Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri tarif Drosophila: Tırmanma / DA nöronları dejenerasyon ve tüm beyin bağlar DA nöronlar belirlemek ve saymak için kullanılan tirozin hidroksilaz immün işlevsel etkilerini incelemek için izin verir irkilme-kaynaklı negatif geotaxis testi.

Drosophila melanogaster sinir sisteminde yaşlanma ve patolojik dejeneratif süreçleri incelemek için değerli bir model organizmadır. Deneysel bir sistem olarak sinek avantajları kendi genetik tractability, kısa yaşam süresi ve gözlemlemek ve kantitatif karmaşık davranışları analiz imkanı içerir. Drosophila beynin belirli bir nöron popülasyonları hastalık bağlantılı genlerin ifadesi, Parkinson ve Alzheimer ⁵ insan nörodejeneratif hastalıklar modellemek için de kullanılabilir.

Dopaminerjik (DA) nöronlar yaşlanma insan beyninde en savunmasız nöron popülasyonları arasında yer almaktadır. Parkinson hastalığında (PH), en sık görülen nörodejeneratif hareket bozukluğu, DA nöron hızlandırılmış kaybı lokomotor fonksiyon ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir düşüşe yol açar. Yaş ve çevresel toksinler ek olarak, DA nöronların kaybı kodlama spesifik mutasyonlar şiddetlenirçeşitli genlerin veya organizatörü bölgeleri. Örneğin PD-ilişkili alellerinin belirlenmesi in vivo DA nöronların nörodejenerasyon incelemek için bir model olarak Drosophila kullanımı için deneysel olarak içerir. Örneğin, Drosophila DA nöronlar özetler, insan hastalığı bazı özellikleri, DA nöronların sürekli bir şekilde azalması gibi ve azalan lokomotor fonksiyonunu ² PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin ifadesi. Buna göre, bu model başarılı PH ⁸ potansiyel terapötik hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır.

Tüm yetişkin beyin irkilme-kaynaklı olumsuz geotaxis tepki ve tirozin hidroksilaz immün dayalı bir tırmanma testi DA nöron sayısı izlemek için bağlar: Burada sık Drosophila DA nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kullanılmıştır iki deneyleri tarif farklı yaşlarda. Her iki durumda da, UAS t in vivo sentezlenmesiniDA spesifik nöronlarda ransgenes bir tirosin hidroksilaz (TH) promotör-Gal4 sürücüsü satır ^{3, 10} kullanılarak elde edilebilir.

Burada açıklanan testlerin özgüllüğü dopaminerjik nöronların ³ spesifik ekspresyon elde etmek için tirozin hidroksilaz geninin düzenleyici sekansları yararlanan bir Gal4 sinek hattının kullanımına dayanır. Tirozin hidroksilaz, dopamin sentezinde ilk ve oran-sınırlayıcı aşama katalize eder. In vivo DA nöronların (örnek ⁶ bakınız) tanımlamak için uygun bir aday TH yapma dopamin ile, o, yetişkin sinek beyin örtüşmekte TH immünoreaktivite. Ayrıca, THGal4 salgılama modelini dopa dekarboksilaz gen ayarlayıcı sıralan içerir ve DA nöronlarda sadece transgenik ekspresyonu sağlayan bu DdcGal4 gibi diğer Gal4 hatları, bu daha spesifik olan, ama aynı zamanda ³ glial hücreler serotonerjik nöronların alt gruplarında .

Feany ve Bender (2000) ilk PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin pan-nöronal ifade sta en ilerici kaybını hızlandırır görülmektedirDrosophila rtle bağlı olumsuz geotaxis davranış. Biz expressionof bir α-sinüklein transgen ¹⁰ sürücü DA-nöron spesifik THGal4 satırını kullanarak benzer sonuçlar gözlenmiştir ve bu Nrf2 yolunun nöroprotektif rolünü incelemek için bu fonksiyonel Okuması kullanmış PD ¹⁴ Drosophila modeli. Burada açıklanan belirli tahlil ² ve ³ uyarlanmıştır.

