Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu studieren Drosophila: Das Klettern / startle-induzierten negativen Geotaxis Assay, um die funktionalen Auswirkungen der DA Neurone Degeneration und der Tyrosinhydroxylase Immunfärbung, die zur Identifizierung und zählen DA Neuronen im gesamten Gehirns Halterungen wird studieren können.

Drosophila melanogaster ist ein wertvoller Modellorganismus zur Alterung und pathologischen degenerativen Prozessen im Nervensystem zu studieren. Die Vorteile der Fliege als experimentelles System sind seine genetischen Lenkbarkeit, kurze Lebensdauer und die Möglichkeit zu beobachten und quantitativ zu analysieren komplexe Verhaltensweisen. Die Ausprägung der Krankheitsresistenz-chromosomale Gene in spezifische neuronale Populationen der Drosophila Gehirn, können verwendet werden, um neurodegenerative Erkrankungen wie der Parkinson-und ^Alzheimer-5 zu modellieren.

Dopaminergen (DA) Neurone gehören zu den am stärksten gefährdeten neuronale Populationen in der alternden menschlichen Gehirns. Bei der Parkinson-Krankheit (PD), die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung, führt der beschleunigte Verlust von DA Neuronen zu einer fortschreitenden und irreversiblen Rückgang der Funktion der Bewegungsorgane. Neben Alter und der Belastung durch Umweltgifte, ist der Verlust der DA Neuronen durch spezifische Mutationen in der kodierenden verschärftoder Promotor-Regionen von mehreren Genen. Die Identifizierung solcher PD-assoziierten Allele liefert die experimentelle Grundlage für die Verwendung von Drosophila als Modell zur Neurodegeneration DA Neuronen in vivo zu studieren. Zum Beispiel, der Ausdruck der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen in Drosophila DA Neuronen rekapituliert einige Merkmale der menschlichen Erkrankung, z. B. progressive Verlust von DA Neuronen und sinkende Bewegungsapparates Funktion ^2. Dementsprechend ist dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um potentielle therapeutische Targets in PD ⁸ zu identifizieren.

Hier beschreiben wir zwei Assays, die üblicherweise verwendet wurden, um altersabhängige Neurodegeneration DA Neuronen in Drosophila untersuchen: a Klettern Assay basiert auf der startle induzierten negativen Geotaxis Reaktion und Tyrosin Hydroxylase Immunfärbung der gesamten erwachsenen Gehirn montiert, um die Anzahl von Neuronen überwacht DA in verschiedenen Altersstufen. In beiden Fällen, in vivo-Expression von UAS transgenes speziell in DA Neuronen durch einen Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Promotor-Gal4 Treiberleitung ^{3, 10} erreicht werden.

Die Besonderheit des hier beschriebenen Assays beruht auf der Verwendung eines Gal4 Fliege Linie, die die regulatorischen Sequenzen der Tyrosin-Hydroxylase-Gen Expression in dopaminergen Neuronen ³ erreichen ausnutzt. Tyrosinhydroxylase katalysiert den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in Dopamin-Synthese. TH-Immunreaktivität in der erwachsenen Fliege Gehirn Überschneidungen mit der Dopamin, was TH ein guter Kandidat, um DA Neuronen in vivo (siehe zum Beispiel ⁶⁾ zu identifizieren. Darüber hinaus ist die Expression von THGal4 präziser als andere Gal4 Linien wie DdcGal4, die regulatorischen Sequenzen enthält der Dopa-Decarboxylase-Gen und treibt transgene Expression nicht nur in DA Neuronen, sondern auch in serotonergen Neuronen und Gliazellen Teilmengen von ³ .

Feany und Bender (2000) zum ersten Mal beobachtet, dass pan-neuronale Expression der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen den fortschreitenden Verlust von sta beschleunigtrtle-induzierten negativen Geotaxis Verhalten in Drosophila. Wir haben ähnliche Ergebnisse mit dem DA-Neuron-spezifische THGal4 Linie, um die Expression von α-Synuclein eine transgene ¹⁰ fahren beobachtet und verwendet diese funktionelle ausgelesen, um die neuroprotektive Rolle des Nrf2-Signalweg in dieser Studie Drosophila-Modell der PD ^14. Die spezifischen Assay hier beschriebenen ² und ³ angepasst.

