Bir Kullanarak Non-obez Diyabetik Farelerde Mide boşaltılması Değerlendirilmesi [

Bir non-invaziv ile mide boşalma belirlenmesi [ ¹³ C]-oktanoik dişi NOD LTJ farelerde izleme gastroparezi için asit nefes testi.

Farelerde Mide boşalma çalışmaları en sık kullanılan teknikler hayvanlar ve yemek ^1,2 postmortem kurtarma öldürülmesi gerektiğinden aynı hayvanda gastrik boşalma değişiklikleri takip etmek yetersizlik ile sınırlı kalmıştır. Bu yaklaşım, yaş ve hastalığın ilerlemesi ile mide boşalmasını değişiklikleri belirlemek için boylamsal çalışmalar önler. Yaygın olarak kullanılan ^{[13C]-oktanoik} asit için insanlarda ³ üre nefes testi ve fareler ^4-6 Sıçanların ⁷ kullanılmak üzere modifiye edilmiş ve daha önce bu deney ilaçlara tepki olarak ve sırasında güvenilir ve gastrik boşaltımı değişikliklerine duyarlı olduğunu göstermiştir olmuştur diyabetik hastalık progresyonu ^8. Bu video sunumu bu modifiye test prensibi ve pratik uygulama açıklanmıştır. Önceki çalışmada olduğu gibi LTJ NOD fare, tip 1 diyabet ^{9 olduğu} bir örnek kullanılmaktadır. Bu farelerin bir oranda diyabet komplikasyonu, gastroparezi belirtileri gelişires mide ¹⁰ mekanik tıkanma olmadan gecikmiş mide boşalması ile karakterize.

Bu kağıt testi yemek hazırlamak ve 4 saat gastrik boşalma veri ve nasıl elde edilen veriler analiz edinme, test için fareler eğitmek için nasıl kullanılacağını gösterir. Bu çalışmada kullanılan karbon izotop analiz cihazı aynı zamanda 12 fareler için ikinci hava örneklerinin otomatik numune için uygundur. Bu teknik, diyabet veya diğer uzun süreli hastalığı olan farelerin büyük gruplar mide boşalma boyuna takip sağlar.

Bu yazıda farelerde mide boşalma non-invaziv ölçümü dahil teknik ve metodolojik hususlar anlatılmaktadır. Takip ederek protokolü burada açıklanan, araştırmacılar güvenilir ve tekrarlanabilir hastalığından dolayı gelişimi boşalma gastrik değişiklikleri takip ^{edebilirsiniz,} mide boşalımını farmakolojik ajanların etkilerini incelemek ve altta yatan hastalıkları veya kusurları ^6,8 tedavisinde mide boşalma yanıtı izleyin ^11,12. Önceki yayınlarda, ¹³ C uygulama oktanoik asit nefes testler, insanlarda ve hayvanlarda ^3,8 gastrik boşalma ölçmek için yararlı bir yol olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma ayrıntılı olarak açıklanmaktadır, 6-8 fazla güvenilir veri elde etmek için gerekli prosedürler diyabetli farelerde mide boşalma boylamsal bir çalışma için gerekli ay. Önceden yayınlanmış yöntemlere göre bu protokol izlenerek avantajları araştırmacı veri obtaine emin olmalarıdırd güvenilir ve tekrarlanabilir olacaktır. Buna ek olarak, toplama ve gaz numuneleri analiz için otomatik bir sistem burada açıklanan bir çalışmada eş zamanlı olarak takip edilebilir hayvanların sayısını artırır. Genel olarak, bu yazının amacı test etmek için farelerin alışma ve bu elde edilen sonuçlar değişkenlik azaltmak korumak anahtar faktörleri tespit etmektir.

