Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM'lerle): Fare Beyin izolasyon

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Hücre içi organel ve hücre şekli özel akışı içsel ve dışsal uyaranlara maruz bileşim, değişen yüksek dinamik yapılardır. Onların membranlar genellikle sinyal molekülleri ve membran bileşenlerinin ^1,2,3,4 alışverişi için hub haline tanımlanan temas sitelerde, yan yana. Endoplazmik retikulum (ER) ve ⁺ kanal mitokondri ilişkili-ER membran veya MAM ^4,5,6 olarak bilinir IP3 duyarlı Ca ² açılışında mitokondri arasında oluşan inter-organel zarı microdomains. Protein / lipit bileşimi ve bu membran temas sitelerin biyokimyasal özellikleri yaygın, özellikle hücre içi Ca ^{2 + 4,5,6} düzenlenmesinde kendi rolü ile ilgili olarak çalışılmıştır. ER ^+, ve bu sıfatla Ca ² mansap hücresel süreçlerin sayısız düzenleyen hücre içi Ca ² primer deposu olarak hizmet ⁺ sinyalizasyon dahiltranslasyon sonrası protein katlanması ve protein maturation7 uding. Mitokondri, diğer taraftan, bu şekilde alt-Ca ^{2 +} balanssızlık ^4,8 apoptotik yollarının önlenmesi başlatma sitosolik ^{Ca2 +} konsantrasyon tamponlama göre, ^{Ca2 +} homeostazını korumak. MAM ve dinamik yapısı onları ideal sitesi Ca ^{2 +} sinyalizasyon ve mitokondrial Ca ^{2 +} konsantrasyonu, lipit biyosentezi ve taşınması, enerji metabolizması ve hücre sağkalımı ^4,9,10,11,12 düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel hücresel mekanizmaları incelemek için yapar. Birçok protokol karaciğer doku ve kültürlenmiş hücrelerde ^13,14 bu microdomains saflaştırılması için tarif edilmiştir.

Dikkate önceden yayınlanmış yöntemleri alırsak, biz yetişkin fare beyin mitokondri ve MAM ve izolasyonu için bir protokol adapte var. Bu prosedür için biz ekstra bir saflaştırma adımı, yani bir Triton X100 ekstraksiyon, eklemiş hangi enables MAM arasında glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain (GEM) fraksiyonu izolasyonu. Bu GEM hazırlıklar plazma zarı veya diğer intrasellüler membranların elde caveolae ve lipid sallar, birkaç protein bileşenleri paylaştığı ve reseptör proteinlerinin kümeleme için puan toplamak olarak ve protein-protein etkileşimleri ^4,15 için çalışması önerilmiştir.

Aşağıdaki protokol fare beyin MAM ve GEM'lerle izolasyonu ve saflaştırılması için tasarlanmıştır

Çözümler mitokondri, MAM ve GEM'lerle izolasyonu için gerekli

Fraksiyonlama ham mitokondriyal hazırlığının sağlanması:

Çözelti A: 0.32 M sukroz, 1 mM NaHCO _3, 1 _mM MgCl2, 0.5 _mM CaCl2 + proteaz inhibitörleri (gerektiği kadar taze ekleyin)

Çözüm B: 0.32 M Sakkaroz, 1 mM NaHCO ₃ + proteaz inhibitörleri (gerektiği gibi, taze ekleyin)

MAM İzolasyon:

İzolasyon Orta: 250 mM mannitol, 5 mM HEPES pH 7.4, 0.5 mM EGTA,% 0.1 BSA

Gradyan Tamponu: 225 mM mannitol, 25 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM EGTA,% 0.1 BSA (nihai konsantrasyon)

GEM'lerle İzolasyon:

GEM çözündürücü Tamponu: 50 mM Tris-HCI, pH 8.8, 5 mM EDTA,% 1 SDS + proteaz inhibitörleri (gerekli olduğu gibi, taze ilave ediniz).

1. İlk Adım Subselüler Fraksiyonlama: Çekirdeğin çıkarılması, Unlysed Hücreler ve Hücresel Enkaz

1. CO ₂ odasında fare Euthanize.
2. Derhal, beyin kaldırmak yarıya, buz üzerinde 2 ml tüpler yerleştirin ve tartın.

Not: tüm prosedür boyunca beyin yarıları ayrı tutun. Aşağıda tek beyin yarı tedavisi için de geçerlidir.

