dose minimale érythémateuse" (MED) ^48.

Une. Préparation de la forskoline pour l'administration topique d'un extrait de racine de brut de l'usine de Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii)

1. Protocoles pour expériences murines ont suivi les lignes directrices pour la conduite éthique dans le soin et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par la institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité à l'Université du Kentucky (Protocole # 00768M2004). L'extrait de racine est constituée à 40% poids / volume dans une base dermatologique norme de 70% d'éthanol, 30% de propylène glycol.
2. Peser 200 g de forskoline brut extrait de racine et le transférer dans un bêcher. Pour faire 500 ml de 40% (p / v) de solution, remettre en suspension 200 g de forskoline brut extrait de racine par l'ajout de la plupart, mais pas la totalité du volume du véhicule (70% éthanol, 30% de propylene glycol) et porter la solution à environ 450 ml.
3. Agiter pendant une heure à température ambiante. La solution sera un peu visqueux et peut nécessiter une agitation manuelle de «lever» l'extrait en solution avantla barre d'agitation est en mesure de prendre le relais.
4. Après une heure d'agitation, verser le mélange dans un cylindre gradué et porter le volume à 500 ml en utilisant un véhicule qui a été utilisé à "rincer" le bêcher qui a été utilisé pour agiter la bouillie (pour maximiser la récupération de la forskoline à partir du bécher) .
5. Transférer la suspension de tubes de 50 ml à centrifuger en polypropylène. Centrifugeuse (1500 xg, la température ambiante, 15 min) à l'aide d'une centrifugeuse de table. A ce moment, la matière insoluble sera assez compacté, ce qui permet au surnageant d'être facilement déversé.
6. Filtrer la solution à travers une membrane d'acétate de cellulose de 0,22 um pour éliminer toute matière insoluble résiduelle à partir de l'extrait. On utilise un système de haut-bouteille conçue pour la culture cellulaire, ainsi que l'utilisation des pré-filtres qui viennent avec l'appareil pour éviter un colmatage prématuré de la membrane à partir de composants insolubles de l'extrait de racine. Lors de grands volumes de l'extrait, un filtrage d'environ 100 ml à la fois, en changeant le pari préfiltreween chaque volume ajouté.
7. Lorsqu'elles sont stockées à la température ambiante, l'extrait maintient l'activité biologique pour jusqu'à un an.

2. Préparation de C57BL / 6 K14-Scf souris pour des traitements topiques

1. Retirer dorsale fourrure des animaux par cisaillement électrique. Anesthésier brièvement les animaux avec de l'isoflurane inhalation pour faciliter la tonte de dorsale fourrure avec des ciseaux électriques équipés d'une tête préparatoire chirurgicale 0,25 mm (Fisher Scientific). De préférence, utiliser un seul type d'anesthésie (par exemple, la kétamine / xylazine) pour minimiser les risques de surdose d'anesthésique. La chambre d'inhalation saturé comporte des risques au travail lorsqu'il est utilisé en dehors d'une hotte et fournit des quantités inconnues de l'anesthésie des animaux. Idéalement, un vaporisateur de précision doit être utilisé.
2. Pour supprimer résiduelle chaume de cheveux, traiter les animaux avec un dépilatoire chimique. Administrer une anesthésie à l'animal par une injection ip de la kétamine à 40 mg / kg de xylazine et 4 mg / kg
3. Lorsque les animaux sont anesthésiés de façon adéquate (à en juger par pincement de l'orteil), appliquer une quantité doigt de taille de crème dépilatoire à cisaillé peau du dos à l'aide d'un doigt ganté. Frottez la crème dans la peau pendant 30-60 secondes ou jusqu'à ce que les poils sont clairement visibles dans la crème comme il est déplacé. Laissez la crème sur que pour le montant minimum de temps nécessaire pour l'épilation comme l'exposition prolongée conduit à la combustion chimique de la peau, l'éclatement de l'épiderme et de la mort de la perte de l'intégrité de l'épiderme.
4. Essuyez la peau du dos avec des tampons de gaze imbibée d'eau jusqu'à ce que toutes les crèmes a été supprimé. Animaux à sec utilisant des serviettes en papier doux, et leur permettront de récupérer dans un endroit isolé chaud (par exemple cages propres placés sur un coussin chauffant). Épiler les animaux un par un et suivre de près tout au long de la procédure.