Drosophila beyin (örneğin ¹¹ ve ⁷ için bakınız) konfokal mikroskopi ile tüm beyin bağlar görselleştirilebilir en az 5 farklı topakçıklar halinde düzenlenmiş olan birden fazla 100 da nöronlar (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, PPM3) içerir. Ancak, yaşa bağlı nörodejenerasyon PD-bağlantılı genler mutasyona uğramış nerelerde sinekler gözlenen / insan hastalıkları modellemek için aşırı eksprese değil, ^{9 yaşında, 11} ile Drosophila beyin düşüşler DA nöron sayısı olup olmadığını hala tartışmalıdır5. DA nöronlarda insan α-sinüklein ifadesi gibi bir etkisi vardır ve bu nedenle, PD için bir model olarak kullanılmıştır. Burada DA nöronlar hücre belirteci olarak TH kullanarak bağlar tüm beyin saymak için bir test tarif. Bu deney, ¹³ ve ¹⁰ den adapte edilmiştir.

1. Irkilme indüklenen Negatif Geotaxis Testi

1. Istenen genotip sinekler seçin, onları 20-30 hayvan kohortlarında grup rastgele, cinsiyete göre ayırın ve 2-3 günde bir yeni gıda şişeleri içine çevirmek, test sinekler her set (yani yaş olarak eşleştirilmiş kohort, bir kohort / genotip) haftada en az bir kez.
2. Olumsuz geotaxis test öncesi otuz dakika, CO ₂ sinekler uyutmak ve iki boş gıda şişeleri (Malzeme Tablo) (oda boyutları net bir bant ile açılışlarında katıldı ile yapılan ön etiketli şeffaf plastik tüpler koyun: 19 cm x 2.85 cm). Bizim deneyleri biz genellikle 25 sinekler / tüp kullanın.
   Not. Anestezi iyileşme süresi birkaç saat birkaç dakika değiştirilebilir (örneğin O / N) ve test edilmiş özel genotipleri için optimize edilmelidir.
3. Dikey yüzeyler üzerinde kurutma kağıdı ve bant bir kağıt parçası üzerinde farklı yüksekliklerde (1 ila 20 cm) kabul ete, tezgah dik.
4. Kağıt önünde tüpler yerleştirin: tüpler tüm uyumlu olmalı ve doğru yükseklik ölçümü sağlamak için kağıda olabildiğince yakın olmalıdır.
5. Bir stand (bir pipet kutusu gibi) üzerinde, kağıt 20-30 cm bir mesafede, tüplerin önünde dijital fotoğraf makinesi ("Özel Ekipman" Tablo) yerleştirin, "film" seçeneğini seçin ve start kayıt, bu zamanda da ardışık denemeler arasındaki zaman takip etmek için bir zamanlayıcı başlamalıdır.
6. Sinekler, birkaç saniye (örneğin 10 saniye) ile tüp dokunarak tüpün altındaki toplanır. Bu aşama, bütün deney boyunca (yani aynı süre, aynı gücü, aynı operatör) düzgün bir şekilde yapılmalıdır.
7. 10 sn için dijital kamera ile kayıt sinekler hareketlerini.
8. Bir dakika aralıklarla adımları 1.5-1.7 on dört kez tekrarlayın.
9. Veri analiz:
   1. Yukarıdaki olan sinekler sayısınıKaydedilen filmlerin görsel muayene ile 10 saniye sonra 2 cm işareti.
      Not: Bizim test koşullarında sinekler 'olumsuz geotaxis davranışı şaşırtıcı sonra geçen ilk 10 saniye ötesinde değil mi (yani sinekler onları şaşırtıcı sonra her yöne 10 sn hareket başladı). Minimum mesafe 2 cm olan bu zaman penceresi kontrol sinekler (THGal4 sürücü ifade yani 1 haftalık sinekler, Şekil 1 efsane bakınız) yükseldi. Böylece, farklı yaş ve davranış başlatıldıktan sonra genotip 10 sn sineklerin tırmanma faaliyetleri analiz etmek için bir referans olarak 2 cm işareti kullanılır. Bu parametreler (farklı genetik arka ya da laboratuar koşullarına bağlı olarak, örneğin), test sinekler davranış farklılıkları hesaba katmak için ayarlanması gerekebilir. Bizim test koşullarında, tüm test edilen genotipler kontrol genotip sinekler benzer şekilde daha kötü bir performans veya dikkat edin.
   2. On beş gelen sonuçların ortalaması alındenemeler.
   3. Tüp (=% tırmanma aktivitesi) sinek sayısı yüzdesi olarak ifade ortalama, tekrar sayısını (N) her genotip için test bağımsız kohort sayısına göre verilir
   4. Zaman içinde farklı genotipleri arasında istatistiksel olarak anlamlı değerlendirin. Bu, bir Student t testi (iki genotip karşılaştırırken) veya GraphPad (GraphPad Yazılım, Inc.La Jolla gibi ticari yazılımları kullanarak Bonferroni post-hoc testi (çoklu karşılaştırmalar yaparken) ardından 2-yönlü ANOVA analizi ile gerçekleştirilebilir CA, ABD).

