Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA) neurônios Drosophila: A escalada / ensaio geotaxis negativa induzida sobressalto que permite estudar os efeitos funcionais de neurónios DA degeneração e a imunomarcação de tirosina-hidroxilase, que é usado para identificar e contar os neurónios do cérebro de DA em montagens inteiras.

Drosophila melanogaster é um organismo modelo valioso para estudar processos degenerativos do envelhecimento e patológicas do sistema nervoso. As vantagens da mosca como um sistema experimental incluir sua rastreabilidade genética, vida curta ea possibilidade de observar e analisar quantitativamente os comportamentos complexos. A expressão de genes ligados à doença em populações neuronais específicas do cérebro de Drosophila, pode ser usado para modelar doenças neurodegenerativas humanas, tais como a doença de Parkinson e de Alzheimer ^5.

Dopaminérgicos (DA) neurônios estão entre as populações mais vulneráveis ​​neuronais no cérebro humano envelhecimento. Na doença de Parkinson (DP), a desordem de movimento neurodegenerativa mais comum, a perda acelerada de DA neurónios conduz a uma deterioração progressiva e irreversível da função locomotora. Além da idade e exposição a toxinas ambientais, a perda de neurónios DA é exacerbado por mutações pontuais no codificanteou regiões promotoras dos vários genes. A identificação de tais alelos DP associados fornece a base experimental para a utilização de Drosophila como um modelo para estudar a neurodegeneração de neurónios DA in vivo. Por exemplo, a expressão do gene α-sinucleína humana PD-ligados em Drosophila neurônios DA recapitula algumas características da doença humana, por exemplo, perda progressiva de neurônios DA e declínio da função locomotora ^2. Assim, este modelo tem sido utilizado com sucesso para identificar potenciais alvos terapêuticos na DP ^8.

Aqui nós descrevemos dois ensaios que têm sido comumente usados ​​para estudar a neurodegeneração idade-dependente de Da neurônios em Drosophila: um ensaio de escalada com base na resposta de sobressalto geotaxis negativa induzida e tirosina hidroxilase immunostaining de cérebro adulto todo monta para monitorar o número de neurônios DA em diferentes idades. Em ambos os casos, a expressão in vivo de t UASransgenes especificamente em neurónios DA pode ser conseguido através de uma tirosina-hidroxilase (TH)-Gal4 promotor de linha de condutor ^{3, 10.}

A especificidade dos ensaios descritos aqui baseia-se no uso de uma linha de mosca Gal4 que explora as sequências reguladoras do gene da hidroxilase de tirosina, para conseguir a expressão específica de neurónios dopaminérgicos ^3. Tirosina hidroxilase catalisa a primeira e passo limitante da velocidade na síntese de dopamina. Imunorreactividade TH na mosca sobrepõe cérebro adulto com a da dopamina, tornando TH um bom candidato para identificar neurónios DA in vivo (ver, por exemplo ^6). Além disso, o padrão de expressão THGal4 é mais específico do que a de outras linhas, tais como Gal4 DdcGal4, que contém as sequências reguladoras a partir do gene da dopa descarboxilase e dirige a expressão transgénica não apenas em neurónios DA, mas também nos neurónios serotoninérgicos e subconjuntos de células gliais ³ .

Feany e Bender (2000) observaram pela primeira vez que a expressão de pan-neuronal do gene α-sinucleína humana DP-linked acelera a perda progressiva de stageotaxis comportamento negativo rtle induzida em Drosophila. Temos observado resultados similares usando a linha DA-neurônio específico THGal4 para conduzir o expressionof uma α-sinucleína transgene ¹⁰ e usou este funcional de leitura para estudar o papel neuroprotetor da via Nrf2 neste Drosophila modelo de PD ^14. O ensaio específico aqui descrito é adaptado a partir de ² e ^3.

O cérebro de Drosophila contém mais de 100 neurónios DA, dispostos em, pelo menos, cinco grupos diferentes (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, ppm3) que podem ser visualizados nos seus suportes de a totalidade do cérebro por meio de microscopia confocal (ver, por ^{exemplo, 11} e ^7). É ainda controverso se o número de neurónios DA em declínios cerebrais Drosophila com ⁹ anos ^{de idade, 11,} no entanto, dependente da idade, a neurodegeneração é observada nas moscas onde os genes PD-linked foram mutados / overexpressed para modelar doenças humanas5. A expressão de humano α-sinucleína em DA neurónios tem tal efeito e, consequentemente, tem sido utilizada como um modelo para a DP. Aqui nós descrevemos um ensaio para neurônios DA contar no cérebro todo montado usando TH como um marcador de células. Este ensaio foi adaptado a partir de ¹³ e ^10.

