5/6th Nephrectomy em combinação com uma dieta alta de sal e Óxido Nítrico Sintase inibição para induzir o Doença Renal Crônica no Rato Lewis

Um método de duas fases para estabelecer a doença renal crónica (IRC) em ratos Lewis por remoção cirúrgica da massa renal 5/6th é descrito. Combinação do procedimento cirúrgico, NOS-inibição e uma dieta rica em sal leva a um modelo semelhante CKD humano, permitindo estudo dos mecanismos causais e desenvolvimento de intervenções terapêuticas.

A doença renal crônica (DRC) é um problema global. Retardar a progressão da doença renal crônica é uma das principais prioridades de saúde. Desde DRC é caracterizada por desarranjos complexos de homeostase, os modelos animais integrativos são necessárias para estudar o desenvolvimento e progressão de DRC. Para estudar o desenvolvimento de intervenções terapêuticas com DRC e romance em CKD, usamos o modelo de ablação nefrectomia 5/6th, um modelo experimental bem conhecido de doença renal progressiva, assemelhando-se vários aspectos da CKD humano. A redução bruta da massa renal provoca glomerular progressiva e lesão túbulo-intersticial, perda de néfrons remanescentes e desenvolvimento de hipertensão arterial sistêmica e glomerular. Também está associada com a perda progressiva intra capilar, inflamação e glomeruloesclerose. Fatores de risco para DRC invariavelmente impacto sobre a função endotelial. Para simular isso, nós combinamos remoção de 5/6th da massa renal com o óxido nítrico (NO) exaustão e uma dieta rica em sal. Após a chegada e aclimatação, os animais receber um inibidor da sintase de NO (NG-nitro-L-arginina) (L-NNA), suplementado com a água de beber (20 mg / L) durante um período de 4 semanas, seguido de uninefrectomia no lado direito. Uma semana mais tarde, uma nefrectomia subtotal (SNX) é realizada no lado esquerdo. Após SNX, os animais são deixados a recuperar durante dois dias seguidos por LNNA na água de beber (20 mg / L) por um período adicional de 4 semanas. Uma dieta rica em sal (6%), complementado em terra de comida (veja linha do tempo Figura 1), continua durante todo o experimento. A progressão da insuficiência renal é seguida ao longo do tempo medindo a ureia plasmática, pressão arterial sistólica e proteinúria. Por seis semanas após SNX, insuficiência renal desenvolveu. A função renal é medida usando inulina "padrão ouro" e ácido para-amino hipúrico (PAH), tecnologia de apuramento. Este modelo de DRC é caracterizada por uma redução na taxa de filtração glomerular (TFG) e do fluxo plasmático renal eficaz (FPER), hipertensão (pressão sanguínea sistólica> 150 mm Hg), a proteinúria (> 50 mg/24 hr) E uremia leve (> 10 mM). As características histológicas incluem danos túbulo-intersticial reflectida pela inflamação, atrofia tubular, e fibrose e glomeruloesclerose focal conduzindo a enorme redução dos glomérulos saudáveis ​​na população remanescente (<10%). Follow-up até 12 semanas após SNX mostra a progressão da DRC.

Devido ao seu caráter progressivo, resultante final da doença renal em estágio, e morbidade cardiovascular e mortalidade associadas, DRC é um problema crescente de saúde pública ^1. Retardar a progressão da doença renal crônica é, portanto, uma prioridade de saúde. Desde DRC é caracterizada por desarranjos complexos de homeostase, os modelos animais integrativos são necessárias para estudar o desenvolvimento e progressão de DRC. O rim é composto de uma ampla gama de diferentes tipos de células que interagem uns com os outros. Esta complexidade não pode ser mimetizado in vitro.

