Оценка опорожнения желудка не страдающих ожирением мышей с диабетом Использование [

Определение опорожнения желудка с помощью неинвазивных [ ¹³ C]-октановой кислоты дыхательный тест для отслеживания гастропареза в женской NOD мышей LTJ.

Опорожнения желудка исследованиях на мышах были ограничены неспособность следовать опорожнения желудка изменениями в то же животное, так как наиболее часто используемые методы требуют убийства животных и посмертное восстановление еды ^1,2. Такой подход предотвращает продольные исследования с целью определения изменений в опорожнения желудка с возрастом и прогрессирование заболевания. Обычно используется ^[13 C]-октановой кислоты дыхательный тест для людей ³ была модифицирована для использования в ^4-6 мышей и крыс ^7, и мы ранее показали, что этот тест является надежным и реагировать на изменения в опорожнения желудка в ответ на наркотики и во время диабетической прогрессирования заболевания ^8. В этом видео-презентация принципа и практическая реализация этого модифицированного теста объяснил. Как и в предыдущем исследовании, NOD мышей LTJ использовании модели сахарного диабета 1 типа ^9. Доля этих мышей развиваются симптомы гастропареза, осложнение СДES характеризуется задержкой опорожнения желудка без механического препятствия желудка ^10.

Эта статья демонстрирует, как обучение мышей для тестирования, как готовить еду тест и получить 4 часа опорожнения желудка данные и как анализировать полученные данные. Анализатор изотопа углерода, используемые в настоящем исследовании подходит для автоматической выборки проб воздуха на расстоянии до 12 мышей в то же время. Эта техника позволяет продольные наблюдения за опорожнение желудка от больших групп мышей с диабетом или другими давней болезни.

Эта рукопись описывает технические и методологические соображения, связанные с неинвазивного измерения опорожнение желудка у мышей. Следуя методике, описанной здесь, следователи могут надежно и воспроизводимо следить за изменениями в опорожнения желудка за счет развития заболеваний, изучение влияния фармакологических препаратов на опорожнение желудка и последующей реакции опорожнения желудка для лечения основного заболевания или дефекты, ^{6,8, 11,12.} В предыдущих публикациях, применения ¹³ C октановой кислоты тесты дыхание было показано, быть полезным способом измерения опорожнение желудка у человека и животных ^3,8. Эта статья подробно описывает, процедур, необходимых для получения достоверных данных по 6 до 8 месяцев необходимо для продольного исследования опорожнения желудка у мышей с диабетом. Преимущества после этого протокола, по сравнению с ранее опубликованными методами, что следователь может быть уверен данных obtaineD будут надежными и воспроизводимыми. Кроме того, автоматизированная система для сбора и анализа проб газа, описанные здесь увеличивается число животных, которых может следовать одновременно в исследовании. В целом, целью данной работы является выявление ключевых факторов, которые поддерживают привыкания мышей в тесте и уменьшить различия в полученных результатах.

Для измерений в естественных условиях опорожнения желудка, мышей голодали в течение ночи и положить в прозрачный пластиковый камер тестирование с постоянным потоком воздуха. После мышей получить привыкли к трубкам, базовые выдыхаемом ¹³ CO ₂ уровней определяются и воздушного потока соответствующим образом скорректированы. Далее, мы администрирование теста обед, состоящий из яичного желтка смешать с ¹³ C-меченых октановой кислоты. Поскольку мышей постился и обучены, они обычно едят тест еды в течение 2 мин. Вводить октановой кислоты не всасывается в желудке, но будут рассмотрены в двенадцатиперстной кишкеD получит метаболизируется в печени в ¹³ CO _2, который выделяется и выдохнул, в результате обогащения ¹³ CO ₂ в окружающем воздухе. Пробы воздуха собираются в определенные интервалы времени и анализировали с помощью анализатора изотоп углерода. Ограничение скорости шаг в этом весь процесс опорожнения желудка и легочной выделение ¹³ CO ₂ непосредственно соотносится с опорожнением желудка меченого еды.