Dikkat

Bu, oda sıcaklığında, aynı ışık koşulları altında, günün aynı zamanda tüm testleri gerçekleştirmek. 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ortamda sinekler tutulması sinekler 'lokomotor davranışları üzerindeki sirkadiyen ritim etkisini kontrol etmek için tavsiye edilir.

2. Tirozin Hidroksilaz İmmünofloresanTüm Beyin Mounts Testi

Çözümler ve tamponlar

Sabitleme çözeltisi: fosfat içinde% 4 paraformaldehit (PFA), salin (PBS) tamponlu

Yıkama tamponu: PBS içinde% 0.1 Triton X-100,

0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl,% 0.1 Triton X-100 ve% 0.5 BSA: tampon engelleme

Montaj ortamı: Mowiol-Dabco (E Harlow, D. Lane, Antikorlar-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, ABD, 10:418 (1988 'de tarif protokolü))

Prosedür

1. Manikür balmumu kaldırmak için yaklaşık 1 dakika 70% EtOH ile dolu bir diseksiyon çanak sinek koyun.
2. Transferi buz gibi soğuk PBS ile dolu bir diseksiyon çanak uçar.
3. Beyin teşrih:
   1. Ventral yüzü yukarı (: kaldır kanatları ve bacakları isteğe bağlı) ile anında yerleştirin.
   2. Vücuttan uzak baş çekin: kullanmak birine forseps setibeyin zarar vermemek için göz altında manikür üzerinde tutmak için vücut ve başka bir üzerinde tutmak
   3. Hortum çıkarın.
   4. Hortum çıkardıktan sonra açık kalan yarık karşı tarafında baş manikür üzerinde tutmak ve beyin baş kapsül kaldırılır kadar ters yönde çekin.
   5. Beyin tüm manikür çıkarın.
   6. Tüm hava dolu trakeal doku kaldırmak, bu aşağıdaki İnkübasyon sırasında yüzen beyin engeller.
4. P-200 pipet ucu kapalı birkaç milimetre kesin ve% 0.1 Triton X-100/PBS çözümü ile dengelenmesi
5. Hazırlanan P-200 pipet kullanarak,% 4 PFA / PBS 0.5 ml ile dolu bir 0.5 ml Eppendorf tüp beyin aktarmak ve diseksiyon tamamlanana kadar buz üzerinde tutmak.
6. 20 dakika oda sıcaklığında beyin Fix: Bir raf üzerinde Eppendorf tüpleri koyarak ve bir nutator raf koyarak hafif bir rotasyon uygulamak.
7. Fiksatif çıkarınP-1000 mikro pipet kullanarak, 0,1% Triton X-100/PBS 0.5 ml, tersine çevirerek karışımı ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe izin verme, bir kez bu yıkama adımı tekrarlayın.
8. İkinci yıkama tamponu çıkarın,% 0.1 Triton X-100/PBS 0.5 ml ekleyin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe izin, bu adım, iki kez tekrarlayın.
9. Yıkama tamponu çıkarın ve beyinleri, oda sıcaklığında 1 saat süre ile (0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl,% 0.1 Triton X-100 ve% 0.5 BSA) bloke tamponu içinde inkübe sağlar.
10. 4 iki gün, ° C, yumuşak rotasyon ile (adım 2.6. Bakınız) için, engelleme çözümü anti-TH antikor 1:100 seyreltme ("özel reaktiflerin Tablosu" na bakınız) ile beyin kuluçkaya yatmaktadır.
11. Adımları 2.7 yıkama tekrarlayın. ve 2.8 ..
12. Nazik rotasyon ile, 4 ° C'de, iki gün boyunca, ikincil antibodyin engelleme çözümü bir 1:200 seyreltme ile beyin dengelenmesi.
13. Adımları 2.7 yıkama tekrarlayın. ve 2.8 ..
14. Şekil 2A'da gösterildiği gibi sürgü hazırlayın:
    1. Birdd 2 cam kapak (24 x 60 mm,. 1.5) montaj medya X 25 ul damla.
    2. Yeri montaj medya slayt ortasında bir boşluk bırakarak ve kurumaya bırakın iki kapak gözlük (boyutu 18 x 18 mm,. 2).
    Not. Sizin konfokal mikroskop sahnede numune tutucu kontrol edin. Sen biter biri (oje ve bant kullanın) bir 22 x 22 mm 1.5 cam kapak takarak cam kapak 25 x 75 mm slayt aynı boyutta yapabilirsiniz.
15. Yıkama tamponu çıkarın, montaj medya 50 ul ekleyin ve beyinleri aşağı yukarı pipetleme ve ile onunla gelmesini sağlayınız.
16. Bir kesim P-200 pipet (adım 2.4) iki lamelleri arasındaki boşlukta slayt için beyin transferi ve hiçbir bir lamel ile bunları kapatın kullanma. 1.5 (Şekil 2A görmek, yönlendirmek için slaytta beyin ^7).
    Not: Numunelerin anterior ve poste de görselleştirme izin vermek için, iki kapak camları arasına monte edilir,beynin posterior tarafı.
17. Tüm hava kaldırmak için bir köşesinden pipet,, montaj medya ile kapak gözlük arasındaki tüm boşluğu doldurmak kuru ve oje ile sızdırmazlık sağlar.
18. Bir konfokal mikroskop kullanarak 1.0 mikron adım boyutu (Drosophila yetişkin beyin dopaminerjik kümelerin anatomik tanımlama için ⁷⁾ ile z ekseni boyunca optik bölümleri bir dizi elde belirli bir kümede dopaminerjik nöron sayısı değerlendirmek.