Para estudar as intervenções terapêuticas em CKD, usamos o modelo 5/6th nefrectomia ablação, um modelo experimental bem conhecido de doença renal progressiva, assemelhando-se vários aspectos da CKD humano ^2,3. A redução bruta da massa renal provoca glomerular progressiva e lesão túbulo-intersticial, perda de néfrons remanescentes e desenvolvimento de hipertensão arterial sistêmica e glomerular. Ela está associada com progrperda essive intrarenal capilar ^4, inflamação e glomeruloesclerose. Fatores de risco para DRC invariavelmente impacto sobre a função endotelial ^5. Usamos uma estirpe de rato (Lewis) que é relativamente resistente ao desenvolvimento de DRC e, portanto, a remoção combinada de 5/6th da massa renal com óxido nítrico (NO) depleção ^{6, 7, 8} e uma dieta rica em sal ^9. Após a chegada e de aclimatação, os animais recebem um inibidor da NO-sintase (L-NNA), suplementado com a água de beber (20 mg / L) durante um período de 4 semanas, seguido de uninefrectomia lado direito (UNX), com continuação da L-NNA após dois dias . Uma semana depois, a nefrectomia subtotal (SNX), ou seja remoção de 2/3rds de massa renal é realizado no lado esquerdo. Após SNX, os animais são deixados a recuperar durante 2 dias, seguido novamente por 20 mg / L na água de beber LNNA por um período de 4 semanas. Uma dieta rica em sal (6%), complementado em terra de comida (veja linha do tempo Figura 1), continua durante todo o experimento. Tele razão para realizar o UNX no lado direito e a SNX no lado esquerdo é que os vasos renais são mais longos no lado esquerdo, que torna mais fácil o acesso ao rim sem esticar os vasos muito quando o rim é exposto fora do corpo . Na literatura, os modelos são descritos em que os pólos do rim esquerdo são removidos em primeiro lugar, seguido por UNX do rim direito, uma semana depois ^10,11,12. Nas nossas mãos este modelo mostrou um desenvolvimento muito mais rápido de insuficiência renal, mas também uma variação muito maior na perda da função renal. A progressão da insuficiência renal é seguida ao longo do tempo medindo a ureia plasmática, pressão arterial sistólica e proteinúria. Por seis semanas após SNX, insuficiência renal desenvolveu, caracterizada pela diminuição acentuada na taxa de filtração glomerular (69%) e do fluxo plasmático renal eficaz (62%) ^{13 de} hipertensão (pressão sanguínea sistólica> 150 mm Hg), a proteinúria (> 50 mg/24 hr) e leve uremia (> 10 mM). Características histológicas incluem Tubuldanos o-reflectida pela inflamação intersticial, atrofia tubular e fibrose e glomeruloesclerose focal conduzindo a enorme redução dos glomérulos saudáveis ​​na população remanescente (<10%). Follow-up até 12 semanas após SNX mostra a progressão da DRC, proporcionando uma janela de oportunidade para a avaliação de intervenções terapêuticas.

Todos os experimentos são executados de acordo com as linhas de orientação éticas animais experimentais da comissão de animal experimental Utrecht. O protocolo é realizada sob a orientação e aprovação dos cuidados com os animais da instituição do autor e da comissão de uso.

DRC é induzida em ratos Lewis consanguíneos machos (Charles River, Sulzfeld, Alemanha) com a idade de 8 semanas. Os ratos são alojados sob condições padrão num ambiente, luz, temperatura e humidade controlada.

1. Preparação da cirurgia

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos:
   • Um tecido estudante forceps 1-2 dentes de 12 centímetros
   • Um estudante fórceps padrão normal
   • 2 Semken forceps
   • Uma tesoura de Mayo
   • Um estudante tesoura iris
   • Um porta-agulha Olsen-Hegar com tesoura
   • Cobertor
2. Confira lista de inventário:
   • Mesa de operação com almofada de aquecimento e lâmpadas
   • O _{2, isoflurano}
   • Tecidos
   • Barbeador
   • Balança
   • Conjunto operacional estéril
   • 5x5 gaze estéril e 10x10
   • Álcool a 70%
   • Solução de NaCl a 0,9%
   • Seringa de 1 ml
   • Agulhas (25G)
   • Gel almofadas de espuma: Spongostan
   • Vicryl 4.0 e 5.0
   • A buprenorfina 0,03 mg / kg (1:10 diluído em salina fisiológica)
   • Gaiola limpa para ratos após cirurgia