Рисунок 1. Схема аппарата желудка опорожнения. После ночного голодания, мышей помещают в прозрачную камер позволяет им двигаться и вращаться свободно. Впускной трубы позволяет свежим воздухом и постоянным притоком и выходом приводит к изотопа анализатора для измерения ^{13 C-к-12}C соотношение в выдыхаемом воздухе. Камера также имеет центральный порт для доставки продуктов, содержащих ^[13 C]-октановой кислоты.

1. Обучение и привыкание Мыши

1. Перед проведением анализа, поставить всех мышей в тестировании камеры в течение 2-4 часов с постоянным воздуха для того, чтобы приучить их к тестированию условиях. Это заметно снижает уровень стресса, которые могли бы привести к аберрантной обнаружения задержкой опорожнения желудка. Лечение мышей так же, как если опорожнение желудка эксперимент был запущен. Подготовка яичным желтком (см. далее) без добавления октановой кислоты и 0,2 г корм для каждой мыши.
2. Повторите этот процесс до мышей достаточную подготовку (обычно 2-3 раза). Мыши обычно легко привыкли тех пор, пока условия окружающей среды сохраняются.

Примечание: Не привыкшая мышей продолжать двигаться вокруг в течение около 1 часа после перевода в палату, и испражняться и мочиться чаще, в то время привыкшей мышей быстро оседают в их новой среде и остальные тихо.

НетTe: Во время эксперимента: Monitor животных на наличие признаков потери привыкание, такие как избыточный мочеиспускание, дефекация, отсутствие интереса к еде яйца. Если это так, рассмотреть вопрос о повторном обитающих в пустой камере 1-2 раза до получения опорожнения желудка данные. Последовательность является чрезвычайно важным при выполнении этого эксперимента. Делать вещи точно так же каждый раз, когда это единственный способ получить надежные и воспроизводимые результаты. Это включает в себя предоставление лечения (например, инсулина) каждый день в то же время, не отделяя их от мышей клетки-помощники если это абсолютно необходимо, пост мышей и запуск тестов опорожнение желудка в то же время и обработки мышей таким же образом.

2. Подготовка Изотопный содержащих тестовые Питания

1. Начните с весом из 5 г яичных желтка в 50 мл трубки сокола. Повторите эти шаги каждый день эксперимента подготовить свежую еду теста.
2. Добавить 10 мкл октановой кислоты с концентрATION 2 мкл / г до 50 мл Сокол пробирку, содержащую яйца и смешать энергично в течение 1 мин с помощью шпателя в трубке сокола.
3. Яйцо затем переносят в стеклянный стакан и нагревают над горелкой Бунзена, пока она свертывается и его соответствие подходит, чтобы сделать небольшие шарики. Это обычно занимает около 30 сек.

Примечание: шары яичный желток должен весить 0,2 г на мышь. Это важно, чтобы суммарная доза постоянной во всех мышей.

3. Запуск эксперимента

1. Как только обученные и готовые к опорожнению желудка, быстро мышей в течение ночи (12 часов) на металл "сетку вниз" пост стойку, чтобы предотвратить копрофагия. Убедитесь, что они имеют свободный доступ к питьевой воде. С диабетических мышей используются в текущем эксперименте, они не должны быть постился в течение более чем 16 часов.
2. Начните с создания опорожнения желудка камерах. Используйте чистые камеры и крышки, которые были сушат на воздухе. Кроме того, любойТрубы подключении камеры к анализатору или CO ₂ воздуха должна быть влага свободно; вода может влиять на сигнал считывается анализатором
3. Подключите камеры на входе трубы, которые обеспечивают постоянный поток воздуха. Затем соедините выход трубы из камер к машине. Закройте трубы и включить поток воздуха.

Примечание: нанесите очень небольшим количеством вазелина в конце крышки крышки, чтобы они закрываются просто и надежно запечатан. Это уплотнение необходимо собрать все углекислого газа, мышей.

