[を使用した非肥満糖尿病マウスにおける胃排出能の評価

非侵襲による胃排出の決定[ ¹³女性のNOD LTJマウスで胃を追跡するためのC] - オクタン酸呼気検査。

マウスにおける胃排出試験は、最も一般的に使用される技術は、動物との食事を^1,2の死後回復を殺す必要とするので、同じ動物における胃排出変化に追従することができないことによって制限されています。このアプローチでは、年齢や疾患の進行と胃排出能の変化を判断するのは長期的な研究を防ぎます。人間³に一般的に使用される^[13 C] -オクタン酸呼気試験は、マウス^4-6およびラット⁷で使用するために変更され、我々は以前に、このテストは薬剤への応答との間に胃排出能の変化に対する信頼性と応答性であることを示したされています糖尿病疾患の進行^8。このビデオプレゼンテーションでは、この変更されたテストの原理と実用的な実装について説明する。以前の研究と同様に、NOD LTJマウスは、1型糖尿病⁹のモデルを使用されています。これらのマウスの割合はdiabetの合併症、胃不全麻痺の症状を起こすES胃¹⁰の機械的閉塞せずに遅延胃排出が特徴。

本論文では、試験食を準備し、4時間胃排出データと方法で得られたデータを分析する方法を取得する方法、テストのためにマウスを訓練する方法を示しています。本研究で用いた炭素同位体分析器は、同時に12匹までから空気サンプルの自動サンプリングに適しています。この技術は、糖尿病やその他の長期にわたる疾患をもつマウスの大きいグループから胃排出の長手方向のフォローアップができます。

本稿では、マウスにおける胃排出能の非侵襲的測定にかかわる技術的および方法論的な考慮事項について説明します。ここに記載されたプロトコールに従うことによって、研究者は確実にかつ再現性胃排出に関する薬理学的薬剤の影響を研究し、基礎疾患や欠陥^6,8の治療への胃内容排出の応答に従って、疾患の発症に起因する空胃の変化を追うことができ^{、 11,12。}以前の出版物では^、13 Cオクタン酸呼気検査の適用は、ヒトおよび動物^3,8で胃排出を測定するのに便利な方法であることが示された。本稿では詳細に説明し、6から8を介して信頼性のあるデータを得るために必要な手続き糖尿病マウスにおける胃排出能の縦断的研究のために必要な数ヶ月。以前に公開されている方法と比較した場合、このプロトコルに従うことの利点は、治験責任医師がデータobtaineを保証することができるということですdは、信頼性と再現性になります。また、ここで記載されたガスのサンプルを収集し、分析するための自​​動化されたシステムは、研究で同時に追跡することができる動物の数が増加します。全体的に、この論文の目的は、テストに対するマウスの馴化を維持し、それが得られた結果のばらつきを軽減する重要な要因を特定することです。

胃排出能の in vivoでの測定では、マウスを一晩絶食させると一定のエアフローを透明なプラスチックの試験室に入れた。マウスをチューブに慣らさ取得した後、ベースラインは^、13 CO ₂濃度が決定され、気流がそれに応じて調整され吐き出さ。次に、我々は^、13 C標識オクタン酸と混合卵黄から成る試験食を投与する。マウスを絶食と訓練されているので、それらは一般的には2分以内に試験食を食べます。投与オクタン酸は胃で吸収されませんが、十二指腸で取り上げられることになるdは解放され、周囲の空気中の¹³ CO ₂の濃縮で、その結果、吐き出され^、13 CO _2、に肝臓で代謝されてしまいます。大気試料は決められた時間間隔で収集され、炭素同位体分析器によって分析される。このプロセス全体の律速段階は、胃排出能であり^、13 CO ₂の肺の排泄は、直接標識食事の胃排出能に対応しています。

図1胃排出装置の模式図。一晩絶食後、マウスを移動すると、それらを自由に回転できるように透明なチャンバー内に配置されます。入口管は、新鮮で一定の空気の流入を可能にし、コンセントは¹³の^C-to-12を測定するために同位体分析装置につながる呼気中のC比。チャンバは^[13 C] -オクタン酸を含む食品の配達のための中央のポートを持っています。

1。マウスのトレーニングと馴化

1. 分析に先立ち、試験条件にそれらを慣らすために、一定のエアフローと2から4時間の試験室ですべてのマウスを置く。これが顕著にそうでなければ胃排出遅延の異常検出が発生する可能性があり、ストレスレベルを低減します。マウスの胃排出実験が実行されていたかのように同じように扱う。オクタン酸を追加することなく、卵黄を（後述）を準備し、各マウスに0.2グラムを養う。
2. マウスは、十分に訓練されているまで（通常は2〜3倍）、このプロセスを繰り返します。環境条件が同じに保たれているようにしたマウスは、通常、簡単に限り、慣らされています。

注：非慣れたマウスは慣れたマウスは素早く静かに彼らの新しい環境と休息に定住しながら、チャンバーへの転送後、約1時間の周りに移動して、排便すると頻繁に排尿し続けています。