Die Drosophila Gehirn enthält mehr als 100 DA Neuronen, in mindestens 5 verschiedenen Clustern angeordnet (pPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), die visualisiert werden in ganze Gehirn Halterungen durch konfokale Mikroskopie können (siehe zum Beispiel ¹¹ und ^7). Es ist noch umstritten, ob die Anzahl der DA Neurone im Gehirn Drosophila mit dem Alter abnimmt ^{9, 11,} jedoch altersabhängige Neurodegeneration bei Fliegen beobachtet wird, wo PD-chromosomale Gene mutiert worden / überexprimiert um menschliche Krankheiten zu modellieren5. Die Expression von humanen α-Synuclein in DA Neuronen hat eine solche Wirkung und damit als Modell für PD verwendet worden. Hier beschreiben wir einen Test für DA Neurone im gesamten Gehirns zählen Aktivierungen mit TH als Zell-Marker. Dieser Test wurde von ¹³ und ¹⁰ angepasst.

1. Startle-induzierte Negative Geotaxis Assay

1. Wählen Fliegen des gewünschten Genotyps, trennen sie nach Geschlecht, nach dem Zufallsprinzip Gruppe sie in Kohorten von 20-30 Tieren und kippen sie in neue Nahrung Fläschchen alle 2-3 Tage; Test jeder Satz von Fliegen (dh Alter abgestimmte Kohorten, eine Kohorte / Genotyp) mindestens einmal pro Woche.
2. Dreißig Minuten vor der negativen Geotaxis Test, betäuben die Fliegen mit CO ₂ und legen Sie sie in pre-markierten klar Kunststoffrohre mit zwei leeren Flaschen Nahrung (siehe Materialien Table), die an ihren Öffnungen mit durchsichtigem Klebeband (Kammer Maße: 19 cm x 2.85 cm). In unseren Tests verwenden wir meist 25 Fliegen / Rohr.
   Hinweis. Die Erholungszeit aus der Narkose kann von wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden variiert werden (z. B. O / N) und sollte für die spezifischen Genotypen getestet optimiert werden.
3. Markieren verschiedenen Höhen (von 1 bis 20 cm) auf ein Stück Löschpapier und kleben Sie das Papier auf einer vertikalen surface, die senkrecht zu der Bank.
4. Legen Sie die Rohre vor dem Papier: die Rohre sollte alles ausgerichtet und so nah wie möglich an das Papier, um eine genaue Höhenmessung ermöglichen.
5. Legen Sie die Digitalkamera (siehe "Sonderausstattung" Table) vor der Rohre, in einem Abstand von 20-30 cm von dem Papier, auf einem Ständer (zB eine Pipettenspitze Kasten), wählen Sie die "Film"-Option und starten Sie Aufnahme; zu diesem Zeitpunkt sollten Sie auch einen Timer zu starten, den Überblick über die Zeit zwischen aufeinander folgenden Prüfungen zu halten.
6. Lassen Sie die Fliegen an der Unterseite des Rohres durch Antippen des Röhrchens für ein paar Sekunden (zB 10 sec) zu sammeln. Dieser Schritt sollte konsequent durchgeführt werden (dh dieselbe Dauer, dieselbe Kraft, demselben Betreiber) während des gesamten Experiments.
7. Nimm Fliegen 'Bewegungen mit der Digitalkamera für 10 sec.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.7 vierzehn Mal an einem-Minuten-Intervallen.
9. Analysieren von Daten:
   1. Zähle die Anzahl der Fliegen, die über dem liegen2 cm-Marke nach 10 Sekunden durch visuelle Inspektion der aufgenommenen Filme.
      Hinweis: In unserem Test Bedingungen der Fliegen "negative Geotaxis Verhalten nicht zuletzt über den ersten 10 Sekunden nach überraschenden (dh Fliegen setzte sich in Bewegung in alle Richtungen 10 Sekunden nach überraschenden ihnen). Der Mindestabstand kletterte um Kontrolle Fliegen (dh 1 Woche alt Fliegen Ausdruck der THGal4 Fahrer, siehe Legende von Abbildung 1) in diesem Zeitfenster von 2 cm. So nutzten wir die 2 cm Marke als Referenz für die Analyse der Aktivitäten von Klettern Fliegen unterschiedlichen Alters und Genotypen 10 Sekunden nach Einleitung des Verhaltens. Diese Parameter können verlangen Anpassung, um Unterschiede im Verhalten der Fliegen getestet (zum Beispiel aufgrund von unterschiedlichen genetischen Hintergründen oder Laborbedingungen). Beachten Sie, dass in unseren Testbedingungen getestet alle Genotypen schlechter oder ähnlich durchgeführt, um die Fliegen von der Steuerung Genotyp.
   2. Der Mittelwert der Ergebnisse aus den fünfzehnStudien.
   3. Express Durchschnitt als Prozentsatz der Gesamtzahl von Fliegen in das Rohr (=% steigender Aktivität), die Anzahl der Wiederholungen (N) wird durch die Anzahl der unabhängigen Kohorten für jeden Genotyp untersucht worden sind
   4. Bewerten statistische Signifikanz zwischen den verschiedenen Genotypen im Laufe der Zeit. Dies kann mit einem Student-t-Test (beim Vergleich zweier Genotypen) oder einem 2-Wege ANOVA Analyse von Bonferroni post-hoc-Test (bei ​​der Durchführung multiple Vergleiche) unter Verwendung kommerzieller Software wie GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla gefolgt erreicht werden, CA, USA).