1. Sobressalto induzida Ensaio geotaxis Negativo

1. Selecione moscas do genótipo desejado, separá-los por gênero, aleatoriamente agrupá-los em grupos de 20-30 animais e lançá-los em novos frascos de comida a cada 2-3 dias, teste cada conjunto de moscas (ou seja, grupos pareados por idade, uma coorte / genótipo) pelo menos uma vez por semana.
2. Trinta minutos antes do teste geotaxis negativo, anestesiar as moscas com CO ₂ e colocá-los em tubos de plástico transparente pré-rotulados feitos com dois frascos vazios de alimentos (ver Tabela de Materiais) Cadastrado em suas aberturas com fita adesiva transparente (dimensões da câmara: 19 cm x 2,85 cm). Em nossos ensaios que normalmente usam 25 moscas / tubo.
   Nota. O tempo de recuperação da anestesia pode ser variada desde alguns minutos a várias horas (por exemplo, S / N) e devem ser optimizados para os genótipos específicos testados.
3. Marcar alturas diferentes (de 1 a 20 cm) sobre um pedaço de papel e fita de papel em uma as superfícies verticaise, perpendicular ao banco.
4. Coloque os tubos na frente do papel: os tubos devem estar todos alinhados e tão perto quanto possível do papel para permitir a medição da altura exata.
5. Coloque a câmera digital (consulte a tabela "Equipamento Especial") na frente dos tubos, a uma distância de 20-30 cm do papel, em um suporte (por exemplo, uma caixa de ponteira), selecione a opção "filme" e começar gravação, neste momento você também deve iniciar um timer para controlar o tempo entre ensaios consecutivos.
6. Permitir que as moscas se acumulem na parte inferior do tubo, tocando o tubo durante alguns segundos (por exemplo, 10 segundos). Este passo deve ser realizado de forma consistente (ou seja, igual duração, a mesma força, o mesmo operador) durante todo o experimento.
7. Movimentos Record 'voa com a câmera digital de 10 seg.
8. Repita os passos de 1,5-1,7 catorze vezes em intervalos de um minuto.
9. Analisar os dados:
   1. Contar o número de moscas que estão acima do2 centímetros marca após 10 segundos por inspeção visual dos filmes gravados.
      Nota: Em nossas condições de ensaio geotaxis comportamento negativo das moscas não durou além do primeiro 10 segundos depois surpreendente (ou seja, moscas começaram a se mover em todas as direções 10 segundos depois surpreendente deles). A distância mínima subiu por moscas de controle (ou seja, 1 semana atrás moscas expressando o motorista THGal4, veja a legenda da Figura 1) nesta janela de tempo foi de 2 cm. Assim, foi utilizada a marca de 2 cm como referência para a análise das atividades de escalada de moscas de diferentes idades e genótipos de 10 segundos após o início do comportamento. Estes parâmetros podem exigir ajuste para ter em conta as diferenças no comportamento das moscas testados (devido, por exemplo, a diferentes origens genéticas ou condições de laboratório). Observe que em nossas condições de ensaio, todos os genótipos testados desempenho pior ou semelhante para as moscas do genótipo controle.
   2. Tomar a média dos resultados dos quinzeprovações.
   3. Média expresso como uma percentagem do número total de moscas no tubo (= actividade escalada%), o número de repetições (N) é dado por o número de grupos independentes testadas para cada genótipo
   4. Avaliar a significância estatística entre os diferentes genótipos ao longo do tempo. Isto pode ser realizado com o teste t de Student (quando se compara dois genótipos) ou de uma análise ANOVA de 2 vias seguido pelo teste de Bonferroni post-hoc (ao realizar comparações múltiplas) utilizando programas comerciais, tais como o GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, EUA).

Nota

Realizamos todos os nossos ensaios na mesma hora do dia, à TA e sob as mesmas condições de iluminação. Mantendo as moscas em um ambiente de ciclo de 12 hr luz / escuro é aconselhável controlar o efeito dos ritmos circadianos no comportamento locomotor das moscas.

2. Tirosina hidroxilase ImunofluorescênciaEnsaio de Montes cérebro inteiro

Soluções e tampões

Solução fixadora: 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato salino (PBS)

Tampão de lavagem: 0,1% de Triton X-100 em PBS

0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 e 0,5% de BSA: Tampão de bloqueio

Meios de montagem: Mowiol-Dabco (ver protocolo descrito no Harlow E, Lane D., Antibodies-Um manual de laboratório Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 10:418 (1988))