ノーTE：実験中：そのような過剰な排尿、排便、卵を食べることへの関心の欠如など、慣れの損失の兆候がモニター動物。このような場合は再度前胃排出データを取得するには空室に1-2回habituatingを検討してください。この実験をしている間に一貫性が極めて重要である。物事を正確に同じ方法を行うと、毎回は、信頼性と再現性のある結果を得るための唯一の方法です。これは彼らのケージメイトからマウスを分離しない、毎日同じ時刻に（ 例えば、インスリン）絶対に必要でない場合、マウスを絶食すると同時に、胃排出試験を開始し、マウスを扱うのと同じ方法で治療を与えることが含まれています。

2。試験食を含む同位体の調製

1. 50mlファルコンチューブに卵黄の5グラムを量り始めてください。新鮮な試験食を準備するために、各実験当日、これらの手順を繰り返します。
2. concentrとオクタン酸10μlを追加ファルコンチューブにスパチュラで1分間激しく卵とミックスを含む50mlファルコンチューブに2μlの/ gのation。
3. 卵をガラスビーカーに移し、それが凝固し、その一貫性は小さいボールを作るのに適しているまで、ブンゼンバーナーで加熱されています。これは、典型的には約30秒かかります。

注：卵黄のボールはマウス1匹当たり0.2グラムの重量を量るべきである。これは、すべてのマウスでは累積投与量を一定に保つことが重要です。

3。実験の開始

1. 食糞を防止するために、金属の "メッシュ底"断食ラック上（12時間）速いマウスは一晩、一回訓練を受けたと胃排出の準備が整いました。彼らは飲料水への無料アクセスを提供していることを確認してください。糖尿病マウスは、現在の実験で使用されているので、それらは以上16時間絶食させてはいけません。
2. 胃が空室を設定することで起動します。空気乾燥してきたクリーンチャンバーとカバーを使用しています。また、任意のアナライザまたはCO ₂空気供給源にチャンバーを接続するチューブが水分を含まなければなりません。水が分析装置により読み出された信号に干渉する可能性が
3. 一定の空気の流れを提供するインレットチューブにチャンバーを接続します。その後マシンにチャンバーから出口管を接続してください。チューブを閉じて空気の流れをオンにします。

注：彼らは簡単に閉じ、しっかりと密封されるようにカバーの蓋の端にワセリンの非常に少量を適用します。このタイトなシールは、マウスによって生成されたすべての二酸化炭素を回収することが必要である。

4。実験手順

1. 各マウスの重量を量ることから始めます。体重はその継続的健康の指標です。次に、適切なチャンバー内に各マウスを置きます。それは空気が、この時点でチャンバーに流入していることはもちろん重要です。
2. 測定を開始するには、マウスが調整前室に順応させて空気レベルをING。
3. マウスは数分かかることがあり、落ち着いて見えると、各マウス室用空気流量を調整します。これは、それぞれのマウスとは異なる場合があります。典型的には、空気の流れがCO _2が使用されているどのような機器で検出可能なレベルに達すると、レベルは健康的な空気の離職率を確保するのに十分に低いままであることを確認するために呼気ことを確認するために、実験開始時に調整されます。我々は、万人あたり1,000〜1,500部品との間の最初のCO ₂レベルを使用します。
4. 調整が困難な場合は、エア漏れをチェックします。その後、チャンバのそれぞれの処理を繰り返しますし、通気を行った調整は、CO ₂レベルを修正したかどうかを確認するために測定の別のラウンドを監視します。それは、マウスを供給する前に読んで着実にベースラインを得ることが重要である。我々は、自己校正機能を備えたマシンを使用しています。これがない場合はケース·キャリブレーションをチェックする必要があります。
5. これが達成されると、卵の食事の管理最初にマウスと記録時間に各マウスは食べ物を受け取ります。
6. 我々は、各マウスの¹³ CO _2の濃縮曲線をフィッティングのために十分な値を得るために、4時間の手順を実行します。マウスでCO ₂濃度は、マウスにはまだ安全であることを確認するために、すべての30〜60分を確認してください。
7. テストが終わった後のマウスはすぐに食べ始めることができるように、テストの終了前に食品を含む新しい箱を用意します。

三つの異なるマウスから設定の代表的なデータを図2に示します。黒いグラフは通常の胃排出能を持つマウスからのデータポイントを表します。それは、時間の関数として表される時間当たり投与量の割合として表される呼気に回収される¹³ Cの割合を示しています。青い曲線は、40分のT半値で加速胃排出能を持つマウスからのものであり、赤い曲線は、168分のT半値で空に遅延胃を持つマウスからです。として私たちの研究室^7、非糖尿病NODマウスの年齢のための正常な胃の半分を空に時間内に以前の研究で確立された灰色のボックスで表されるように62〜131分〜9から15週間の範囲である。データポイントは、次の式^（8）と非線形回帰曲線でフィッティングされています：

