Method Article
Cerrahi renal kitle 5/6th kaldırarak Lewis sıçan kronik böbrek hastalığı (KBH) kurmak için bir iki aşamalı yöntemi açıklanmıştır. Cerrahi işlem kombinasyonu, NOS-inhibisyonu ve yüksek tuz diyeti nedensel mekanizmaları ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi çalışma izin, insan CKD benzeyen bir model yol açar.
Kronik böbrek hastalığı (KBH) küresel bir sorundur. CKD ilerleme Yavaşlama önemli bir sağlık önceliktir. CKD dengesinin karmaşık bozukluklar ile karakterize olduğundan, bütünleştirici hayvan modellerinde CKD gelişimi ve ilerlemesi çalışma için gereklidir. CKD CKD ve yeni terapötik girişimlerin gelişimini incelemek için, insan CKD çeşitli yönleri benzeyen, 5/6th nefrektomi ablasyon modeli, ilerleyen böbrek hastalığının bilinen bir deneysel model kullanın. Renal kitle brüt azalma ilerici glomerüler ve tübülo-interstisyel yaralanma, kalan nefron kaybı ve sistemik ve glomerüler hipertansiyon gelişimine neden olur. Ayrıca, ilerleyen böbrek içi kılcal kaybı, enflamasyon ve glomerüloskleroz ile ilişkilidir. Için risk faktörleri her zaman endotel fonksiyonu üzerindeki etkisi CKD. Bu taklit için, nitrik oksit (NO) azalması ve yüksek tuz diyeti ile renal kitle 5/6th çıkarılması birleştirir. Varış ve iklimlendirme sonra, hayvanlar yenidenSağ taraflı uninephrectomy takiben 4 haftalık bir süre için içme suyu (20 mg / L) ile desteklenmiş bir NO sintaz inhibitörü (NG-nitro-L-arginin) (L-NNA), alma işlemine. Bir hafta sonra, bir alt toplam nefrektomi (SNX) sol tarafta gerçekleştirilir. SNX sonra, hayvanlar, 4 haftalık bir süre için daha içme suyu (20 mg / L) LNNA takiben iki gün süre ile iyileşmeye bırakıldı edilir. Zemin chow (zaman çizgisi bkz. Şekil 1) de ilave bir yüksek tuz diyeti (% 6), deney boyunca devam edilir. Böbrek yetmezliğinin ilerlemesi plazma üre, sistolik kan basıncı ve proteinüri ölçerek zaman içinde takip eder. SNX sonra altı hafta, böbrek yetmezliği geliştirdi. Böbrek fonksiyonu 'altın standart' inulin ve para-amino hippurik asit (PAH) temizlik teknolojisi kullanılarak ölçülür. CKD Bu model bir glomerüler filtrasyon hızı (GFH) azalma ve etkin renal plazma akışı (ERPF), hipertansiyon (sistolik kan basıncı> 150 mmHg), proteinüri (> 50 mg/24 saat ile karakterizedir) Ve hafif üremi (> 10 mM). Histolojik özellikleri inflamasyon, tübüler atrofi ve fibrozis ve kalan nüfus (<% 10) içinde sağlıklı glomerül büyük azalmaya yol açan fokal glomerüloskleroz yansıyan tübülo-interstisyel zarar içerir. Takip SNX CKD daha fazla ilerleme gösteren 12 hafta sonrasına kadar.
Ilerici doğa, takip eden son dönem böbrek hastalığı ve ilişkili kardiyovasküler morbidite ve mortalite nedeniyle, CKD giderek büyüyen bir halk sağlığı sorunu 1'dir. CKD ilerleme Yavaşlama bu nedenle önemli bir sağlık önceliktir. CKD dengesinin karmaşık bozukluklar ile karakterize olduğundan, bütünleştirici hayvan modellerinde CKD gelişimi ve ilerlemesi çalışma için gereklidir. Böbrek birbirleri ile etkileşim farklı hücre tipleri arasında, geniş bir aralık oluşur. Bu karmaşıklık in vitro taklit edilemez.