3. L'administration topique de la forskoline ou de contrôle des véhicules

1. Les animaux doivent être traités un à la fois. Anesthésier brièvement à inhalerd isoflurane en plaçant la souris au-dessus d'un filtre en nylon perméable à l'air de forme équipée en vertu de laquelle a été placé un papier essuie-isoflurane saturé dans un bocal en verre avec couvercle clair isoflurane saturé dans une hotte. Exposer la souris à l'isoflurane pendant un temps suffisant pour supprimer les mouvements musculaires volontaires mais aussi pour préserver la respiration spontanée (typiquement 10-20 sec). Laissant l'animal dans l'isoflurane trop longtemps se traduira par la suppression respiratoire et la mort. Il est préférable de pécher par excès de «lumière qui" et d'avoir à ré-exposer la souris brièvement plus isoflurane plutôt que de sur-exposer l'animal à la mort de la drogue et les risques.
2. Retirer l'animal de la chambre de l'isoflurane et le placer sur un tapis de banc absorbant propre.
3. Avec une micropipette 1000 pi équipé d'une pointe de polypropylène à usage unique, établir 400 ul de 40% d'extrait de forskoline brut (animaux de contrôle du véhicule recevront 70% d'éthanol, 30% de propylène glycol seul).
4. Transvaser l'extrait sur ledos de l'animal par égouttement il sur la peau, puis, à l'aide du côté de la pointe de la pipette, appliquer l'extrait sur la peau du dos jusqu'à ce que toute la peau a été couvert. Il n'est pas nécessaire d'effacer la peau après application.
5. Retour de la souris dans sa cage, et observer attentivement jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie.
6. Afin que les effets de l'AMPc non pigments ne doivent pas confondre expériences de sensibilité UV, arrêter tous les traitements topiques deux jours avant l'exposition aux UV (effet de pigment dure plusieurs jours au-delà dernier traitement topique).

4. Couleur de la peau de mesure par colorimétrie réfléchissant

1. Anesthésier brièvement la souris avec de l'isoflurane en inhalation (voir ci-dessus).
2. Calibrer un colorimètre Minolta en plaçant la tête portable sur la surface blanche standard fourni avec le colorimètre.
3. Placez la tête de mesure portable de la chasse du colorimètre avec la peau du dos de l'animal assurer que le cycle apertur 1 cm ²e est complètement enfoncé sur la peau. Prenez au moins trois mesures distinctes dans différents domaines de la peau du dos.
4. Calculer moyenne L * Partition ± SD par animal et par groupe de traitement. Colorimétrie réfléchissante peut se faire à n'importe quel moment dans l'expérience.