Hinweis

Wir führen alle unsere Tests in der gleichen Zeit des Tages, bei RT und unter den gleichen Lichtverhältnissen. Keeping die Fliegen in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus Umfeld ist es ratsam, für die Wirkung der zirkadianen Rhythmen auf der Fliegen Bewegungsapparates Verhalten zu kontrollieren.

2. Tyrosin Hydroxylase ImmunfluoreszenzAssay von Whole-Brain-Mounts

Lösungen und Puffer

Fixierlösung: 4% Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)

Waschpuffer: 0,1% Triton X-100 in PBS

Blocking-Puffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 und 0,5% BSA

Montage Medien: Mowiol-Dabco (siehe Protokoll in Harlow E, D. Lane, Antikörper-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988) beschrieben)

Vorgehensweise

1. Setzen Sie fliegt in einer Dissektion Gericht mit 70% EtOH für ca. 1 min, um die Nagelhaut entfernen Wachs gefüllt.
2. Übertragen fliegt zu einem anderen Dissektion Gericht mit eiskaltem PBS gefüllt.
3. Präparieren Sie das Gehirn:
   1. Legen Sie die Fliege mit der Bauchseite nach oben (optional: remove Flügel und Beine).
   2. Ziehen Sie den Kopf vom Körper weg: Verwenden Sie eine Zange, umhalten, um den Körper und eine andere zu halten, um die Nagelhaut unter dem Auge, um zu verhindern das Gehirn schädigen
   3. Entfernen Sie die Rüssel.
   4. Halten Sie den Kopf Kutikula auf gegenüberliegenden Seiten des Schlitzes offen gelassen nach dem Entfernen der Rüssel und ziehen in entgegengesetzte Richtungen, bis das Gehirn aus dem Kopf Kapsel entfernt wird.
   5. Entfernen Sie alle Häutchen aus dem Gehirn.
   6. Entfernen Sie alle luftgefüllten Luftröhrengewebe, dies wird das Gehirn vor schwimmt während der folgenden Inkubationsschritten verhindern.
4. Schneiden einige Millimeter von der Spitze eines P-200 Pipettenspitze und äquilibriert mit 0,1% Triton-Lösung X-100/PBS
5. Verwendung der hergestellten P-200 Pipettenspitze, übertragen die Gehirne einem 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml 4% PFA / PBS gefüllt und auf Eis halten, bis die Präparation beendet.
6. Fix die Gehirne bei RT für 20 min: eine milde Drehung, indem Sie die Eppendorf-Röhrchen auf einem Gestell und Platzierung des Racks auf einer Kolbenpendel.
7. Entfernen Sie das FixativVerwendung eines P-1000 micro Pipette 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, durch Umdrehen mischen und für 1 min inkubieren geschweige; wiederholen Sie diesen Schritt einmal waschen.
8. Entfernen Sie den Puffer aus dem zweiten Waschen, 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS und lassen Inkubation bei RT für 20 min; wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
9. Entfernen des Waschpuffers und lassen die Gehirne in Blocking-Puffer inkubiert (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 und 0,5% BSA) für 1 Stunde bei RT.
10. Inkubieren Sie die Gehirne mit einer 1:100 Verdünnung von Anti-TH-Antikörper (siehe "Tabelle der spezifische Reagenzien") in Blocking-Lösung für zwei Tage bei 4 ° C, mit sanften Drehung (siehe Schritt 2.6.).
11. Wiederholen Waschschritte 2.7. und 2.8 ..
12. Equilibrieren die Gehirne mit einer 1:200 Verdünnung des sekundären Antikörper in Blocking-Lösung, für zwei Tage bei 4 ° C, mit sanften Drehung.
13. Wiederholen Waschschritte 2.7. und 2.8 ..
14. Bereiten Sie die Montage Objektträger wie in 2A dargestellt:
    1. Add 2 X 25 ul Tropfen Montage-Medien mit einem Deckglas (24 x 60 mm, nein. 1.5).
    2. Platz zwei Deckgläsern (Größe 18 x 18 mm, nein. 2) an den Montage-Medien eine Lücke in der Mitte des Schlittens und trocknen lassen.
    Hinweis. Überprüfen Sie den Probenhalter auf der Bühne des konfokalen Mikroskops. Sie können das Deckglas die gleiche Größe von 25 x 75 mm Folie durch die Anbringung eines 22 x 22 mm 1,5 Deckglas auf einem der Enden (verwenden Nagellack und Band).
15. Entfernen Sie den Waschpuffer, fügen 50 ul Montage Medien und damit die Gehirne, um mit ihm durch Auf-und Abpipettieren Gleichgewicht.
16. Die Verwendung eines P-200 Pipettenspitze (siehe Schritt 2.4) übertragen die Gehirne mit dem Schlitten in den Raum zwischen den beiden Deckgläser und decken Sie sie mit einem Deckglas Nr. 1.5 (siehe Abbildung 2A; zu orientieren die Gehirne auf der Folie zu sehen ^7).
    Hinweis: Die Proben werden zwischen zwei Deckgläsern montiert, um die Visualisierung sowohl der Front-und der poste erlaubenrior Seite des Gehirns.
17. Füllen Sie den gesamten Raum zwischen den Deckgläsern mit Montageplatte Medien; Pipette von einer Ecke in die Luft zu entfernen, trocknen lassen und Dichtung mit Nagellack.
18. Um die Anzahl von dopaminergen Neuronen in einem bestimmten Cluster beurteilen erwerben eine Reihe von optischen Abschnitten entlang der z-Achse mit einem 1,0 um Schrittweite mit einem konfokalen Mikroskop (für den anatomischen Identifizierung dopaminerger Cluster in der Drosophila erwachsenen Gehirn siehe ^7).