2. Direito uninefrectomia Side

1. Desinfetar a mesa com álcool 70%.
2. Lugar rato na caixa de indução e induzir a anestesia com 4% de isoflurano e um fluxo litro de O _2. Nota: dependendo da estirpe de ratos utilizada, pré e peri-operatório analgesia são prescritos, isso precisa ser discutido com o veterinário local.
3. Transferir rato para mesa e lugar nariz em cone. O cone de nariz e de rato são colocados numa almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato. O rato is ventilados com uma mistura de 2% de isoflurano e 1 litro _de O _2.
4. Raspar o flanco do rato e desinfecção com álcool. Lavar e desinfectar as mãos e usar luvas cirúrgicas estéreis. Usar uma touca de cabeça e uma máscara. Faça por 1 - 1,5 centímetros incisão paralela às costelas usando uma pinça e tesouras sem corte anatômico. Expor o rim por dissecção romba dos músculos das costas.
5. O pólo inferior do rim é visível, use com cuidado as pequenas pinças contundentes para prender o tecido adiposo perirenal. Exteriorizar o rim, puxando suavemente sobre a gordura perirenal com uma pinça. Tome cuidado para não perturbar a glândula adrenal durante este procedimento. A glândula supra-renal pode ser facilmente removido por uma pinça de colocação no local medial e no tecido adiposo e movido suavemente para cima entre a glândula supra-renal e do rim, conforme ilustrado na Figura 2.
6. Coloque renal suavemente sobre gaze e clara em torno do tecido adiposo e conjuntivo. Identificar a artéria renal e veia e colocar uma ligadura (5.0vicryl) com um único nó ao redor dos vasos, mas não amarrar o nó.
7. Mova o nó frouxo cuidadosamente ao longo dos vasos em direção à aorta por aproximadamente 0,5 cm, para criar espaço entre o rim eo nó. Isto é feito para evitar que a ligadura de escorregar após o corte.
8. Amarrar o nó com dois nós de casal. Se a perfusão é interrompida, a cor do rim mudará imediatamente para castanho. Não corte as extremidades da ligadura.
9. Cortar os vasos renais próximos do rim e remover o rim. Puxe delicadamente as longas extremidades da ligadura para verificar se há sangramento dos vasos renais. A ligadura deve permanecer no local na embarcação. Corte as extremidades longas da ligadura. Note, os vasos renais remanescentes será recolhido para dentro da cavidade abdominal imediatamente.
10. Blot rim retirado secar e pesar.
11. Fechar a incisão do músculo esquelético com o funcionamento de suturas com Vicryl 5.0. Injectar 0,10 ml (0,03 mg / kg), a buprenorfina im no membro posterior. Feche apele com Vicryl 4.0 com sutura intradérmica. Isto impede que os ratos de abertura da ferida. Nota: devido à depressão respiratória em ratos Lewis, que só dão analgesia pós-operatória, pouco antes de desligar o isoflurano.
12. Abrigar o rato em uma gaiola solitária limpo com fácil acesso à comida e água. Coloque a gaiola metade sobre o aquecimento pad O / N e verifique o rato cuidadosamente no dia seguinte. Quando a ferida é fechada e o rato é activo, que é, normalmente, compreendida entre 6 e 12 horas após a cirurgia, os ratos podem ser colocados de volta no alojamento de grupo.

3. Lado Esquerdo nefrectomia subtotal

1. Sete dias depois, as mesmas preparações são feitas no lado esquerdo como para o lado direito, tal como descrito 2,1-2,5. Antes da cirurgia, é calculada a quantidade de tecido renal, que precisa de ser removido correspondente a aproximadamente 2/3RDS do peso do rim direito. Prepare a pequenos pedaços de espuma de gel (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) antes da cirurgia.
2. Coloque uma tesoura afiada em torno do pólo superior do rim esquerdo e ressecar o pólo superior de um acidente vascular cerebral (para localização tesoura, ver Figura 3). Cubra imediatamente com um pedaço de espuma de gel e de exercer uma pressão ligeira com uma gaze estéril.
3. Repita com o pólo inferior do rim como em 3.3.
4. Elevador rim para impedir a coagulação na pele. Manter a pressão suave em ambos almofadas de espuma de gel com gaze estéril até parar de sangrar. Quando o sangramento persistir, adicionar uma outra almofada de espuma.
5. Coloque o restante do rim com almofadas de espuma de gel aderente dentro do abdômen. Feche o músculo ea pele e siga 2,9-2,12.