5. Détermination de la sensibilité aux UV par calcul de "Minimal érythémateuse Dose" (MED)

1. Utiliser des animaux qui ont été pré-traitées avec le véhicule ou la forskoline comme décrit ci-dessus. Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale d'un mélange standard de kétamine et de xylazine (voir ci-dessus).
2. Préparer un morceau de ruban adhésif occlusif-UV pour les tests MED. Pour générer des trous dans la bande, utilisez une perforatrice de grande puissance avec une découpe circulaire 1 cm ² (Figures 2A et B). Ayant des trous d'une taille définie et la disposition symétrique dans la bande facilite la reconnaissance de modifications de la peau après irradiation. Sur chaque trou dans la bande, appliquer une petite mais facilement détachable pièce de ruban qui peut être retiré à des instants définis pendant l'exposition aux UV pour permettre l'administration de différentes doses d'UV.
3. Lorsque les animaux sont suffisamment sédation, placez le ruban sur la surface dorsale. lubrifiant des yeux doit toujours être utilisée sous anesthésie.
4. Allumez la source UV composé de deux Westinghouse F15T8UV-B lampes avec une puissance de pointe de 313 nm et une gamme de 280-370 nm. Laissez la lampe à s'équilibrer à une sortie d'UV constante telle que mesurée par un photomètre UV avec un capteur de rayons UVB (faut généralement quelques minutes pour les lampes à réchauffer).
5. Sur la base de la vitesse de transmission des UV, tel que mesuré par le photomètre UV, UV calculer le temps d'exposition pour chaque dose désirée. Par exemple, UVB mesures de sortie de notre lampe de 2,4 mW / cm ^2. Par conséquent, l'administration de 5 kJ / m ^2, la peau aurait besoin d'être exposé à 208 sec (qui est de 3 min et 28 s) de rayonnement UVB, tel que calculé ci-dessous:
   upload/50670/50670eq1.jpg "/>
6. Placez les animaux sous sédation (chacune avec bande occlusif en place) ventrale de surface vers le bas pour assurer une exposition même UV. Pour administrer les doses choisies de rayonnement UV, retirer successivement les petites bandes occlusifs couvrant les trous d'exposer 1 cm ² zones de peau à des doses correctes de rayonnement. Par conséquent, en utilisant l'exemple ci-dessus, si 40 kJ / m ² est la plus grande dose dans l'expérience, alors que l'animal serait sous la lampe à 27 min et 47 sec total de la peau et dans la condition de 40 kJ / m ² n'aurait pas d' bande recouvrant tout le temps. Cependant, la bande recouvrant la condition 5 kJ / m ² serait supprimé quand il ya 208 sec restant dans l'exposition. Moment de retrait de la bande doit être fait pour que chaque état se termine en même temps.
7. Après l'exposition aux UV, ôtez la pellicule de la peau du dos, en prenant soin de ne pas déchirer la peau avec des mouvements brusques ou trop énergiques. Placer les animaux dans un endroit calme au chaud pour permettrerécupération de l'anesthésie.
8. Surveillance de la souris pendant 24-48 heures à chercher des zones discrètes de l'érythème (rougeur) ou œdème (gonflement) correspondant à des sites anatomiques exposés à la dose spécifique de l'irradiation UV. Documenter les résultats de la peau photographiquement.
9. MED valeur correspond à la dose minimale d'UV qui provoque une inflammation telle que définie par un érythème et / ou d'œdème de l'ensemble du cercle de peau exposée. Notez que la pigmentation de la peau peut contester la détermination de MED, cependant, un érythème et un oedème peuvent encore généralement être évalués avec précision, grâce en partie à la forme définie des ouvertures dans la bande pendant l'exposition aux UV.

6. Analyse statistique

Analyser les données entre les cohortes de souris par une ANOVA avec post-test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Des valeurs de p <0,05 sont considérées comme statistiquement significative.

Souris C57BL / 6 ont été générées sur un fond eumelanotic, pheomelanotic ou amélanotiques intégrant le transgène K14-SCF comme décrit (figure 1A). Cohortes d'extension à la peau claire (Mc1r ^{e / e,} Tyr ^{+ / +)} souris ont été traitées par voie topique avec deux doses quotidiennes de véhicule (70% d'éthanol, 30% de propylène glycol) ou 40% d'extrait de coleus brut forskohlii racine (80 uM par dose) pendant 5 jours (Figure 2B). Effets des traitements topiques sur la pigmentation épidermique ont été déterminés à la fois par inspection visuelle et par colorimétrie réfléchissante (figure 1B). Application de l'extrait de racine a été associée à robuste assombrissement de l'épiderme dans le K14-SCF fond transgénique, mais pas chez les animaux non transgéniques génétiquement appariés. Nous interprétons ces résultats pour indiquer que les mélanocytes de l'épiderme interfolliculaires doivent être présents pour que la mélanine pharmacologiquement induite à déposer dans l'épidémiormis. Bien que l'extrait de racine est profondément colorés en raison de la présence de produits phytochimiques de plantes en plus de la forskoline, l'assombrissement de la peau ne peut pas être uniquement due à un effet de teinture à partir de la drogue, comme des animaux non transgéniques ne parviennent pas à présenter assombrissement de la peau avec de l'extrait de racine (figure 1B). Lorsqu'il est appliqué d'une manière deux fois par jour, les effets de la forskoline à usage topique melanizing peut noter en aussi peu que 2 jours, bien que le noircissement maximal est réalisé après plusieurs jours (Figure 1C). Degré de la mélanisation est dose-dépendant, comme le montre par Fontana-Masson mélanine coloration de coupes de peau dorsale traitées avec différentes concentrations du médicament (Figure 1D).