Wir haben die verwendeten Assays beschrieben hier die Rolle der Beanspruchung schützende Nrf2-Signalweg in Drosophila Modell der PD ¹⁴ zu studieren. Dieses Modell beruht auf der Expression des humanen α-Synuclein-Gen in DA Neuronen mit einem TH Gal4 Treiber ^{2, 10.}

Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Schreckreaktion-induzierten negativen Geotaxis (Klettern)-Assay in männlichen Fliegen, die verschiedene Transgene unter der Kontrolle des TH Gal4-Treiber. Alle Genotypen getestet weisen einen Rückgang der Bewegungsaktivität im Laufe der Zeit, aber fliegt Ausdruck der PD-verknüpft, menschliche α-Synuclein transgene weisen einen beschleunigten Rückgang in Bezug auf Alter abgestimmte Steuerung Fliegen (TH Gal4 Fahrer allein) oder fliegt co-exprimieren die Nrf2 DNA Bindungspartner Maf-S. Ähnliche Ergebnisse wurden bei weiblichen Fliegen beobachtet.

2 veranschaulicht ein repräsentatives Ergebnis für eine TH Immunfluoreszenz-basierte DANeuron zählen. Die Wirkung der verschiedenen genetischen Hintergründen von der Anzahl der Neuronen im Gehirn pPL1 ab 4 Wochen alten männlichen Fliegen quantifiziert wird wie in der Abbildung Legende beschrieben. Beachten Sie die kleinen, aber signifikanten Verlust von Neuronen im Gehirn pPL1 von Fliegen Ausdruck α-Synuclein.

Abbildung 1. Startle-induzierten negativen Geotaxis Assay. Kohorten von alters-Fliegen der angegebenen Genotypen wurden für Bewegungsaktivität in einwöchigen Abständen getestet. Klettern Aktivität wurde durch Zählen der Anzahl von Fliegen über dem 2 cm-Marke 10 sec nach Antippen der Flasche und mit dem Ausdruck dieser Wert als Prozentsatz der Gesamtzahl von Fliegen in der Ampulle enthalten berechnet. Die Daten zeigen Mittelwerte ± SEM aus fünf unabhängigen Kohorten von 20-30 Fliegen. Signifikanz wurde mit einem Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test (P <0,05) beurteilt. Der Unterschiedzwischen TH war α-Synflies und fliegt von den anderen drei Genotypen getestet bei 4 und 5 Wochen signifikant.