4. Sham Cirurgia

1. Sham controles operados submetidas ao mesmo procedimento, a fim de expor os rins. Em vez de extirpar o rim ou o corte dos pólos, uma semana depois, ambos os rins estão decapsulated em um intervalo de uma semana, tomando cuidado para não perturbar as glândulas supra-renais. Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios são identical a 2.11 e 2.12.

Após a nefrectomia subtotal, aproximadamente 1/6th da massa renal total é para a esquerda. Figura 4 mostra o peso da parte removida do rim direito com média e desvio padrão, em duas experiências anteriores. Deve-se ter em mente que, durante a semana depois da UNX, hipertrofia do rim esquerdo ocorre, indicando que o peso que deve ser removido calculado com base no peso do rim direito sempre resulta em menos do que a remoção 5/6th. No entanto, uma vez que não é possível determinar o peso do rim esquerdo durante a cirurgia, esta é a maneira mais precisa de remover aproximadamente 5/6th da massa renal inicial.

Ao longo do tempo, os ratos com DRC desenvolver hipertensão, uremia, anemia, proteinúria e uma diminuição significativa da taxa de filtração glomerular e FPER. Após 6 semanas, CKD estabelecido desenvolveu, a ponto do tempo adequado para testar intervenções de resgate. Ao longo do tempo, um forte progressão da hipertensão e proteinúria é observada, enquanto o hematócritoe função renal (TFG e FPER) mostram a deterioração moderada (Figura 5). Outros sintomas que não focar em nossos experimentos incluem distúrbios do cálcio-fosfato e metabolismo lipídico, e muitos outros. Dependendo da linhagem de ratos, o desenvolvimento de DRC pode variar acentuadamente ^{14, 15, 2.} Nós adicionamos a dieta rica em sal e um bloqueador NO para induzir hipertensão e disfunção endotelial.

Progressão da insuficiência renal é controlada pela coleta de urina (para medição da quantidade de proteína e creatinina), sangue (plasma uréia e creatinina) e pressão arterial sistólica. Percebemos que o desenvolvimento da hipertensão pode ser seguido de forma mais precisa quando se utiliza telemetria em vez de cauda cuff pletismografia. Clearance de creatinina pode ser calculada, mas tende a subestimar o declínio da taxa de filtração glomerular devido à extensa secreção tubular de creatinina em ratos ^16, sublinhando a importância do método padrão-ouro para determinar a função renal por inulina e depuração de PAH ^{17, 18, ​​19.} Koeners et ai. descrito o procedimento completo ^20. Inulina e depuração de PAH são calculados a partir da concentração na amostra de urina (L), a taxa de fluxo de urina (V) e a sua concentração plasmática (P). Nós já mostrou uma redução acentuada da taxa de filtração glomerular e FPER neste modelo usando a tecnologia de depuração clássico, enquanto este era menos evidente a partir de mudanças na creatinina plasmática, uréia plasmática ou depuração da creatinina ^13.

Figura 1. Linha do tempo de L-NNA, dieta rica em sal, UNX e SNX. Medições longitudinais para determinar a função renal e terminação ponto do tempo são indicados. Ao longo follow-up é necessária após SNX, 6% NaCl dieta pode ser continuado ao longo do tempo.

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Figura 2. Dissecção da glândula adrenal. Para remover a glândula adrenal sem perturbá-la, coloque uma pinça na gordura entre o rim ea glândula adrenal e movimento a partir do navio pólo para cima, para o topo, como indicam pela linha vermelha. Figura adaptada a partir da edição 20 dos EUA de Anatomia de Gray do Corpo Humano, 1918.