Ensuite, l'effet de la forskoline application topique sur la sensibilité aux UV a été déterminée par des essais chez les souris MED d'extension (Mc1r ^{e / e,} Tyr ^{+ / +)} comme décrit ci-dessus (figures 2 A et B). Détermination MED a été comparée entre les animaux traités avec un traitement médicamenteux accéléré (deux fois par administration quotidienne pendant 5 jours, 10 doses au total) par rapport à une approche standard (administration une fois par jour pendant 15 jours, 15 doses au total). Souris non transgéniques ont été inclus à contrôler pour les effets non mélaniques drogue. Les deux traitements ont donné lieu à des quantités similaires de assombrissement de la peau dans la forskoline animaux traités K14-SCF. Plus précisément, L * (colorimétrie réfléchissante échelle blanc-noir) valeurs pour les animaux de la forskoline exposés étaient de 31,9 ± 1,8 et 31,1 ± 1,6 pour l'application accélérée par rapport à l'application standard, respectivement. Il n'y avait pas d'effets toxiques évidents de l'exposition de la forskoline dans les deux groupes de traitement, donc, nous avons conclu que l'administration de forskoline accélérée (deux fois par jour pour 10 doses totales, 80 uM par dose) promu mélanisation sûr de la peau du dos de manière aussi efficace que celui utilisé précédemment (une fois par jour pour des doses totales de 15, 80 uM par dose).

Induite par la forskoline épidermique de mélanisation entraînéprotection UV profond à en juger par MED (figures 2C-D). Ainsi, dire que MED pour les souris de vulgarisation K14-SCF traités deux fois pendant 5 jours avec un véhicule était de 5,0 ± 0,0 kJ / m ^2, MED moyenne pour les cohortes traitées avec de la forskoline actualité était> 30,0 ± 0,0 kJ / m ² (figures 2 A et C). En fait, une dose de 30,0 kJ / m ² était insuffisante pour générer un érythème dans cette expérience. Utilisation de dosage forskoline standard (une fois par jour pendant 15 doses totales, 80 uM par dose), nous avons constaté que MED moyenne pour les souris de vulgarisation K14-SCF traités avec de la forskoline était de 50,0 ± 7,1 kJ / m ² (Figure 2 B, D). Surtout, pré-traitement de la forskoline n'a pas affecté MED des animaux incapables de mélanisation, soit par manque de K14-Scf médiation mélanocytes de l'épiderme (figures 2C, D) ou en raison de la carence de la tyrosinase (figure 2E). Comme les applications de la forskoline ont discontinué 2 jours avant l'exposition aux UV et n'ont pas été poursuivis après l'exposition aux UV, nous concluons que les effets de l'AMPc non pigmentaires n'ont pas joué un rôle dans les résultats MED. Au contraire, les données suggèrent que la mélanisation épidermique était le mécanisme par lequel la forskoline induite protection contre les UV dans ce modèle.