3. 1 ml soğuk Çözüm A. büyük bir boşluk havaneli 15 toplam vuruş ile homojen içeren önceden soğutulmuş 2 ml cam Dounce doku öğütücü koyun yarım beyin.
4. Buz üzerinde, 15 ml şahin tüp aktarın ve seyreltik10 hacim w / v, örneğin, 0.225 g 2,25 ml kadar homojenat.
5. 4. 10 dakika için 1400 x g'de santrifüje örnek ° C.
6. Dikkatli bir şekilde buz üzerinde, süpernatanın ve bir 30 mL yuvarlak tabanlı cam santrifüj tüpüne transferi çıkarın. Pelet rahatsız değil emin olun.
7. Çözüm aynı 10 cilt halinde pelletini tekrar. A küçük bir açıklık havaneli, bir defada 1 ml 3-6 vuruş ile, aynı değirmeni homojenize edilir.
8. 4. 10 dakika ° C için 710 xg'de taze 15 ml şahin tüp ve santrifüj transfer Çekirdekler ve hücre artıkları bir tablet elde edilir.
9. Dikkatlice adım 1.6 kaydedilen süpernatant ile süpernatant ve havuz çıkarın.

2. İkinci Adım: Ham Mitokondri İzolasyon

1. 4, 10 dakika için 13,800 x g'de santrifüjleyin süpernatan ° C.
2. Buz üzerinde, bir Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü supernatant aktarın
3. Süspanse pelet 10 ciltlik Çözüm A. Bir küçük açıklık havaneli, bir defada 1 ml 3-6 vuruş ile, aynı değirmeni homojenize edilir.
4. Adım 2.1 olarak santrifüjleyin.
5. Adımları 2.2-2.4 tekrarlayın.
6. Çıkan pelet zenginleştirilmiş bir mitokondrial fraksiyonu olduğunu. Havuz süpernatantlar (sitoplazmada ve ER), parafilm ile kapak ve buz üzerinde tutmak.
7. Küçük bir açıklık havaneli 6 vuruş ile pelet yeniden süspanse edin, 4.8 ml / g taze bir homojenleştiricinin içinde, çözelti B (g özgün beyin ağırlığı ifade edilir).
8. Cam Pasteur pipet kullanarak, dikkatli bir biçimde, aşağıdaki gibi tüpün altına sonradan ekleme hiçbir baloncuklar oluşur sağlanması, bir Ultra-Sil Beckman santrifüj tüpünde bir süreksiz Sakaroz Gradyan hazırlanması:
   Resupended Pelet (0.32 M sukroz)
   3 ml 850 mM sukroz (1 mM NaHCO ₃₎
   3 ml 1 M sukroz (1 mM NaHCO ₃₎
   3 ml 1.2 M Sakkaroz (1 mM NaHCO içinde3)
9. 4 ° C'de 2 saat süreyle 82,500 x g'de santrifüjleyin Degrade sonunda çıkan ayrılık üç bant ve pelet üretecek: -; 2) ER, golgi, plazma membranları (0.85 M - 1 M arayüz) 0.85 M arabirimi) 1) miyelin ve diğer membran kirleticiler (0,32 M; 3) sinaptozomlar (1 M - 1.2 M arayüzü), 4) mitokondri ham (pelet) müteakip arıtma aşamaları için kullanılan

3. Mitokondri ilişkili ER Membran izolasyonu, MAM

1. Taze eklenmiş proteaz inhibitörleri içeren 2 ml İzolasyonu Ortamda bir beyin yarısından itibaren mitokondri taze izole ham süspanse edin.
2. Degrade Arabellek 8 yarım beyin ml başına ve Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü yer ile% 30 Percoll degrade hazırlayın.

* Not: d sonra doğru final konsantrasyon elde etmek için (1.43 kat) degrade tampon daha konsantre olun% 30 Percoll iluting.

3. Hazırlanan degrade üstüne Katman mitokondriyal süspansiyon YAVAŞÇA kabarcıkları önlemek için.
4. 30 dak, 4 ° C ve 95.000 x g'de santrifüje
5. 1. Bir cam Pasteur pipeti ile İLK Ağır Fraksiyonu (alt bant) çıkarın ve yeni bir yuvarlak tabanlı cam tüp aktarmak, buz üzerinde.
   2. Başka bir cam Pasteur pipeti ile İKİNCİ Işık Fraksiyonu (üst bant) çıkarın ve buz üzerinde, ayrı bir taze yuvarlak alt cam tüp transfer.
6. 4. 10 dakika için 6300 x g 10 ml izolasyon Orta ve santrifüj ile adım 3,5 toplanmış ve her iki fraksiyonu ° C. seyreltilir
7. , Adım 3.6 'de elde edilen ağır fraksiyondan süpernatan atın başka bir 10 ml izolasyon Orta ile pelet tekrar süspansiyon ve adım 3.6 gibi, yeniden santrifüjlenir. Sonuçta elde edilen topak kesir saf mitokondriyal olacaktır.
8. Işık Frac gelen supernatant aktarıntion buz üzerinde, bir Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü adım 3.6 elde. Pelet atın.
9. 1 saat, 4 ° C 100.000 xg'de tüp ve santrifüj doldurmak için adım 3.8 'de elde edilen süpernatant yeterli İzolasyon Orta Ekle Sonuçta elde edilen topak kesir MAM olacaktır. Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve atın.

Not: Bu aşamada, aynı zamanda 1 saat, 4 100,000 xg'de santrifüj ° C ile adım 2.6 olarak kaydedilir süpernatant. Topak kesir ER olması ve sitosolik kısmını süpernatant olacaktır.