CKD yeni tedavi girişimleri incelemek, insan CKD 2,3 çeşitli yönleri benzeyen 5/6th nefrektomi ablasyon modeli, ilerleyen böbrek hastalığının iyi bilinen bir deneysel model, kullanın. Renal kitle brüt azalma ilerici glomerüler ve tübülo-interstisyel yaralanma, kalan nefron kaybı ve sistemik ve glomerüler hipertansiyon gelişimine neden olur. Bu Progr ile ilişkiliessive böbrek içi kılcal kaybı 4, inflamasyon ve glomeruloskleroz. Için risk faktörleri her zaman endotel fonksiyonu 5 üzerindeki etkisi CKD. Biz CKD gelişimi nispeten dirençli olan bir fare suşu (Lewis) kullanılan ve bu nedenle nitrik oksit (NO) azalması 6, 7, 8 ve yüksek tuz diyeti 9, renal kitle 5/6th çıkarılması birleştirilir. Varış ve iklimlendirme sonra, hayvanlar iki gün sonra L-NNA devamı ile sağ taraflı uninephrectomy (UNX) takip 4 haftalık bir süre için içme suyu (20 mg / L) için ilave bir NO sentaz inhibitörü (L-NNA), almak . Bir hafta sonra, renal kitle 2/3rds subtotal nefrektomi (SNX) yani kaldırma sol tarafında yapılır. SNX sonra, hayvanlar, 4 haftalık bir süre için içme suyu içinde 20 mg / L, LNNA yine ardından 2 gün süre ile iyileşmeye bırakıldı edilir. Zemin chow (zaman çizgisi bkz. Şekil 1) de ilave bir yüksek tuz diyeti (% 6), deney boyunca devam edilir. TO yandaki UNX gerçekleştirmek için bir neden ve sol taraftaki SNX böbrek damarlarının daha kolay böbrek vücut dışında maruz bırakıldığında çok damarları germeden böbrek erişimi kolaylaştırır sol taraftaki uzun olmasıdır . Literatürde, model bir hafta sonra 10,11,12 sağ böbrek UNX ardından, sol böbrek kutup önce kaldırılır olduğu tarif edilmektedir. Bizim ellerde bu model böbrek yetmezliği çok daha hızlı bir gelişme gösterdi, ama aynı zamanda böbrek fonksiyon kaybı çok daha büyük bir değişim. Böbrek yetmezliğinin ilerlemesi plazma üre, sistolik kan basıncı ve proteinüri ölçerek zaman içinde takip eder. SNX sonra altı hafta, böbrek yetmezliği, geliştirmiştir glomerüler filtrasyon hızında belirgin bir azalma (% 69) ve etkin renal plazma akışı (% 62) 13 hipertansiyon (sistolik kan basıncı> 150 mmHg), proteinüri (ile karakterize> 50 mg/24 saat) ve hafif üremi (> 10 mM). Histolojik özellikleri tubul içeriro-interstisyel zarar inflamasyon, tübüler atrofi ve fibrozis ve kalan nüfus (<% 10) içinde sağlıklı glomerül büyük azalmaya yol açan fokal glomerüloskleroz yansıyan. Takip 12 hafta sonrasına kadar SNX terapötik girişimlerin değerlendirilmesi için bir fırsat penceresi sağlayan, CKD daha fazla ilerleme gösterir.
Tüm deneyler Utrecht deneysel hayvan komitenin hayvan deneysel etik kılavuz çizgileri uygun olarak yürütülür. Protokol yazarın kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır.
CKD 8 hafta yaşında erkek doğuştan Lewis sıçan (Charles River, Sulzfeld, Almanya) indüklenir. Sıçanlar bir ışık, sıcaklık ve nem kontrollü bir ortamda, standart koşullar altında muhafaza edilmektedir.
1. Cerrahi Hazırlık
2. Sağ Taraf Uninephrectomy
3. Sol Taraf Ara toplam nefrektomi
4. Sham Cerrahi
Subtotal nefrektomi sonra, toplam böbrek kütlesinin yaklaşık 1/6th bırakılır. Şekil 4 önceki iki deneylerde ortalama ve standart sapma ile doğru böbrek Çıkarılan parçanın ağırlığını gösterir. Bir UNX sonra hafta, sol böbrek hipertrofisi oluşur tutmalı; belirten 5/6th kaldırma daha az doğru böbrek her zaman sonuçlarının ağırlığına göre hesaplanan kaldırılması gerekiyor ağırlık. Bu ameliyat sırasında sol böbrek ağırlığını belirlemek mümkün olmadığı için ancak, bu orijinal böbrek kütlesinin yaklaşık 5/6th kaldırmak için en doğru yoldur.