Figure 1. Le traitement topique de la forskoline favorise assombrissement de la peau en extension à la peau claire (Mc1r ^{e / e)} chez la souris. (A) Photographies de C57BL / 6 animaux utilisés dans cette étude. Les animaux sont génétiquement identiques sauf à la récepteur de la mélanocortine 1 (Mc1r) et la tyrosinase (Tyr) loci. Notez que la pigmentation est eumelanotic (noir) quand Mc1r est fonctionnel mais pheomelanotic (blondish) quand Mc1r est défectueux, comme c'est le cas avec leextension (Mc1r ^{e / e)} mutant. Pigmentation épidermique dépend de la rétention des mélanocytes épidermiques interfolliculaires dans la peau par le transgène K14-Scf, et peut facilement être vu dans les oreilles. (B) Photographies d'extension (Mc1r ^{e / e)} K14-Scf ou animaux non transgéniques traitées avec 400 ul de commande de véhicule (70% d'éthanol 30% de propyle glycol) ou 40% p / v (80 uM) forskoline appliqués deux fois par jour à la peau dorsale rasée pendant 5 jours, total de 10 applications. mesures de la couleur de la peau par colorimétrie de réflexion ont été effectuées pour chaque groupe. Résultats de la colorimétrie réfléchissants sont présentés comme des unités moyenne (± écart type) de réflectométrie sur l'axe L * de couleur (noir-blanc). Notez que l'administration topique de la forskoline a causé la peau robuste assombrissement K14-SCF animaux transgéniques, mais pas chez les souris non transgéniques. (C) Temps expérience de cours montrant l'assombrissement de l'oreille de la forskoline traité de K14-Scfsouris d'extension pour les temps indiqués (oreilles de forskoline traités sont indiquées par les triangles bleus). Véhicule a été appliqué à l'oreille droite pour comparaison. (D) sections Fontana-Masson colorées peau prélevés sur les animaux traités avec les doses indiquées de la forskoline comme décrit. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Mélanisation induite par la forskoline protège contre l'inflammation médiée-UV tel que déterminé par la dose érythémateuse minimale d'essai (MED). (A, B) Position des doses de bande occlusif UV et UVB des animaux traités deux fois par jour pendant 5 jours (A, C) ou une fois par jour pendant 15 jours (B, D, E) avec le véhicule ou la forskoline. Th e dernier traitement topique a été appliqué 48 heures avant l'irradiation. peau dorsale a été exposé à diverses doses d'UVB en utilisant du ruban occlusif-UV avec l'emporte-pièce 1 cm ² ouvertures circulaires, et différents temps d'exposition pour obtenir la dose appropriée. Après irradiation, les milieux de la peau exposée ont été marqués avec un stylo dans certaines expériences. MED de, défini par un érythème et / ou un oedème de la totalité du cercle de peau exposée à une dose particulière, ont été déterminées 48 heures après l'exposition. Le MED ± résultats SD sont signalés comme kJ / m ² UVB, * p ≤ 0,001. (E) réflectométrie de couleur de la peau et des valeurs MED pour K14-SCF souris d'extension albinos tyrosine déficient traités pendant 10 jours avec un véhicule ou la forskoline. Cliquez ici pour agrandir la figure .

70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Figure 3. Schéma d'ensemble de l'expérience. Cohortes d'extension (Mc1r ^{e / e)} K14-SCF ou les animaux non transgéniques ont été préparés en enlevant la fourrure dorsale par cisaillement électrique et / ou l'épilation chimique. Les animaux ont ensuite été traitées avec des applications topiques de l'une ou l'autre véhicule (70% éthanol, 30% de propylène glycol), ou avec 40% d'extrait de forskoline brut par les schémas d'administration indiqués. Effets sur la pigmentation de la peau ont été documentées photographiquement, colorimétrie et par Fontana-Masson mélanine coloration. la sensibilité aux UV a été déterminée par la dose érythémateuse minimale d'essai (MED).