Mide boşalmasını in vivo ölçümü için, farelerin gecede oruç ve sabit hava akışı şeffaf plastik test odalarına koymak. Fareler tüpleri HABITUATED olsun sonra, bazal ₂ seviyeleri belirlenmiş ¹³ CO ekshale ve hava akımı buna göre ayarlanır. Ardından, ^13C-etiketli oktanoik asit ile karıştırılır yumurta sarısı oluşan bir test yemek yönetmek. Fareler oruç ve eğitimli olduğundan, genellikle 2 dakika içinde test yemeği yiyin. Yönetilen oktanoik asit bir mide absorbe değil ama duodenum ele alınacaktırd çevreleyen hava içinde ¹³ CO _{2 'lik} bir zenginleşme elde yayımlanır ve nefes verirken ¹³ CO _2, içine karaciğerde metabolize alacak. Hava örnekleri belirlenen zaman aralıklarında toplanır ve karbon izotop analizci tarafından analiz edilir. Bütün bu süreçte hız sınırlayıcı adım mide boşalmasını ve CO ₂ doğrudan etiketli yemek mide boşalımını karşılık ¹³ pulmoner atılımı olduğunu.

Şekil 1. Gastrik boşalma aparatın şematik. Gecelik açlık sonrası, fareler onları serbestçe hareket ve açmak için izin şeffaf odalarına yerleştirilir. Bir giriş tüpü taze ve sabit hava akını sağlayan ve bir çıkışı ^{13 C-to-12} ölçmek için izotop analizörü yol açarC oranı soluk verdi. Kamara da ^[13 C]-oktanoik asit içeren yiyecek teslimat için merkezi bir bağlantı noktası var.

1. Fare Eğitim ve Alışma

1. Analizden önce, test koşullarına onları alıştırmak için sabit hava akışı ile 2-4 saat için test odaları içinde tüm fareler koydu. Bu belirgin aksi gecikmiş mide boşalması aberan algılama neden olabilecek stres seviyelerini azaltır. Farelerin mide boşalma deneyi koşuyormuş gibi aynı şekilde davranın. Oktanoik asit eklemeden yumurta sarısı (daha bakınız) hazırlayın ve her fare için 0.2 g yem.
2. Fareler yeterince (genellikle 2-3 kez) eğitilmiştir kadar bu işlemi tekrarlayın. Çevre koşulları aynı tutulur gibi fareler genellikle kolayca sürece alışmışsındır.

Not: alışkın fareler hızlı sessizce yeni bir çevre ve geri kalanı razı olurken Sigara alışkın fareler, odasına transferinden sonra yaklaşık 1 saat boyunca hareket ve arınmak ve sık sık idrara çıkma devam ediyor.

Hayırte: Deneme sırasında: Böyle aşırı idrara çıkma, defekasyon, yumurta yeme ilgi eksikliği gibi alışkanlık kaybı belirtileri Monitör hayvanlar. Eğer bu durumda yeniden 1-2 kez önceden gastrik boşalma veri elde etmek boş bir odasında habituating düşünün. Bu deney yaparken Tutarlılık son derece önemlidir. Şeyleri aynı şekilde yaparak her zaman güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tek yoldur. Bu, kendi kafes arkadaşları itibaren fareler ayıran değil, aynı zamanda, her gün (örneğin insülin) kesinlikle gerekli olmadıkça, fareler açlık ve aynı zamanda mide boşalması Teste başlamadan ve fareler işleme benzer bir şekilde tedavi veren içerir.

2. Testi Öğün İçeren İzotop hazırlanması

1. 50 ml şahin tüp içinde yumurta sarısı 5 g tarttığını ile başlayın. Taze bir sınama yemek hazırlamak için her deneysel gün bu adımları yineleyin.
2. Bir concentr ile oktanoik asit için 10 ul ekleyumurta ihtiva eden 50 ml Falcon tüp 2 ul / g tirme ve şahin tüp içinde bir spatula ile 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırılır.
3. O pıhtılaşır ve tutarlılık küçük toplar yapmak için uygundur kadar yumurta sonra bir cam behere aktarılır ve bir Bunsen brülör üzerinde ısıtılır. Bu genellikle yaklaşık 30 saniye sürer.