Abbildung 2. Nachweis und die Zählung von DA Neuronen durch TH Immunfluoreszenz. A. Flussdiagramm, das Protokoll zur Herstellung von Folien Gehirn. Für eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte siehe Text. B. Repräsentative Aufnahme eines gesamten Gehirns Halterung (rechts hemibrain, hintere Ansicht) immungefärbt für TH. Eine Reihe von konfokalen z-Serie Bilder wurde mit einem Leica SP2 konfokalen Mikroskop, 40x Öl-Objektiv (N / A 1.25), den durchschnittlichen Frame 2, Schritt-Größe 1 um, in einem 1.024 x 1.024 Format erworben und kompiliert einer maximalen Projektion ( gezeigt). Die Position des pPL1 DA Neuron Cluster markiert ist. C. Repräsentative results für DA Neuron zählt unter Verwendung TH Immunfärbung. Die Anzahl der Neuronen in der pPL1 Cluster wurde durch Untersuchung der einzelnen Bilder jedes konfokalen z-Serie. N stellt die Anzahl der unabhängigen Proben für jeden Genotyp analysiert beurteilt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM Signifikanz wurde mit dem Student-t-Test (* P <0,05) beurteilt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Genotypen: 'con', THGal4 / +; THGal4 / +; "UAS-Syn ', THGal4, UAS
ΑSynuclein-/ +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; "UAS-Maf-S ', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +;" UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'Keap1 ^EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 ^EY5; "UAS-α Syn/keap1 ^EY5 ', THGal4, UAS-αSynuclein / +; THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 ^EY5.

[Reproduziert von Barone et al. 2011) im Einvernehmen mit dem "Open Access"-Politik von "Disease Modelle und Mechanismen".]

Die hier beschriebenen Assays stellen einen nützlichen Ansatz, um die Rolle von spezifischen Genen zu untersuchen, Signalwege oder kleinen Verbindungen bei der Aufrechterhaltung der DA Neuronen in Alterung sowie bei verschiedenen Krankheiten verbunden genetischen Hintergründen (Übersicht in ^5).

Die startle induzierten negativen Geotaxis Verhalten von Drosophila wurde ausgiebig als funktionelle Auslesen für die Funktionalität des DA Neuronen in unterschiedlichen genetischen Hintergründen, insbesondere in Gegenwart von Pd-linked Mutationen verwendet. Einige Unterschiede zwischen den verschiedenen Studien beobachtet wurden (siehe ¹² für eine ausführlichere Diskussion). Diese wurden zumindest teilweise auf unterschiedliche Test-Set-ups und Bedingungen, einschließlich der Anzahl der Fliegen in jeder Röhre getestet (Fliege gegen Fliegen "Kohorte), die Zeit der Erholung nach CO _{2-vermittelten} Anästhesie und die Anzahl der aufeinander folgenden zugeschrieben Studien (siehe ⁴ und ¹¹ als Beispiele für different Test Set-ups). Es kann daher ratsam sein, für solche Parameter kontrollieren und ggf. optimieren sie für spezifische Anforderungen Assay.

Die Quantifizierung der DA Neuronen durch Immunfärbung TH / konfokale Mikroskopie wurde synonym mit dem Verfahren auf THGal4-driven GFP-Expression und Identifizierung von DA Neuronen durch GFP-Fluoreszenz / konfokale Mikroskopie verwendet. Die beiden Verfahren, vergleichbare Ergebnisse in der Mehrzahl der Fälle, jedoch in der Regel die TH Immunfärbung Technik wird von uns und anderen Forschern bevorzugt, da sie empfindlich auf den Funktionszustand des DA Neuronen ist. Für einen detaillierteren Vergleich sehen ¹¹ und ^10. Dieser Assay kann durch Messen der Dopamin-Spiegel in fly Köpfe Homogenate [siehe ¹ als Beispiel] ergänzt werden.

Wir erklären, dass wir keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir danken Leo Pallanck für Fliegenfischer Aktien, Christine Sommers für technische Unterstützung und Gerasimos P. Sykiotis für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch das NIH Ausbildungsförderung T32CA009363 zu MCB finanziert