En utilisant un modèle animal de l'être humain à la peau claire, nous constatons que l'application topique d'un extrait brut racine forskoline riche s'assombrit robuste l'épiderme en stimulant la production de mélanine dans la peau. Mélanisation épidermique est dépendante de l'expression du facteur de cellules souches dans l'épiderme basales, comme cela se produit dans la peau humaine, mais pas dans la peau non modifiée génétiquement souris. La peau dorsale de souris génétiquement non-modifiée au manque un nombre suffisant de mélanocytes interfolliculaires pigment pour conférer à la peau. C'est seulement dans le cadre de l'expression constitutive d'un facteur de croissance des melanocytes tels que le facteur de cellule souche (kit de ligand) ou le facteur de croissance des hépatocytes (HGF), les mélanocytes peuvent être retenus dans la couche basale de l'épiderme tout au long de la vie de l'animal ^{de 50 à 51.} Notre modèle animal de l'être humain à la peau claire est basée sur l'intégration du transgène K14-Scf dans la variante extension de pigment de la ligne de murin C57BL / 6. Bien que les animaux de tout âge peuvent êtreutilisé, nos expériences impliquent généralement des souris jeunes adultes (4-12 semaines d'âge). En raison d'un tronc de la mélanocortine 1 récepteur (Mc1r) qui conduit à la perte de la signalisation de l'AMPc, souris d'extension expriment pheomelanin préférentiellement dans la peau et le pelage (dans les Etats transgéniques K14-SCF ou HGF-Met) plutôt que l'eumélanine ^52-54. À la suite de l'expression de la mélanine modifiée, souris d'extension K14-SCF sont beaucoup plus sensibles aux UV que leurs homologues de type sauvage Mc1r, qui ont la peau noire de jais due à un dépôt abondant de l'épiderme eumélanine pigment ^1. Nous avons pensé que, depuis la production de l'eumélanine est fortement diminuée dans le cadre d'un Mc1r mutant, que les stimulants pharmacologiques qui imitent signalisation Mc1r pourraient sauver la production de l'eumélanine. Mc1r est un récepteur transmembranaire couplé à G _s que, lors de la liaison de son ligand à haute affinité α-mélanocyte stimulating hormone (α-MSH), transmet des signaux pro-différenciation de la mélanocyte cytoplasme via l'activation de l'adénylcyclase et la production de la deuxième camp de messager. Ainsi, nous avons supposé que l'application topique de la forskoline, un diterpénoïde de cellule-perméable qui est un activateur puissant directe de l'adénylcyclase, pourrait être en mesure de promouvoir la production d'eumélanine dans l'état pheomelanotic de Mc1r défectueux.

Utilisation de la forskoline purifiée pour ces études, cependant, s'est avéré un coût prohibitif. Les premières expériences de détermination de la quantité minimale de forskoline requis pour épidermique assombrissement dans le modèle d'extension K14-SCF ont suggéré que le noircissement maximal s'est produite avec l'utilisation d'un poids de 40% par volume de solution à l'aide d'extrait brut contenant 20% (en poids par poids) de la forskoline. Nous calculons que l'application de 400 pi d'une forskoline finale de 8% (en poids par volume, 40% x 20%) solution entraînerait la livraison d'environ 80 uM de forskoline à la peau du dos de chaque application. Bien sûr, beaucoup de la dose délivréen'est pas absorbé par la peau, au lieu d'être absorbé par la fourrure environnante ou de tomber de l'animal au moment de l'application. Ainsi, il est difficile de rendre compte de la dose exacte réalisé que les animaux reçoivent à chaque application du médicament. Néanmoins, lorsqu'il est appliqué de cette manière, les résultats forskoline dans l'induction d'enzymes solide de pigment dans la peau et la production de l'eumélanine. En fait, K14-SCF animaux de vulgarisation transgéniques ont démontré clairement l'assombrissement de la peau après la deuxième application (figure 1C).

Bien que nous ayons précédemment publié assombrissement de la peau à l'application quotidienne du médicament ^1,48-49, nous montrons ici que l'application deux fois par jour est associée à une forte assombrissement de l'épiderme et une protection significative aux UV, ce qui suggère que la mélanisation pharmacologique-induite peut être optimisée par l'administration de l' médicament plus fréquemment qu'une fois par jour. assombrissement de la peau, qui est due à l'eumélanine induction dans l'épiderme, dure aussilongtemps que les traitements de la forskoline topiques sont poursuivies. Même l'application chronique (à travers les trois mois) semblait bien tolérée par la souris ^49. L'augmentation de l'assombrissement de la peau est due à la synthèse de mélanine, plutôt que la prolifération de mélanocytes dans l'épiderme. ^49. Une fois les traitements topiques sont interrompues, la peau s'estompe progressivement à son teint de base (plus de 2-3 semaines) comme mélanine épidermique est perdu avec le renouvellement des kératinocytes normaux. Assombrissement de la peau peut être facilement déterminée par simple inspection visuelle de la souris, mais la couleur de la peau peut être quantifiée objectivement par colorimétrie réfléchissante ^55-56. Cette méthode est une méthode rapide et indolore non invasive de mesure de la couleur de peau. La couleur peut être décrite avec précision en utilisant la L * a * b * (LAB) modèle de l'espace de couleur ^57-58.