Not: yumurta sarısı topları fare başına 0.2 g tartmak gerekir. Bu, tüm farelerde kümülatif doz sabit tutmak için önemlidir.

3. Deneme Başlatma

1. Coprophagia önlemek için metal bir "kafes-bottom" açlık raf (12 saat) hızlı fare gecede, mide boşalmasını için bir kez eğitimli ve hazır. Onlar içme suyu ücretsiz olarak sahip olduğunuzdan emin olun. Diyabetik farelerde mevcut deneyde kullanılan olduğundan, onlar fazla 16 saat boyunca oruç edilmemelidir.
2. Mide boşalma odaları kurmaya başlayın. Havada kurutulmuş olmuştur temiz odaları ve kapaklar kullanın. Ayrıca, herhangi biranalizörü veya CO ₂ hava beslemesi odalarına bağlayan tüpleri nemsiz olmalıdır; su analizörü tarafından okunan sinyal ile etkileşime girebilir
3. Sabit bir hava akışını sağlamak giriş tüpleri için odaları bağlayın. Daha sonra makine ile odalarından çıkış boruları bağlayın. Tüpleri kapatın ve hava akımını açın.

Not: kolayca ve güvenli bir şekilde kapatmak kapatılır böylece kapağın kapak sonunda vazelin çok küçük bir miktarda uygulanır. Bu sızdırmaz conta fareler tarafından üretilen tüm karbon dioksit toplamak için gereklidir.

4. Deneysel Prosedürler

1. Her fare ağırlığındaki ile başlayın. Vücut ağırlığı onların sürekli sağlıklı bir ölçüdür. Ardından uygun odasında her fare yerleştirin. Bu hava şu anda odalarına akan adres elbette önemlidir.
2. Ölçümü başlatmak için, farelerin ayarlamak önce odalarına gelmesini bekleyinhava seviyelerinin ing.
3. Fareler sakin görünen sonra, hangi, birkaç dakika sürebilir her fare odası için hava akış hızını ayarlayabilirsiniz. Bu, her bir fare için farklı olabilir. Tipik olarak, hava akış CO ₂ kullanılmakta olan herhangi bir ekipman ile tespit edilebilir düzeyde nefes verme ulaşır olduğundan emin olmak için, ve seviye sağlıklı hava devir hızı sağlamak için yeteri kadar düşük kalmasını sağlamak için, deney başında ayarlanır. Biz milyonda 1,000 ve 1,500 parçalar arasındaki ilk CO ₂ düzeyleri kullanın.
4. Ayarlamaları ile zorluk varsa, hava sızdırmazlığını kontrol edin. Sonra odalarının her biri için işlemi yineleyin ve hava akışı için yapılan düzeltmeler CO ₂ seviyesi düzeltilmiş olup olmadığını görmek için ölçümler başka bir tur için izleyebilirsiniz. Bu farelerin beslenme öncesinde okuma istikrarlı bir temel elde etmek için önemlidir. Biz kendi kendine kalibrasyon özelliği olan bir makine kullanabilirsiniz. Bu değilse durum kalibrasyon kontrol edilmelidir.
5. Bu elde edildikten sonra, yumurta yemek yönetmekilk olarak fare ve kayıt süre için her bir fare gıda alır.
6. Biz her fare için ¹³ CO ₂ zenginleştirme eğri uydurma için yeterli değerlerini elde etmek için 4 saat süreyle yordamı çalıştırın. Fareler üzerinde CO ₂ düzeyleri fareler için hala güvenli olduğundan emin olmak için her 30-60 dakika kontrol edin.
7. Farelerde test bitti hemen sonra yeme başlayabilirsiniz böylece test bitmeden gıda içeren yeni kutular hazırlayın.