Zamanla, CKD ile sıçan hipertansiyon, üremi, anemi, proteinüri ve GFR ve ERPF önemli bir azalma gelişir. 6 hafta sonra, kurulan CKD, kurtarma yöntemlerinin belirlenmesi için zaman noktası uygun bir geliştirmiştir. Zamanla, hipertansiyon ve proteinüri güçlü ilerleme görülmektedir ise hematokritve böbrek fonksiyon (GFH ve ERPF) hafif bozulma (Şekil 5) göstermektedir. Bizim deneylerde odaklanmak değil diğer belirtiler kalsiyum-fosfat ve lipid metabolizmasında bozukluklar, ve diğerleri sayılabilir. Sıçanların suşu bağlı olarak, CKD gelişimi belirgin şekilde 14, 15, 2 değişebilir. Biz yüksek tuz diyet ve hipertansiyon ve endotel disfonksiyonu ikna etmek için bir engelleyici NO ekledi.
Böbrek yetmezliğinin ilerlemesi idrar toplanması (protein ve kreatinin miktarının ölçümü için), kan (plazma üre ve kreatinin) ve sistolik kan basıncı ile izlenir. Biz telemetri yerine kuyruk manşet pletismografisi kullanırken hipertansiyon bu gelişme daha doğrusu takip edilebilir fark. Kreatinin klirensi hesaplanır ama tarafından renal fonksiyon belirlemek için altın standart yöntemin önemini vurgulayan, nedeniyle sıçanlarda 16 geniş tübüler kreatinin salgılanmasına GFR düşüş hafife eğilimi olabilir inulin ve PAH boşluk 17, 18, 19. Koeners ve ark. Tüm işlem 20 açıklanmıştır. Inulin ve PAH boşluk idrar örneğinde kendi konsantrasyonu (U), idrar akış hızı (V), ve plazma konsantrasyonu (P) hesaplanır. Bu plazma kreatinin, üre plazma veya kreatinin klirensi 13 değişikliklerden daha az belirgin iken, daha önce, klasik bir temizleme teknolojileri kullanarak bu modeldeki GFR ve ERPF belirgin bir azalma göstermiştir.
Şekil 1. Böbrek fonksiyonu ve sonlandırma zaman noktası belirlemek için L-NNA bir zaman çizgisi, yüksek tuz diyeti, UNX ve SNX. Boyuna ölçümleri gösterilir. Uzun takip zaman SNX sonra gereklidir,% 6 NaCl diyet zaman içinde devam edilebilir.
98fig2.jpg "/>
Şekil 2. Böbreküstü bezi diseksiyonu. Kırmızı çizgi ile işaret olarak böbrek ve böbreküstü bezi ve üst geminin kutup yukarıya doğru hareket arasındaki yağ, yer forseps bu bozmadan böbreküstü bezi kaldırmak için. İnsan vücudu, 1918 Gray'in Anatomisi 20. ABD baskısı adapte Şekil.
Şekil 3,. Ara toplam nefrektomi. Kırmızı çizgiler kenarları kesme gösterir. İnsan vücudu, 1918 Gray'in Anatomisi 20. ABD baskısı adapte Şekil.
Şekil 4. Iki farklı deneylerde subtotal nefrektomi sonra kaldırılır böbrek dokusu yüzdesi. Exp 1, n = 16, Exp 2, n = 23.