4. Glycosphingolipid-zenginleştirilmiş Microdomains, GEM'lerle çıkarımı

1. Buz üzerinde 20 dakika süreyle Ekstraksiyon tampon 500 ul-1 ml saf mitokondri ve / veya MAM kesirler Lyse.
2. 4 de 2 dakika için 15,300 x g'de santrifüjleyin lizatları ° C.
3. Süpernatantlar (Triton X-100 çözünür malzeme) ve yeniden santrifüj granül Collect2 dakika için çözünür malzeme kalan çıkarmak için kullanılır. (Triton X-100 Mitokondri ekstre edilmiş ve / veya Triton X-100 ekstre MAM).
4. Tampon solubilising yılında pelet çözünür. Bu Çözelti halindeki materyale GEM fraksiyonlar temsil eder ve daha fazla analiz için de kullanılabilir.

Biz güvenle MAM, GEM'lerle ve fare beyin mitokondriyal kesirler izolasyonu ve saflaştırılması için tavsiye ederim bu protokolü kullanarak bizim deneyimlerine dayanarak. Özetlenen prosedür yüksek oranda tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Şekil 1'de bir Percoll degrade (adım 3.4) üzerine bir şekilde saf mitokondri ve MAM tabakasının temsilcisi görüntüsünü gösterebilir. MAM fraksiyonu mitokondri üzerinde yaygın ve geniş bant yukarı yapar iken içeren tanımlanmış, sütlü bandı, ultrasantrifüjdeki tüpün dibinde mitokondri (Mito-P) segregatlar saflaştırılmış. Bireysel gradyan gruplarından dikkatli kurtarma sonra, saflaştırılmış fraksiyonlar, bir lizis tampon içinde tekrar süspanse edilir SDS-poliakrilamid jelleri üzerinde ayrılmış ve PVDF membran üzerine kurutulur. Cıvata sonra fraksiyonlar ve bunların protein kompozisyon saflığı tespit edecek spesifik protein belirteçler için antikorların bir batarya ile sondajlanan edilir. Şekil 2A cytos dağılımını gösteririzole MAM ve mitokondriyal fraksiyonda, Olic ER ve mitokondriyal işaretleri. Saf mitokondri preparatlar ER ve sitosolik marker, her iki yoksun olması gerekir. MAM temas siteleri ER ve mitokondrial zarlar arasındaki yakın apozisyon bu saflaştırılmış preparatlar calreticulin (ER belirteci) ve Tom-20 (mitokondri işaretleyici) varlığını açıklar. Bu, MAM spesifik belirteçler FACL4 ve PACS2 yanı sıra, bu gibi IP3R-1 GRP75 ve ⁴ olarak bu alan içinde zenginleştirilmiş diğer belirteçler, kullanmak da mümkündür. MAM ayrıca GEM'lerle elde etmek için Triton X-100 ile elde edilebilir. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, lipid sallar ve / veya caveolae bileşenleri içeren bu microdomains, Caveolin-1 pozitif vardır.

Şekil 1. Mitokondriyal ilişkili ER membran (MAM) ve katmanlama bir resim gösterir ve safmitokondriyal fraksiyonları (mito-p).

Şekil 2. A) batı blot saflık ve sitozolik, ER ve Sitozolik mitokondriyal belirteçleri (sito) dağılımını kontrol etmek için çalıştırın gösterir - ER-, saf mitokondriyal fraksiyonları (mito-p) -. Ve MAM-kesirler B) Western blot MAM izole glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomains (GEM'lerle) ve Triton X-100 ekstre (Triton extr. MAM) fraksiyonlar saflaştınldı.

Intrasellüler membranlar arasında veya organel ve hücre plazma zarı arasındaki temas siteleri temel hücresel süreçler için dinamik sinyal platformlarda temsil etmektedir. Fizyolojik ve patolojik koşullarda hem altında işlev ve kompozisyon doğru karakterizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir arıtma protokolü gerektirir. Burada ayrıntılı yöntemler özellikle erişkin fare beyin MAM ve bunlara karşılık gelen GEM'lerle izolasyonu ve saflaştırılması için laboratuvar tarafından optimize edilmiştir. Bu protokol başarıyla çocuklarda ⁴ nörodejeneratif bir metabolik hastalığı nöronal hücre ölümüne yol açan ⁺ dengesizlik bu microdomains belirtin ve Ca ² apoptotik yolak aşağı altında yatan moleküler etkileyiciler tespiti için uygulamaya konmuştur.

Yazarların hiçbiri bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.

Biz ilk protokol tasavvur eden Renata Sano katkısını kabul. Ad'A. Genetik ve Gen Terapisi Sandalye Bahşedilen Çocuklar (JFC) için Kuyumcular tutar. Bu çalışma NIH hibe GM60905, DK52025 ve CA021764 ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Charities (Alsaç) tarafından finanse edildi.