Farklı farelerden elde edilen üç set bir temsilci veriler Şekil 2 'de gösterilmiştir. Siyah grafisi normal mide boşalmasını bir fareden veri noktalarını temsil eder. Bu, zamanın bir fonksiyonu olarak ifade saat başına uygulanan dozun bir yüzdesi olarak ifade edilen hava dışarı verilen geri kazanılır ¹³ C fraksiyonu göstermektedir. Mavi eğri 168 dak 'lık bir T yarı değerine sahip bir Gecikmiş mide boşaltımı ile bir fare dan 40 dk ve kırmızı eğri bir T yarı değer ile boşaltma hızlandırılmış bir mide ile bir fare alınmıştır. Olarak bizim laboratuvar ^7, bir non-diyabetik NOD fare yaş için normal mide boşalma zamanı bir önceki çalışmada kurulan gri kutu ile temsil olarak 62 131 dk 9-15 hafta arasında değişmektedir. Veri noktaları daha sonra aşağıdaki denklem ⁸ ile bir non-lineer regresyon eğrisine göre monte edilmiştir:

^{b e-ct} nda y =

Y yüzdesi olduğu durumlarda ^{13 C her nefes vs zaman eğrisi tahmin regresyon sabitleri saat (t) ve a, b ve c her nefeste iyileşti. Boşalma zamanı (T _1/2)}

Bir ters gama fonksiyonu kullanarak bir sayısal entegrasyon prosedürü hesaplanır. Biz yaklaşık% 10 bir biyolojik intra-fare değişkenliği ile birkaç bin çalışmalardan sonuçlar elde ettik.

Şekil 2. Mide boşalmasını üç farklı normal olan farelerde (siyah eğri), gecikmiş (kırmızı eğri) ve hızlandırılmış (mavi eğri) Temsilcisi gastrik boşalma veri. Gri kutu, normal değerlerini vurgulamaktadır. Non-lineer regresyon eğrileri denklem kutu içinde gösterilmiştir.

Açıklanan tekniği Burada farelerde katı mide boşalma vivo ölçümü tekrarlanan ve non-invaziv sağlar. Bu sistem, bu serbestçe hareket ve dönüş sağlayan hayvanlar ölçüm haznesi ölçülü olmayan bir avantajı vardır. Bu yabancı bir ortam olduğu için, farelerin hala eğitilmiş ve gastrik boşaltımı üzerindeki stres etkilerini önlemek için test odaları HABITUATED gerekir. Genel olarak, biz ardışık gastrik boşalma testleri arasındaki intra-fare değişkenliği% 10'dan az ise mide boşalmasını veriler güvenilir varsayıyorum.

Bu rapor, farelerde ^8,11,12 gastrik boşalma ölçümleri önceki raporların daha ayrıntılı bir açıklama ve sistemi ile sorun giderme sorunları hakkında ek bilgi içerir. Ana gaz değiştirme seviyelerini ölçmek için LGR izotop analizörü kullanılmasıdır. Biz bu çalışmada kullanılan analizörü ¹² CO ölçer _{2, ¹³ CO 2 ve H 2 O konsantrasyonları her saniye. Çoklu giriş ünitesinde bilgisayar kontrollü vanalar otomatik fare odaları her 25 sn arasında dedektör akış geçiş. Bu nedenle 12 fareler anda okumalar arasında 5 dk ara ile analiz edilebilir. Bu veriler aynı zamanda dışarı verilen hava ve sonraki analiz elle örnekleme yoluyla elde edilebilir olduğunu belirtmek gerekir. Elle örnekleme veya başka bir aygıt kullanıyorsanız, okumalar yaklaşık 10 dk aralıklarla elde emin olun. Bizim sistem ve örnek toplama sıklığı duyarlılığı mide boşalmasını eğrilerin daha güvenilir, uygun kolay ve bu yüzden biz bu geliştirilmiş bir yöntem ile daha fazla tekrarlanabilir veri almak olduğunu bulduk demektir.}