Procedimento

1. Coloque moscas em um prato de dissecação enchido com 70% de EtOH durante cerca de 1 min para remover a cera cutícula.
2. Transferência voa para outro prato dissecção preenchido com PBS gelado.
3. Dissecar o cérebro:
   1. Coloque a voar com o lado ventral para cima (opcional: asas remover e pernas).
   2. Puxe a cabeça para fora do corpo: use um conjunto de pinças parasegurar o corpo e outro para segurar a cutícula sob o olho para evitar danos ao cérebro
   3. Retire a tromba.
   4. Segurar o cutícula cabeça em lados opostos da fenda deixada em aberto após a remoção da tromba e puxar em direcções opostas até que o cérebro é retirado da cápsula cabeça.
   5. Remova toda a cutícula do cérebro.
   6. Remover todo o tecido traqueal cheia de ar, o que irá impedir o cérebro de flutuar durante as seguintes etapas de incubação.
4. Cortar a poucos milímetros da ponta de uma ponta de pipeta P-200 e equilibrar com uma solução a 0,1% de Triton X-100/PBS
5. Com a ponta de pipeta P-200 preparados, transferir os cérebros para um tubo de 0,5 ml de Eppendorf encheu com 0,5 ml de 4% PFA / PBS e manter em gelo até que o esvaziamento está completo.
6. Corrigir os cérebros à temperatura ambiente durante 20 min: aplicar uma rotação suave, colocando os tubos Eppendorf em um rack e colocar o rack em um nutator.
7. Remover o fixadorusando um P-1000 micro-pipeta, adicionar 0,5 mL de 0,1% de Triton X-100/PBS, misturar por inversão e deixar incubar durante 1 min; repetir este passo de lavagem uma vez.
8. Remover o tampão de lavagem a partir da segunda, adicionar 0,5 mL de 0,1% de Triton X-100/PBS e deixar incubar à TA durante 20 min, repetindo este passo duas vezes.
9. Remover o tampão de lavagem e deixar os cérebros incubar em tampão de bloqueio (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 e 0,5% de BSA) durante 1 hora à temperatura ambiente.
10. Incubar os cérebros com uma diluição de 1:100 de anticorpo anti-TH (consulte "Tabela de reagentes específicos") em solução de bloqueio, por dois dias, a 4 ° C, com rotação suave (veja o passo 2.6.).
11. Repita os passos de lavagem 2.7. e 2.8 ..
12. Equilibrar os cérebros com uma diluição 1:200 de uma solução de bloqueio antibodyin secundário, durante dois dias, a 4 ° C, com rotação suave.
13. Repita os passos de lavagem 2.7. e 2.8 ..
14. Preparar as lâminas de fixação, como ilustrado na Figura 2A:
    1. Add 2 X 25 gotas ul de meios de montagem para uma cobertura de vidro (24 x 60 mm, n. 1.5).
    2. Coloque dois copos de cobertura (tamanho 18 x 18 mm, não. 2) sobre os meios de montagem, deixando uma lacuna no meio do slide e deixe secar.
    Nota. Verifique o suporte de amostras no palco do seu microscópio confocal. Você pode fazer a tampa de vidro do mesmo tamanho de um x 75 mm Slide 25, anexando a 22 x 22 mm 1,5 tampa de vidro de uma das extremidades (usar unha polonês e fita).
15. Retire o tampão de lavagem, adicionar 50 mL de meios de montagem e permitir que os cérebros para equilibrar com ele por pipetagem cima e para baixo.
16. Utilizando um corte de P-200 a ponta da pipeta (ver passo 2.4), transferir os cérebros para a corrediça no espaço entre as duas lamelas e cobri-los com uma lamela não. 1.5 (ver Figura 2A, para orientar os cérebros no slide ver ^7).
    Observação: as amostras são montadas entre dois vidros de cobertura para permitir a visualização tanto do anterior e posterior lado do cérebro.
17. Preencher todo o espaço entre os vidros da tampa com meios de montagem; pipeta de um canto para retirar todo o ar e deixe secar e selar com unha polonês.
18. Para avaliar o número de neurónios dopaminérgicos em um conjunto específico adquirir uma série de secções ópticas ao longo do eixo z com um passo de 1,0 uM de tamanho utilizando um microscópio confocal (anatómica para a identificação de grupos dopaminérgicos no cérebro adulto de Drosophila ver ^7).

Usamos os ensaios descritos aqui para estudar o papel do protector via Nrf2 o stress num modelo de Drosophila de DP ^14. Este modelo baseia-se na expressão do gene α-sinucleína humana em neurónios DA utilizando um condutor de Gal4 TH ^{2, 10.}

A Figura 1 mostra um resultado representativo de um sobressalto induzidas geotaxis negativos (subida) de ensaio nas moscas macho que expressam transgenes diferentes sob o controlo do controlador de TH Gal4. Todos os genótipos testados exibem uma diminuição da actividade locomotora ao longo do tempo, no entanto, as moscas expressando o PD-ligados, humana α-sinucleína transgene exibem um declínio acelerado em relação às moscas de controlo de idade comparável (TH condutor de Gal4 sozinho) ou moscas que co-expressam o Nrf2 DNA parceiro de ligação Maf-S. Resultados semelhantes foram observados em moscas fêmeas.