CKD sıçanlarda böbrek yetmezliği Şekil 5. Geliştirme 6 hafta SNX sonra sona (sdashed hatları n = 5) vs sağlıklı kontrol (n = 5 pdashed hat) ve CKD sıçan vs sağlıklı TL (n = 8) 12 hafta SNX sonra sona kontroller (• n = 8). CKD sıçan hafta 1 hafta 4 ve yüksek tuz diyeti kadar L-NNA aldı sonlandırma (grafikler gösterilmemiştir) kadar. SNX GFR (E) ve ERPF (F) 13 hipertansiyon (tailcuff pletismografi ile ölçülür) (A), üre (B), anemi, (C) ve proteinüri (D) ve belirgin bir azalma neden olur. * Bonferroni grafikleri A, B ve D için son test ile iki yönlü ANOVA ile test her noktası için p <0.05 vs sağlıklı kontrol belirtilmiştir. Grafikler C, E ve F bir iki kuyruklu test edilmiştir6 ve 12 hafta süre noktası için t-testi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Yüksek tuz diyeti ve geçici NOS inhibisyonu ile birlikte Lewis sıçanlarda renal kitle, bir 5/6th cerrahi olarak çıkarılması insan CKD benzer CKD bir modeli yol açar ve CKD medikal tedavinin nedensel mekanizmaları ve etkinliğinin çalışma sağlar.
5/6th nefrektomi modeli CKD, iyi bilinen ve geniş çapta tarif modelidir. Ancak, sadece böbrek kitle 5/6th kaldırarak tüm sıçan suşları acil böbrek yetmezliğine yol açmaz. Biz GFP + Lewis sıçan 21 durumu gibi CKD hücre bazlı tedavilerin etkilerini incelemek için Lewis sıçan kullanmak alıcı uygulanan donör hücrelerinin hücre-izleme (nonGFP +) sıçan sağlar. Lewis sıçan yavaş diğer suşlar 22, 15 'e kıyasla, böbrek hasarı ve CKD gelişimi geliştirilmesine oldukça dayanıklıdır. Bu insan CKD çeşitli yönleri benzer beri nedenle NO tükenmesi ve yüksek tuz diyeti ile renal kitle 5/6th çıkarılması kombineyüksek tuz alımı ve endotel disfonksiyonu gibi. Okuyucular yüksek tuzlu diyet ve / veya NO tükenmesi ile 5/6th nefrektomi birleştirerek ihtiyacını deneyler için kullanılan sıçanların gerginlik bağlı olduğunu akılda tutmak gerekir.
Bu, hayvan için daha az külfetli olarak kabul edilir daha az cerrahi ile ilişkili mortalite ile ilişkilidir ve hayvan deneysel komitesi tarafından tercih edilir gibi yerine tek adım prosedürü bir iki aşamalı bir prosedür içinde 5/6th nefrektomi. Biz, dikiş gevşeme, laparotomi yara enfeksiyonu riski ile ilişkili olarak böbrek ulaşmak için deri altı hernisi ve yan kesi göre bağırsaklara yapışıklıklar kanadını kesi yerine laparatomi tercih. Deneysel tasarım laparotomi ile müdahale içeriyorsa Ayrıca, - gibi SNX için kalan böbrek-performans laparotomilerin renal arter içine kemik iliği hücrelerinin yönetimi için deneysel çalışmalarda durum önceden değil birtekrar laparotomiler olarak ferable kaçınılmalıdır.
Renal kitle 5/6th cerrahi olarak çıkarılması ardından, pek çok kritik sorunları ortaya çıkabilir. UNX sırasında çevredeki yağ kolayca ayırmak çünkü böbrek stabilize zorluklar olabilir. Iki yöntem böbrek maruz elde etmek için de kullanılabilir. 1) yavaşça damar yönelik böbreğin alt kutbu aşağı hareket ettirerek böbrek damarları üzerinde kavrama almak için küçük forseps kullanın ve böbrek stabilize kadar dikkatli bir şekilde çekin. 2) dikkatli bir şekilde karın böbrek çekin künt forseps kullanın. Böbrek maruz kaldığı zaman, gazlı bez Bu işlem sırasında ortaya çıkabilecek kanamayı durdurmak için kullanılabilir. Kanama önlemek için, yağ güçlü böbrek bağlı böbrek, alt kutbunda yağ çekerek başlar.