Fareler fareler odasına onların alışma kaybetmek ve teknik problemleri algılama sys ile ortaya çıkan durumlarda, ayrılan süre içinde yemek yemek için başarısız olduğunda bu tekniğin büyük tuzaklar ortayamaktadır. Habitüasyon yemek ve kaybı yemeye Başarısızlık genellikle test için düzenli bir program olmasının kritik adım aşağıdaki değil bir sonucudur. 3 ardışık testler 7 gün veya daha az ayrılmış sonra, farelerde test HABITUATED ve yemek yemek olur. Fareler deney geri kalan kısmı için, en azından her 2 haftada bir kere test edilir ise bir kez habitüe, güvenilir veri elde edilir. Nedense fareler 3 hafta veya daha fazla test edilmemiştir, o bir hafta içinde iki eğitim oturumları genellikle habitüasyon sağlayacaktır. Hayvanlar taşıma personeli farelerin yeniden eğitim tavsiye edilir daha sonra değiştirmek ve fareler işleme halk tarafından güçlü kokulu sabun ve / veya parfüm kullanımı vazgeçirmek için özellikle önemlidir. Eğer Algılama sistemi ile zorluklar genellikle bir fare gibi küçük bir hayvan tarafından üretilen ¹³ CO ₂ düşük seviyelerde nedeniyle vardır. Dedektör kalibre ve bu kızıl ötesi tabanlı sistemler gibi bazı dedektörler için, çok imp gerekirölçümler önce en az bir numune su miktarını azaltmak için ortant.

Araştırmacının aynı fare 3 gün her seferinde daha sık mide boşalmasını çalışmak istediği sürece birkaç sınırlamalar bu tekniği vardır. Bu yüzden sık sık hızlı fare tavsiye edilmez ve düzenli olarak bu diyet kısıtlaması mide işlevini değiştirebilirsiniz. Tekniğe modifikasyonlar sıvı gastrik boşalmayı ölçmek için yapılmıştır ve bu yöntem için yararlı bir potansiyel bir uygulama olabilir.

Sabit bir zaman süreci stres ile ilgili sorunlar ya da her testin sonunda hayvanı öldürmek için ihtiyacı nedeniyle de dahil olmak üzere çok daha fazla sınırlamalar sonra sintigrafi dahil veya ölçüm gastrik boşalma, ölçme diğer yöntemler içeriği korunur. Stres ölçüm sırasında test yemeği ya da hayvan kısıtlama gavaj içerir. Nefes testi ve avantajları fare serbestçe hareket eden ve anestezi uygulanmış olup olmadığınıya da herhangi bir şekilde uyuşturulmuş.

Özetle, ¹³ C-oktanoik asit nefes testi, yaş ve tedavi ve bu veriler ile hastalığın ilerlemesi çalışma daha sonra aynı hayvanın diğer fizyolojik parametrelerde değişiklikler ve histolojik değerlendirme ile korele edilebilir sağlar. Diğer uygulamalar arasında, test de ilaçlar doğrudan hem de hastalık veya diğer müdahaleler nedeniyle mide boşalmasını değişiklikler gelişir hayvanlarda tedaviye yanıtı araştıran olarak mide boşalmasını değiştirebilir nasıl çalışma sağlar.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bu video yayın DK 68.055 Programı Projesi Hibe "Enterik Sistemi Patobiyoloji" Diyabet ve Sindirim ve Böbrek hastalıkları Ulusal Enstitüsü (NIDDK) fon ile mümkün olmuştur. Christopher T. Creedon Rochester Public Schools Mentorluk Programı tarafından desteklenmiştir.

Biz teknik asistanlığı, sekreterlik hizmetleri ve Los Gatos Research, Inc (Mountain View, CA) 'dan Dr Douglas Baer Bayan Kristy Zodrow Sayın Gary Stoltz ederim.