Pour ces expériences, nous nous sommes appuyés sur un extrait de racine de brut de l'usine de forskolii coleus, la source naturelle de la forskoline. Cette préparationa été utilisée en raison du coût élevé de la réalisation de ces expériences avec de la forskoline purifié. Cette expérience a, par exemple, nécessaire à peu près 2 g de forskoline totale pour une application deux fois par jour à six animaux pendant cinq jours. 2 g de disponible dans le commerce forskoline purifié par HPLC coûterait plus de $ 20 000, comparativement à moins de 5 $ pour l'extrait brut. Bien que la forskoline purifiée induit mélanine épidermique dans notre modèle animal ^1, nous ne pouvons pas exclure des effets possibles d'autres composés d'origine végétale dans l'extrait de racine brute, y compris des alcaloïdes, des phénols et tanins. En fait, le travail antérieur utilisant cochon de Guinée ou explants de peau humaine a suggéré que les composés de l'extrait de racine de brut peuvent favoriser l'absorption cutanée de forskoline ^59. Jusqu'à présent, cependant, l'identité et le mécanisme de ces composés restent inconnus. Ainsi, nous ne pouvons pas exclure des effets d'autres composés présents naturellement dans l'extrait de racine de brut modification.

Le mélange est composé de forskolineun liquide brun foncé avec un arôme d'épices comme attrayant qui est facile à appliquer sur la peau pour une application topique. Etant donné que les matières insolubles ont été enlevées, l'application quotidienne ne laisse aucune formation de croûtes ou des dépôts, une fois absorbé par la peau. Bien que l'extrait de racine brute est brun foncé quand il est préparé de cette manière, assombrissement de la peau induite par le médicament n'est pas simplement un effet de teinture, comme l'a démontré par les faits que l'application topique du composé sur les animaux incapables de mélanisation de la peau (par exemple Mc1r ^{e / e} tyrosinase animaux albinos déficientes ou souris non transgéniques qui n'ont pas les mélanocytes de l'épiderme) n'ont eu aucun effet sur ​​assombrissement de la peau (figures 1B et 2E). Nous considérons ces expériences comme une preuve de concept manifestations que la manipulation de l'AMPc dans la peau peut provoquer une pigmentation foncée de protection-UV de la peau. Cependant, il est peu probable que l'administration topique de la forskoline est une option thérapeutique possible ou pratique en raison de la nature non spécifique du médicament. Jendiscriminate et l'activation non ciblée de cyclases cyclases et l'induction de l'AMPc pourrait s'attendre à une toxicité importante. Fait important, d'autres ont montré que l'administration topique d'un inhibiteur de phosphodiesterase 4 (rolipram), puissamment régulée à la hausse de la mélanine dans le modèle animal prolongement K14-SCF, ce qui prouve que l'AMPc et de la mélanisation cutanée induction peuvent être atteints par le ciblage pharmacologique alternatif ^35. De toute évidence, avant manipulation actualité des taux d'AMPc dans la peau pourrait être traduit à usage humain, sa sécurité devra être soigneusement évaluée. Néanmoins, nos données suggèrent fortement que la mélanisation pharmacologiquement induite est anti-UV tel que déterminé par la dose érythémateuse minimale d'essai (MED).

En résumé, l'administration topique de la forskoline, un activateur adénylcyclase, a entraîné une forte mélanisation de l'épiderme d'un modèle murin de l'humain à la peau claire basée sur l'AMPc défectueux signalisation bascourant d'un défaut de la mélanocortine 1 récepteur (Mc1r). Mélanisation épidermique était anti-UV, tel que mesuré par la dose érythémateuse minimale d'essai (MED). Nous émettons l'hypothèse que la manipulation pharmacologique de l'AMPc peut non seulement sauvetage anti-UV eumelanization de l'épiderme, mais d'autres réponses de protection UV Mc1r-dépendantes ainsi.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Les auteurs tiennent à remercier Malinda Spry pour l'assistance technique. Nous reconnaissons également les sources de financement actuelles et passées: l'Institut national du cancer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), le Fonds de recherche Wendy Will cas du cancer, la Fondation Markey Cancer, le Réseau de l'enfance et la Jennifer et Dickens Research Foundation mélanome David.