Bu tahliller PH ¹⁴ bir Drosophila modelinde stres koruyucu Nrf2 yolunun rolünü incelemek için burada açıklanan kullandık. Bu model, bir TH Gal4 sürücü ^{2, 10} ile DA nöronlarda insan α-sinüklein geninin ifadesini dayanır.

Şekil 1 TH Gal4 sürücünün kontrolü altında farklı transgenlerin ifade erkek sinekler bir irkilme-kaynaklı negatif geotaxis (tırmanma) testinin temsili bir sonuç göstermektedir. Tüm genotipler zamanla lokomotor aktivite bir düşüş gösteren test, ancak, PD-bağlantılı, insan α-sinüklein transgen yaştaki kontrolü sinekler göre hızlandırılmış bir düşüş (tek başına TH Gal4 sürücü) sergileyen ifade uçar veya ortak ifade uçar Nrf2 DNA bağlama ortağı Maf-S. Benzer sonuçlar erkek sineklerin gözlendi.

Şekil 2, bir TH immünofloresan tabanlı DA için temsili bir sonucunu göstermektedirnöron sayısı. Şekil in başlığında tarif edilmiş 4 haftalık erkek sinekler beyinlerinde PPL1 nöronların sayısı farklı genetik arka etkisi ölçülür. Α-sinüklein ifade sinekler beyinlerinde PPL1 nöronların küçük ama önemli bir kayıp dikkat edin.

Şekil 1. Belirtilen genotiplerin arasında irkilme indüklenen negatif geotaxis tahlil. Kusaklara yaştaki sinekler bir haftalık aralıklarla lokomotor aktivitesi için test edilmiştir. Tırmanma aktivitesi flakon dokunduktan sonra 2 cm çizgisi üzerinde 10 saniye sinekler sayısını sayarak ve vial içinde bulunan sinek sayısı yüzde olarak ifade bu değer hesaplanmıştır. Veri anlamına gelir göstermek ± 20-30 sinek beş bağımsız kohort sem. Önemi Bonferroni post-hoc testi (p <0.05) ile iki yönlü ANOVA ile değerlendirildi. Aradaki farkTH arasında, α-Synflies ve test edilen diğer üç genotip sinekler 4 ve 5 hafta belirgindi.