A Figura 2 ilustra um resultado representativo de um promotor à base de TH imunofluorescêncianeurônio contar. O efeito de diferentes origens genéticas no PPL1 número de neurónios no cérebro a partir de 4 semanas de idade moscas macho é quantificada tal como descrito na legenda da figura. Observe a perda pequena, mas significativa de PPL1 neurônios no cérebro de moscas expressando α-sinucleína.

Figura 1. Coortes moscas ensaio geotaxis negativo sobressalto induzida. De idade comparável dos genótipos indicados foram testados para a actividade locomotora em intervalos de uma semana. Escalada actividade foi calculada por meio da contagem do número de moscas 2 centímetros acima da marca de 10 segundos após apertar o frasco e expressando este valor como uma percentagem do número total de moscas contidos no frasco. Os dados mostram significa ± SEM de cinco grupos independentes de 20-30 moscas. A significância foi avaliada com um two-way ANOVA com post-hoc Bonferroni teste (P <0,05). A diferençaentre TH, α-Synflies e moscas dos outros três genótipos testados foi significativo em 4 e 5 semanas.

Figura 2. A detecção e contagem de neurónios DA TH por imunofluorescência. A. diagrama de fluxo que ilustra o protocolo para a preparação de lâminas do cérebro. Para uma descrição mais detalhada de cada etapa ver texto. B. micrografia Representante de uma montagem cérebro inteiro (hemibrain direita, vista posterior) histoquímica para TH. Um conjunto de imagens da série Z confocal foi adquirida com uma Leica SP2 microscópio confocal, o objetivo do petróleo 40X (N / A 1,25), quadro médio 2, etapa 1 mícron de tamanho, em um formato de 1024 x 1024 e compilado como uma projeção máxima ( mostrada). A posição do grupo DA neurônio PPL1 é realçado. C. Representante results para DA neurônio contagens obtidas usando immunostaining TH. O número de neurônios no cluster PPL1 foi avaliada através do controlo das imagens individuais de cada confocal z-series. N representa o número de amostras independentes analisadas para cada genótipo. Os dados são médias ± SEM A significância foi avaliada com o teste t de Student (* P <0,05). Clique aqui para ver a figura maior .

Genótipos: 'con', THGal4 / +; THGal4 / +; 'UAS-Syn ", THGal4, UAS
-ΑSynuclein / +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'UAS-Maf-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'KEAP1 ^EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 ^EY5; 'UAS-α Syn/keap1 ^EY5', THGal4, UAS-αSynuclein / +; THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 ^EY5.

[Reproduzido de Barone et al. 2.011), de acordo com o "Open access" política de "modelos de doenças e mecanismos".]

Os ensaios descritos aqui proporcionam uma abordagem útil para estudar o papel de genes específicos, as vias de sinalização ou de compostos pequenos na manutenção de neurónios DA em envelhecimento, bem como em diferentes fundos genéticos doenças ligadas (revisto em ^5).

O comportamento negativo geotaxis sobressalto induzida de Drosophila tem sido amplamente utilizada como um funcional leia-out para a funcionalidade do AD neurônios em diferentes origens genéticas, particularmente na presença de mutações PD-vinculados. Algumas discrepâncias entre os diferentes estudos têm sido observadas (ver ¹² para uma discussão mais detalhada). Estas foram atribuídas, pelo menos em parte, a diferentes ensaio afinações e condições, incluindo o número de moscas testada em cada tubo (único voe contra coorte das moscas), o tempo de recuperação após a anestesia CO _2-mediada e o número de consecutivas ensaios (ver ⁴ e ¹¹ como exemplos de diensaio fferent set-ups). Portanto, pode ser aconselhável para controlar estes parâmetros, e, se necessário, os optimizar para os requisitos específicos de ensaio.

A quantificação de neurônios DA por immunostaining / microscopia confocal TH tem sido usado de forma intercambiável com o método baseado na expressão GFP THGal4-driven e identificação de neurônios DA por fluorescência da GFP / microscopia confocal. Os dois métodos apresentam resultados comparáveis, na maioria dos casos, no entanto, em geral, a técnica de imunomarcação TH é preferido por nós e por outros investigadores como é sensível ao estado funcional dos neurónios DA. Para uma comparação mais detalhada ver ¹¹ e ^10. Este ensaio pode ser complementada através da medição dos níveis de dopamina no fly cabeças homogeneizados [ver ¹ como um exemplo].

Nós declaramos que não temos interesses financeiros concorrentes.

Agradecemos Leo Pallanck para as populações da mosca, Christine Sommers de assistência técnica e Gerasimos P. Sykiotis para discussões úteis. Este trabalho foi financiado pelo NIH formação concessão T32CA009363 para MCB