4. Экспериментальные процедуры

1. Начните с весом каждой мыши. Масса тела является мерой их постоянной хорошего здоровья. Затем поместите каждой мыши в соответствующую камеру. Это, конечно, важно иметь воздуха, поступающего в камеру на этот раз.
2. Чтобы начать измерение, позволяет мыши, чтобы акклиматизироваться к камер до отрегулироватьING воздух уровней.
3. Как только мышь казаться спокойным, которая может занять несколько минут, регулировать скорость воздушного потока для каждой мыши камере. Это может быть различным для каждой мыши. Как правило, поток воздуха регулируется в начале эксперимента, чтобы убедиться, что выдыхаемого CO ₂ достигает уровня обнаруживается любое оборудование используется, и убедитесь, что уровень остается достаточно низким, чтобы обеспечить здоровое оборот воздуха. Мы используем начальные уровни CO ₂ от 1000 до 1500 частей на миллион.
4. Если возникли трудности с настройками, проверить на герметичность воздухом. Затем повторите процесс для каждой из камер и наблюдать за один раунд измерения, чтобы убедиться, коррективы, внесенные в воздушный поток исправили CO ₂ уровня. Важно, чтобы получить устойчивый базовый чтения до кормления мышей. Мы используем машину с себя функцию калибровки. Если это не так калибровки должны быть проверены.
5. Когда это будет достигнуто, администрирования яйцо едыв первую мышь и записывать время каждой мыши получает пищу.
6. Мы проводим процедуру в течение 4 часов, чтобы получить достаточно значений для установки ¹³ CO ₂ обогащения кривой для каждой мыши. Проверка на мышах каждые 30-60 минут, чтобы убедиться, что CO ₂ уровнях по-прежнему безопасна для мышей.
7. Подготовка новой коробки с едой до конца тест, чтобы мыши могут начать есть сразу после испытаний закончена.

Представитель набор данных с трех разных мышах показано на рисунке 2. Черная графика представляет точек данных от мыши с нормальным опорожнения желудка. Он показывает, доля ¹³ C, который подлежит возврату в выдыхаемом воздухе выражается в процентах от введенной дозы в час выражена как функция времени. Синяя кривая от мышей с ускоренным опорожнения желудка с T значение половине 40 мин, а красная кривая от мыши с задержкой опорожнения желудка с T значение половине 168 мин. Как установлено в ходе предыдущего исследования в нашей лаборатории ^7, 1/2 нормального желудочного опорожнения время, не страдающих диабетом мышей NOD возрасте 9-15 недель диапазоне от 62 до 131 мин в лице сером поле. Точек данных, то обтянутые нелинейной регрессии кривая по следующей формуле ^8:

У = ^б на ^e-кар

Где у процентах 13 C восстановился в дыхании в час (т) и А, В и С являются константами регрессии оценивается для каждого дыхания от времени кривой. Тайм опорожнения (T _1/2)

рассчитывается на основе численной процедуры интеграции с использованием обратного гамма-функция. Мы получили результаты из нескольких тысяч исследований с биологическими внутри мыши изменчивости около 10%.

Рисунок 2. Представитель опорожнения желудка данные из трех различных мышей с нормальным (черная кривая), задержка (красная кривая) и ускоренные (синяя кривая) опорожнение желудка. Коробку серого подчеркивает нормальных значений. Уравнение нелинейной регрессии кривых показана в поле.

Описанная методика позволяет здесь для многократного и неинвазивные в естественных условиях измерений твердых опорожнения желудка у мышей. Эта система имеет то преимущество, что животные не стеснены в измерительной камере, что позволяет им двигаться и вращаться свободно. Так как это незнакомой обстановке, мыши все еще должны быть обучены и привыкли к тестированию камер, чтобы предотвратить влияние стресса на опорожнение желудка. В общем, мы предполагаем, что опорожнение желудка данные являются достоверными, если внутри мыши изменчивость между последовательными опорожнения желудка испытаний составляет менее 10%.