^{B E-CT}におけるy =

yは、の割合です 13 1時間あたりの呼吸（t）とで回収し、b及びcは、それぞれ息対時間曲線の推定回帰定数である。半分空 ​​にする時間（T _1/2）

逆ガンマ関数を用いた数値積分法から計算されます。我々は、約10％の生物学的なイントラマウス変動と数千人の研究からの結果を取得しています。

図2。胃排出三つの異なる法線を持つマウス（黒い曲線）、遅延（赤の曲線）と加速（青線）からの代表的な胃排出データ。灰色のボックスは、正常値を強調表示します。非線形回帰曲線の方程式は、ボックスに表示されます。

記載された技術は、本明細書で、マウスにおける固体胃排出能の in vivo測定で繰り返して、非侵襲することができます。このシステムでは、動物は、それらを移動して自由に回転できるように、測定室に拘束されないという利点があります。これは不慣れな環境であるため、マウスはまだ訓練され、胃内容排出へのストレスの影響を防ぐために試験室に慣れなければならない。一般的に、我々は連続した胃排出能テストの間のイントラマウスの変動が10％未満であれば胃排出データは信頼性があると仮定します。

このレポートでは、マウス^8,11,12で胃排出能測定に我々の以前の報告書の詳細な説明であり、システムのトラブルシューティングの問題についての追加情報が含まれます。主な変更は、ガスのレベルを測定するためのLGRの同位体分析器を使用することである。我々は本研究で用いたアナライザは^、12 COを測定 _{^2、13 CO 2とH 2 O濃度毎秒。複数の入力ユニットにコンピュータ制御されたバルブは自動的にマウス室ごとに25秒の間に検出器に流れを切り替える。したがって、12匹のマウスを同時に測定値との間に5分間隔で分析することができます。これは、データも呼気とその後の分析のマニュアルサンプリングすることによって得ることができることに留意しなければならない。手動でサンプリングするか、別のデバイスを使用している場合は、読み値が約10分間隔で取得されていることを確認します。私たちのシステムおよびサンプル収集の頻度の感度は、我々はこの改良された方法でより再現性のあるデータを得ることを発見した胃排出曲線がより、信頼性の高いフィットしやすく、そうであることを意味します。}

マウスはチャンバーへの馴化を失い、技術的な問題が検出sysで発生するときのマウスは、割り当てられた時間内に食事を食べることができない場合は、この方法に大きな落とし穴が発生するTEM。慣れの食事や損失を食べに失敗すると、通常、テストの定期的なスケジュールを持っていることの重要なステップに従うことではないの結果である。 7日以下で区切って、連続して3回のテストの後、私たちのマウスは、テストに慣れになると食事を食べる。マウスは実験の残りのために少なくとも2週間に1回テストしている場合は、一度慣れ、信頼性の高いデータが得られる。何らかの理由でマウスに3週間以上テストされていない場合は、2週間以内にトレーニングセッションは通常馴化を確実にするでしょう。動物を取り扱う職員は、次に変更する場合は、マウスの再訓練をアドバイス、それはマウスを扱う人々が強く香りの石鹸および/または香水の使用を阻止することが特に重要である。検出システムの難しさは、多くの場合、マウスのような小動物で生成された¹³ CO ₂の低レベルに起因しています。検出器は、較正され、そのような赤外線ベースのシステムのようにいくつかの検出のために、それは非常にIMPでなければなりません測定の前に、最小限にサンプルの含水率を低減することがortant。

治験責任医師は、同じマウスで3日に1度よりも頻繁に空に胃を勉強することを希望しない限り、この手法にはいくつかの制限があります。それはそう頻繁に速いマウスにはお勧めできませんし、定期的にそのような食事制限は、胃の機能を変更することができます。手法への変更は、液体胃排出能を測定するために作られ、それは方法の有用な潜在的なアプリケーションであることができます。

シンチ等胃排出を、測定または測定するための他の方法は、一定時間後にコンテンツを保持プロセスや各テストの終了時に動物を殺すために必要があるための応力に関する問題を含めかなり多くの制限があります。ストレッサーは、測定時の試験食又は動物の拘束の強制経口投与を含む。呼気検査の利点は、マウスで自由に移動して麻酔されていないということですまたは何らかの方法で鎮静。

要約すると^、13 C-オクタン酸呼気試験は、年齢や治療で病気の進行の研究を可能にし、これらのデータは、その後、同じ動物の他の生理学的パラメータおよび組織学的評価の変化と相関させることができる。他のアプリケーションの中で、テストはまた、薬が直接胃排出能と同様に胃の疾患または他の介入のために空の変化を開発し、動物における治療に対する反応を調査を変えることができる方法の研究を可能にします。

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

この映像公開はDK 68055プログラム·プロジェクト無償 "腸内系の病理"のための糖尿病および消化器腎臓病研究所（NIDDK）からの資金によって可能となった。クリストファーCreedonはロチェスター公立学校の指導プログラムによってサポートされていました。

我々は、事務補助やロスガトスリサーチ社（カリフォルニア州マウンテンビュー）から博士ダグラスベーアのために氏クリスティZodrow、技術支援のための氏ゲイリー·ストルツに感謝します。