Figura 3. Nefrectomia subtotal. As linhas vermelhas indicam arestas cortantes. Figura adaptada a partir da edição 20 dos EUA de Anatomia de Gray do Corpo Humano, 1918.

Figura 4. Porcentagem de tecido renal removido após nefrectomia subtotal em dois experimentos diferentes. Exp. 1, n = 16, exp 2, n = 23.

Figura 5. Desenvolvimento de insuficiência renal aguda em ratos IRC encerrado 6 semanas após SNX (linhas sdashed n = 5) versus controlos saudáveis ​​(linhas pdashed n = 5) e ratos DRC terminada 12 semanas após SNX (£ n = 8) vs saudável • controlos (n = 8). Ratos DRC recebeu L-NNA até 4 ª semana e dieta rica em sal a partir da semana 1 até o término (não mostrado nos gráficos). SNX induz hipertensão (medido por pletismografia tailcuff) (A), uremia (B), anemia (C) e proteinúria (D) e acentuada redução da taxa de filtração glomerular (E) e FPER (F) ^13. * Indicado p <0,05 versus controles saudáveis ​​para cada ponto de tempo testado por two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni para os gráficos A, B e D. Gráficos C, E e F são testados com um bicaudalteste t para 6 e 12 semanas ponto de tempo. Clique aqui para ver a figura maior .

A remoção cirúrgica do 5/6th da massa renal em ratos Lewis, combinada com uma dieta rica em sal e inibição temporária NOS leva a um modelo de doença renal crônica que se assemelha CKD humana e permite o estudo dos mecanismos causais e eficácia de intervenções terapêuticas em CKD.

O modelo de nefrectomia 5/6th é um modelo bem conhecido e descrito extensivamente para DRC. No entanto, a simples remoção 5/6th da massa renal não levar à insuficiência renal imediato em todas as cepas de ratos. Usamos ratos Lewis para estudar os efeitos de terapias baseadas em células em DRC como a disponibilidade de GFP + ²¹ ratos Lewis permite célula de localização de células dadoras administrados no receptor (nonGFP ⁺⁾ de rato. A ratazana Lewis é relativamente resistente ao desenvolvimento de lesão renal e desenvolvimento de DRC é lento em comparação com outras estirpes ^{22, 15.} Portanto, a remoção combinada de 5/6th da massa renal com NO depleção e uma dieta de elevado teor de sal uma vez que este se assemelha a vários aspectos da DRC humanocomo elevada ingestão de sal e disfunção endotelial. Os leitores devem ter em mente que a necessidade de uma combinação de dieta nefrectomia 5/6th com elevado teor de sal e / ou NO depleção depende da estirpe de ratos utilizados para as experiências.

Foi realizada a nefrectomia 5/6th num procedimento de dois passos em vez de um procedimento de um passo, como este é considerado menos onerosa para o animal, é associado com menos de mortalidade relacionada com cirurgia e é preferido pela nossa comissão experimental de animais. Nós preferimos incisão lateral ao invés de laparotomia para alcançar os rins como laparotomia está associado com um maior risco de infecção da ferida, o afrouxamento de pontos, hérnia subcutânea e aderências aos intestinos, em comparação com incisão no flanco. Além disso, se a concepção experimental envolve uma intervenção com laparotomia - como é o caso nos nossos estudos experimentais para a administração de células da medula óssea para a artéria renal dos laparotomias rim remanescente para executar SNX não é préveis como laparotomias repetidos devem ser evitados.

Após a remoção cirúrgica do 5/6th da massa renal, pode ocorrer vários problemas críticos. Durante UNX pode haver dificuldades, estabilizando-o uma vez que o rim gordura envolvente irá separar facilmente. Dois métodos podem ser usados ​​para obter o rim exposta. 1) Use uma pinça menores para obter domínio sobre os vasos renais, movendo suavemente para baixo do pólo inferior do rim para a vasculatura e puxe com cuidado até que você pode estabilizar o rim. 2) Use uma pinça sem corte para puxar cuidadosamente o rim para fora do abdômen. Quando o rim é exposto, gaze pode ser usado para deter a hemorragia que pode ocorrer durante o procedimento. Para prevenir o sangramento, comece a puxar a gordura no pólo inferior do rim, onde a gordura está fortemente ligado ao rim.