Şekil 2. TH immünofloresan DA nöronlar tespiti ve sayısı. A. akış şeması beyin slaytlar hazırlanması için protokol gösteren. Her adımda daha ayrıntılı bir açıklama için metne bakınız. Bir bütün beyin montaj (sağ hemibrain, posterior görünüm) B. Temsilcisi mikrografı TH için immunohistokimyasal. Konfokal z serisi görüntü kümesi (bir 1024 x 1024 formatında bir Leica SP2 konfokal mikroskop, 40X yağ objektif (N / A 1.25), çerçeve ortalama 2, adım boyutu 1 mikron, ile elde edilen ve maksimum projeksiyon olarak derlenmiştir ) gösterilir. PPL1 DA nöron kümesinin konumunu vurgulanır. C. Temsilcisi resuDA nöron için lt TH immün kullanılarak elde sayar. PPL1 küme nöronların sayısı, tek tek her konfokal z serisi. N görüntüleri her genotip için analiz bağımsız örneklerin sayısını temsil inceleyerek değerlendirildi. Veri ortalama ± SEM Önemi Student t testi (* p <0.05) ile değerlendirildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Genotiplerinin: 'con', THGal4 / +; THGal4 / +; 'UAS-Syn', THGal4, UAS
-ΑSynuclein / +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'UAS-Maf-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'keap1 ^EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 ^EY5, 'UAS-α Syn/keap1 ^EY5', THGal4, UAS-αSynuclein / +; THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 ^EY5.

[Barone ark yeniden basılmıştır. 2011) "Hastalık modelleri ve mekanizmaları" ve "açık erişim" politikası ile anlaşarak.]

Deneyleri farklı hastalık bağlı genetik arka ⁽⁵ yorumlanan) yanı sıra yaşlanma DA nöronların bakım yolları veya küçük bileşikleri sinyal, belirli genlerin rolü incelemek için yararlı bir yaklaşım sağlamak Burada anlatılan.

Drosophila irkilme indüklenen Negatif geotaxis davranış bu yöntem özellikle PD-bağlantılı mutasyonlar varlığında farklı genetik arka bölgesi DA nöronların işlevselliği için Okuması işlevsel olarak kullanılmıştır. Farklı çalışmalar arasında bazı farklılıklar (daha ayrıntılı bir tartışma için ¹²⁾ gözlenmiştir. Bu en azından her tüp test sinekler sayısı (sinekler 'kohort karşı tek sinek), CO sonrası iyileşme süresi _2-aracılı anestezi ve ardışık sayısı dahil olmak üzere farklı test set-up ve koşulları, kısmen isnat edilmiştir denemeler (di örnek olarak ⁴ ve ¹¹fferent test set-up). Bu nedenle, bu tür parametreleri kontrol etmek için tavsiye edilebilir ve gerekirse, belirli bir test şartları için onları optimize olabilir.

TH immün / konfokal mikroskobu ile DA nöronlarının miktar THGal4 odaklı GFP ve GFP floresan / konfokal mikroskobu ile DA nöronlarının kimlik dayalı yöntemle birbirinin yerine kullanılmaktadır. Bu iki yöntem, vakaların çoğunda benzer sonuçlar verir, bu DA nöronlarının fonksiyonel durumuna karşı hassas olduğu, ancak, genel olarak, TH immün teknik, ve diğer araştırmacılar tarafından tercih edilmektedir. Daha ayrıntılı bir karşılaştırma için, ¹¹ ve ^10'a bakınız. Bu testte [örnek olarak ¹ görmek] sinek kafaları homojenatlarındaki dopamin seviyeleri ölçülerek tamamlanabilir.

Biz hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz yararlı tartışmalar için teknik yardım ve Gerasimos P. Sykiotis için, sinek hisse senetleri için Christine Sommers Leo Pallanck teşekkür ederim. Bu çalışma MCB için NIH eğitim bursu T32CA009363 tarafından finanse edildi