Данный отчет является более подробное описание наших предыдущих докладах о опорожнения желудка измерений в мышах ^8,11,12 и включает в себя дополнительную информацию по устранению неисправностей проблемы с системой. Основная модификация является использование анализатора LGR изотопов для измерения уровня газа. Анализатор, который мы использовали в данном исследовании меры ¹² CO _{2, ¹³ CO 2 и H 2 O концентрацию каждую секунду. С компьютерным управлением клапанами в блоке со многими входами и автоматически переключать поток на детекторе между мышью камеры каждые 25 сек. Поэтому 12 мышей могут быть одновременно проанализированы с 5-минутным интервалом между измерениями. Следует отметить, что данные могут быть получены из ручного отбора проб выдыхаемого воздуха и последующего анализа. Если вручную выборки или с помощью другого устройства, убедитесь, что показания получены около интервалом 10 мин. Чувствительность нашей системы и частота отбора проб означает, что кривые опорожнение желудка являются более надежными, легче установить и таким образом, мы обнаружили, что мы получаем больше воспроизводимые данные с улучшенным методом.}

Основных проблем этого метода возникают, когда мышь не в состоянии съесть еды в течение отведенного времени, когда мыши теряют привыкания к камере и, когда технические проблемы возникают с обнаружением системытемпературы. Отказ от еды еды и потеря привыкания, как правило, следствие не следуют критическим шагом имеющие регулярный график для тестирования. После 3 последовательных тестов, разделенных 7 дней или менее, наши мышей привыкнуть к тесту и съесть еду. После привыкли, надежные данные получены, если мышей испытывают по крайней мере, раз в 2 недели до конца эксперимента. Если по какой-то причине мышей не были протестированы в течение 3 и более недель, затем две тренировки в течение недели, как правило, обеспечить привыкание. Если персонал работе с животными изменится, то переподготовки мышей рекомендуется, и это особенно важно, чтобы воспрепятствовать использованию сильно душистые мыла и / или духи от людей, работающих мышей. Трудности с системой обнаружения часто из-за низкого уровня ¹³ CO _2, порожденной мелких животных, как мышь. Детектор должен быть откалиброван и для некоторых детекторов, таких как инфракрасные систем, это очень импortant для уменьшения содержания воды в образце к минимуму до измерения.

Есть несколько ограничений этой методики, если следователь хочет учиться опорожнение желудка чаще, чем раз в 3 дня в той же мыши. Не рекомендуется для быстрой мышь так часто и такие диетические ограничения на регулярной основе может изменить функции желудка. Изменения в технике могут быть сделаны для измерения жидкого опорожнения желудка, и это полезная возможность применения этого метода.

Другие методы измерения опорожнение желудка, в том числе сцинтиграфии или измерения содержания сохранил после определенного времени, имеют значительно больше ограничений, в том числе вопросы со стрессом процесса или в связи с необходимостью убить животное в конце каждого теста. Стрессоры включают зонд от приема пищи теста или ограничением животных во время измерения. Преимущества дыхательного теста в том, что мышь свободно двигаться и не под наркозомили седативные в любом случае.

В целом, ¹³ C-октановой кислоты дыхательный тест позволяет исследовать прогрессирование заболевания с возрастом и лечения, и эти данные затем могут быть связаны с изменениями в других физиологических параметров и гистологического исследования того же животного. Среди других приложений, тест позволяет также изучение того, как наркотики могут напрямую изменить опорожнение желудка, а также исследования реакции на лечение у животных, которые развиваются изменения в опорожнения желудка из-за болезни или других мероприятий.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Это видео публикация стала возможной благодаря финансированию из Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний (NIDDK) по программе гранта "патобиологии кишечной системы" DK 68055. Кристофер Т. Creedon была поддержана общественностью Rochester Программа наставничества школы.

Мы благодарим г-н Гэри Штольц для оказания технической помощи, г-жа Кристи Zodrow на секретарскую помощь и д-р Дуглас Baer из Лос-Gatos Research, Inc (Mountain View, CA).