É importante para criar um espaço entre o nó em torno vaso renal e rim para impedir o sangramento após a remoção do rim, sendo o nó pode escorregaros vasos renais, devido ao fluxo de sangue que chega rapidamente, enchendo o abdômen de sangue. Uma gaze poderá ser usado para remover o sangue e pressão deve ser aplicada para parar a hemorragia. Utilização fórceps para agarrar o renal e colocar um novo ligadura. Quando os vasos renais não pode ser rastreada, manter a pressão até que o sangramento é interrompido. Adicionar 1 ml de salina fisiológica para evitar a desidratação devido ao sangramento na cavidade abdominal e esperar cerca de 5 min antes de fechar a camada muscular e da pele. Monitorar rato com cuidado extra para os dias seguintes. Quando a ligadura está ainda no lugar após a remoção do rim, mas vasos renais são hemorragias, as longas extremidades da ligadura podem ser utilizados para amarrar os vasos.

Quando após a dissecção dos pólos, apesar da pressão segurando almofadas de espuma de gel se o sangramento persistir, é provável devido a uma lesão de uma artéria renal grande ou pelve renal. Esse sangramento pode ser interrompido, colocando novas almofadas de espuma de gel sobre a ferida, tomando cuidado para não se movera almofada de espuma durante o levantamento do remanescente vez que os navios maiores estão perto do hilo, e esperando por um longo período.

O sangue pode ser rastreada na urina até dois dias após a cirurgia. Quando a pelve renal está danificada ou um grande vaso renal persiste a sangrar, haverá um traço persistente de hematúria. Ratos com hematúria persistente após cirurgia precisam ser sacrificados uma vez que não é possível parar o sangramento. Se hematúria é observada a um ponto temporal mais tarde, após a cirurgia, o que pode ocorrer até 2 semanas após a cirurgia, o rato deve também ser sacrificados uma vez que o sangue coagulado tem dentro da pélvis renal e eventualmente entupir o ureter e da bexiga, conduzindo à obstrução.

Quando é necessário um desenvolvimento mais rápido de insuficiência renal, o protocolo pode ser invertida, isto é, em primeiro lugar retirar os pólos uninefrectomia seguido por uma semana mais tarde. Este modelo tem sido utilizado invertida em outras estirpes de rato, ver por exemplo Liu et ai. ^{23, que descreve um aumento de três vezes em uréia e uma diminuição de quase quatro vezes na creatinina sérica em duas semanas após a cirurgia. Alternativamente, a massa mais renal pode ser removido. Tenha em mente que a remoção de mais massa renal irá aumentar o risco de hemorragias e morte. Córtex pode ser removido com segurança a partir do topo da curvatura do rim. Não retirar mais tecido medular para evitar o sangramento das grandes artérias renais. Variantes do modelo SNX são a redução da massa renal por nefrectomia unilateral e ou ligadura de dois dos três ramos das artérias renais (modelo de infarto) ou ressecção ou ligadura dos pólos de ambos os rins. As diferenças entre esses modelos têm sido extensivamente investigadas por Griffin e Bidani 24. O modelo de enfarte é acompanhado por uma maior libertação de renina, um aumento mais pronunciado e aguda da pressão sanguínea e lesão glomerular 3 mais inicial. Em ambos os modelos, um estado de doença renal crónica estável desenvolve ao longo de 4 a8 semanas. Coagulação do córtex renal também pode ser utilizado para reduzir a massa renal 25.}

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecemos Krista den Ouden pelo seu excelente assistência técnica. Esta técnica foi apoiado financeiramente pela Fundação do Rim holandês, concessão C06.2174. MCV é apoiada pela organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO) Vidi-concessão 016.096.359.