Düğüm kayabilir gibi böbrek damar ve böbrek çıkarıldıktan sonra kanamayı önlemek için böbrek etrafında düğüm arasındaki alan oluşturmak için önemlidirhızla kan ile karın doldurma gelen kan akımı nedeniyle böbrek damarları,. Bir gazlı kanın temizlenmesi ve basınç kanamanın durdurulması için uygulanmalıdır kullanılabilir. Böbrek kavrama ve yeni bir bağ yerleştirmek için forseps kullanın. Kanama durana kadar böbrek damarları takip edilemez zaman, basınç korumak. Karın boşluğunda kanama nedeniyle su kaybını önlemek ve kas ve deri tabakası kapatmadan önce yaklaşık 5 dakika beklemek zorunda fizyolojik tuz 1 ml ekleyin. Şu günlerde dikkatle ekstra sıçan izleyin. Bağ böbrek ama böbrek damarlarının kanama çıkarılmasından sonra hala yerinde olduğunda, bağ uzun uçları damarlarından bağlamak için kullanılabilir.
Kanama devam ederse kutup diseksiyonu sonra, jel köpük pedler tutarak baskılara rağmen, bu büyük olasılıkla büyük bir renal arter veya renal pelvis sakatlığı nedeniyle zaman. Bu kanama, yara yeni jel köpük pedler yerleştirerek taşımak için özen ile durdurulabilirbüyük gemilerin hilusu yakın olduğundan kalıntısı kaldırma, ve uzun bir süre bekliyor sırasında köpük yastık.
Kan 2 gün sonrası cerrahi kadar idrarda izlenebilmektedir. Renal pelvis hasar veya büyük böbrek damar kanamaya devam edildiğinde, hematüri kalıcı bir iz olacaktır. Bu kanamayı durdurmak mümkün olmadığı için ameliyat sonrası kalıcı hematüri ile sıçan ötenazi olması gerekir. Kan renal pelvis içinde pıhtılaşmış vardır ve sonunda tıkanıklığa yol açan, üreter ve mesane yapışmasına neden çünkü hematüri ameliyat sonrası zaman noktası daha sonra da görülürse, bu kadar ameliyat sonrası 2 hafta oluşabilir, sıçan da ötenazi edilmelidir.
Böbrek yetmezliği daha hızlı gelişimi gerekli olduğunda, protokol tersine çevrilebilir, yani ilk olarak bir hafta sonra uninephrectomy takip kutup çıkarın. Bu tersine modeli diğer sıçan suşları kullanılmıştır, örneğin Liu ve ark görün. 23. Alternatif olarak, daha fazla renal kitle kaldırılabilir. Daha fazla renal kitle çıkarılması kanama ve ölüm riskini artırır unutmayın. Korteks güvenli bir böbrek eğrilik üstten kaldırılabilir. Büyük renal arter kanama önlemek için daha fazla medüller doku çıkarmayın. SNX model varyantları renal kitle tek taraflı nefrektomi ile azaltılması ve üç renal arter dalları (infarktüsü modeli) veya her iki böbreğin kutup rezeksiyon veya ligasyonu iki ligasyonu ya vardır. Bu modeller arasındaki farklar kapsamlı Griffin ve Bidani 24 tarafından incelenmiştir. Infarktüsü modeli yüksek renin açıklaması, bir kan basıncı daha fazla akut ve belirgin artış ve daha ilk glomerüler hasara 3 eşlik ediyor. Her iki modelde de, kronik stabil böbrek hastalığı bir devlet 4 boyunca gelişir8 hafta. Renal korteks Pıhtılaşma aynı zamanda renal kütle 25 azaltmak için kullanılabilir.
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Biz onu mükemmel teknik yardım için Krista den Ouden teşekkür ederim. Bu teknik, mali, Hollanda Böbrek vakıf, hibe C06.2174 tarafından desteklenmiştir. MCV Bilimsel Araştırma Hollanda örgütü (NWO) Vidi-hibe 016.096.359 tarafından desteklenmektedir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
L-NNA | Sigma-aldrich | N5501 | |
Spongostan dental: gel foam pads 1x1x1 cm | Johnson&Johnson | Ms0005 | |
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36 | Ethicon | V303H | |
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36 | Ethicon | V392H | |
Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Via local pharmacist ordered by Reckitt Benckiser pharmaceuticals | unknown | |
Equipment | |||
Student Tissue Forceps - 1x2 Teeth 12 cm | Fine Science Tools (FST) | 91121-12 | |
Student Standard Pattern Forceps | FST | 91100-12 | |
Mayo Scissors | FST | 14010-15 | |
2X Semken Forceps | FST | 11008-13 | |
Student Iris Scissors | FST | 91460-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | FST | 12002-14 | |
|
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır