Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.

Organelas intracelulares são estruturas altamente dinâmicas com diferentes forma e composição, que estão sujeitos a células específicas sinais intrínsecos e extrínsecos. As membranas são freqüentemente justapostas em locais de contato definidas, que se tornam centros de troca de moléculas de sinalização e componentes de membrana ^1,2,3,4. As inter-organellar microdomínios de membrana que são formados entre o retículo endoplasmático (ER) e das mitocôndrias durante a abertura do IP3-sensitive Ca ^{2 +} canal são conhecidos como as mitocôndrias associado-ER membranas ou mams ^4,5,6. A composição de proteína / lípido e propriedades bioquímicas dos sítios de contacto de membrana têm sido extensivamente estudadas em particular em relação ao seu papel na regulação da Ca ^{2 +} intracelular ^4,5,6. O ER serve como o armazenamento primário do Ca ^{2 +} intracelular, e, nessa qualidade regula uma variedade de processos celulares a jusante de sinalização de Ca ^{2 +,} including pós-traducional de dobragem de proteína e proteína maturation7. As mitocôndrias, por outro lado, manter a homeostase ^de Ca2 ^+, por tamponação citosólica ^{concentração} de Ca2 ⁺ que impede a abertura de vias apoptóticas jusante de Ca ^{2 + 4,8} desequilíbrio. A natureza dinâmica das MAMs torna locais ideais para dissecar mecanismos básicos celulares, incluindo Ca ^{2 +} de sinalização e regulação da mitocondrial Ca ^{2 +} sobrevivência concentração biossíntese de lipídios e transporte, metabolismo energético celular e ^{4,9,10,11,12.} Vários protocolos têm sido descritas para a purificação dessas microdomínios de tecido do fígado e células de cultura ^13,14.

Tomando métodos anteriormente publicados em consideração, nós adaptamos um protocolo para o isolamento de mitocôndrias e MAMs a partir do cérebro de rato adulto. Para este procedimento, nós adicionamos uma etapa de purificação extra, ou seja, uma extração de Triton X100, que enables o isolamento da fracção microdomínio enriquecido glicosfingolípidos (GEM) dos MAMs. Estas preparações GEM partes componentes de proteínas com várias cavéolas e lipídico jangadas, derivadas a partir da membrana plasmática ou outras membranas intracelulares, e são propostos para funcionar como pontos de recolha para a agregação de proteínas receptoras e de interacções proteína-proteína ^4,15.

O protocolo que se segue destina-se ao isolamento e purificação de MAMs e gemas de cérebro de rato

Soluções necessárias para o isolamento de mitocôndrias, MAMs e pedras preciosas

O fracionamento de obter preparação mitocondrial crua:

Solução A: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO _3, 1 mM _de MgCl2, 0,5 mM de CaCl ₂ + inibidores de protease (adicionar fresco, conforme necessário)

Solução B: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO ₃ Inibidores da Protease + (adicionar fresco, conforme necessário)

Isolamento MAMs:

Meio de isolamento: 250 mM de manitol, 5 mM de HEPES pH 7,4, 0,5 mM de EGTA, 0,1% BSA

Gradiente de tampão: 225 mM de manitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM de EGTA, 0,1% BSA (concentração final)

Isolamento GEMs:

Tampão GEM solubilizante: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, EDTA 5 mM, SDS a 1% + inibidores da protease (adicionar fresco, conforme necessário).

1. Fracionamento subcelular Primeiro Passo: Remoção de Núcleos, células não lisadas e restos celulares

1. Euthanize do mouse em câmara de gás _2.
2. Remover imediatamente cérebro, reduzir pela metade, coloque em tubos de 2 ml em gelo e pesar.

Nota: Mantenha as metades do cérebro separado durante todo o procedimento. O seguinte aplica-se ao tratamento de um meio único cérebro.

3. Cérebro lugar metade em um 2 ml de pré-refrigerados de vidro moedor de tecido Dounce contendo 1 ml de solução A. frio Misturar com 15 tacadas no total de um pilão grande folga.
4. Transferir para um tubo Falcon de 15 ml, em gelo, e diluahomogeneizados até 10 volumes w / v, por exemplo 0,225 g a 2,25 ml.
5. Centrifugar a 1.400 xg amostra durante 10 min a 4 ° C.
6. Cuidadosamente remover o sobrenadante e transferir para um tubo de centrífuga de 30 ml de fundo redondo de vidro, em gelo. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
7. Ressuspender o sedimento em 10 volumes dos mesmos de uma solução. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez.
8. Transferir para um tubo de 15 ml fresco falcon e centrifugar a 710 xg durante 10 min a 4 ° C. Isso resulta em um pellet de núcleos e restos celulares.
9. Cuidadosamente remover o sobrenadante e piscina com o sobrenadante guardado no passo 1.6.

2. Segunda Etapa: Isolamento mitocôndrias bruto

1. Centrifugar os sobrenadantes a 13.800 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo
3. Ressuspender o sedimento em 10 volumes de solução A. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez.
4. Centrifugar o passo 2.1.
5. Repita os passos 2,2-2,4.
6. O sedimento resultante é uma fracção enriquecida mitocondrial. Piscina os sobrenadantes (citosol e ER), cubra com parafilme e manter em gelo.
7. Ressuspender o sedimento com 6 golpes de um pilão de pequena folga, em 4,8 ml / g (g é referida ao peso do cérebro original) de solução B, em um homogeneizador de fresco.
8. Utilizando pipetas de Pasteur de vidro, preparar um gradiente de sacarose descontínuo de um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, adicionando subsequentemente a parte inferior do tubo, como se segue, com cuidado, assegurando que nenhum bolhas formam-se:
   Resupended Pellet (0,32 M de sacarose)
   3 ml de sacarose mM 850 (em 1 mM _de NaHCO3)
   3 ml de sacarose 1 M (em 1 mM _de NaHCO3)
   3 ml de sacarose 1,2 M (em 1 mM NaHCO3)
9. Centrifugar a 82.500 xg durante 2 horas a 4 ° C. A separação resultante, no final do gradiente irá produzir três bandas e uma pelota: 1) de mielina e de contaminantes de membrana outros (0,32 M - 0,85 M de interface), 2) ER, Golgi, as membranas plasmáticas (0,85 M - 1 M de interface); 3) sinaptossomas (1 M - 1,2 M de interface), 4) bruto mitocôndrias (pellet), que é utilizada para os passos de purificação subsequentes

3. Isolamento de mitocôndrias associada membrana ER, MAMs

1. Ressuspender o bruto fresco mitocôndrias isoladas a partir de uma metade do cérebro, em 2 ml de meio de isolamento contendo inibidores de protease recentemente adicionados.
2. Prepare um gradiente de Percoll 30% com Gradiente ml de buffer de 8 por metade do cérebro, e colocar em um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman.

* Nota: Certifique-tampão gradiente mais concentrado (1,43 vezes) para alcançar a concentração final correta depois diluting Percoll a 30%.

3. Suspensão mitocondrial camada em cima do gradiente preparado lentamente para evitar bolhas.
4. Centrifugar a 95.000 xg durante 30 min, 4 ° C.
5. 1. Remover a fracção pesada (banda inferior) PRIMEIRO com uma pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro de fundo redondo de fresco, em gelo.
   2. Remova a fracção leve (banda superior) SEGUNDA com outra pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro separado de fundo redondo, fresco, em gelo.
6. Diluir ambas as fracções recolhidas no passo 3.5 com 10 ml meio de isolamento e centrifugar a 6300 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Descartar o sobrenadante a partir da fracção pesada obtida no passo 3.6, ressuspender o sedimento com um outro meio de isolamento de 10 ml e centrifugar de novo, como no passo 3.6. O sedimento resultante será a fracção pura mitocondrial.
8. Transferir o sobrenadante do Frac Luzção obtida no passo 3.6 para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo. Descartar o sedimento.
9. Adicionar meio de isolamento suficientes para o sobrenadante obtido no passo 3.8 para encher o tubo e centrifuga-se a 100.000 xg durante 1 h, 4 ° C. O sedimento resultante será a fracção MAMs. Remova cuidadosamente e elimine o sobrenadante.

Nota: Nesta etapa, você também pode centrifugar a 100.000 xg durante 1 hora, 4 ° C, o sobrenadante salvo no passo 2.6. O sedimento será a fracção sobrenadante ER e a fracção citosólica.

4. Extração de glicoesfingolipídeos enriquecidas microdomínios, Gemas

1. Lisar as fracções puras mitocôndrias e / ou MAM em 500 ml-1 ul de tampão de extracção durante 20 minutos em gelo.
2. Centrifugar os lisados ​​a 15300 xg durante 2 min a 4 ° C.
3. Recolher os sobrenadantes (Triton X-100 o material solúvel) e re-centrifugação de pelotasdurante 2 minutos para remover o restante material solúvel. (Triton X-100 As mitocôndrias extraído e / ou Triton X-100 MAMs extraídos).
4. Solubilizar pelotas em solubilizantes Buffer. Este material solubilizado representa as fracções de gema e pode ser usado para análise posterior.

Com base em nossa experiência com o uso deste protocolo podemos seguramente recomendar para o isolamento e purificação de MAMs, Gemas e frações mitocondriais de cérebro de rato. O processo como descrito é altamente reprodutível e consistente. Na Figura 1 mostra uma imagem representativa da camada de forma pura e mitocôndrias MAMs em um gradiente de Percoll (passo 3.4). Uma banda, definida leitoso contendo purificado mitocôndrias (Mito-P) segrega na parte inferior do tubo de ultracentrífuga, enquanto que a fracção de MAM torna-se uma banda larga difusa, e acima da mitocôndria. Após a recuperação cuidadosa das bandas individuais de gradiente, as fracções purificadas são novamente suspensas num tampão de lise, separadas em géis de SDS-poliacrilamida e transferidas para membranas de PVDF. Blots são então sondadas com uma bateria de anticorpos para marcadores de proteínas específicas que irão averiguar a pureza das fracções de proteína e da sua composição. Figura 2A apresenta a distribuição dos Cytosmarcadores de Olic, ER e mitocondrial nos MAMs isoladas e frações mitocondriais. Preparações puras mitocôndrias deve ser desprovido de ambos os marcadores de ER e citosólica. A justaposição estreita entre ER e membranas mitocondriais nos locais de contacto MAM explica a presença de calreticulina (ER marcador) e Tom-20 (marcador mitocondrial) nessas preparações purificadas. Também é possível a utilização de marcadores específicos MAMs FACL4 e PACS2, assim como outros marcadores enriquecidas nestes domínios, tais como IP3R-1 e GRP75 ^4. Os MAMs pode ser adicionalmente extraída com Triton X-100 para se obter as gemas. Esses microdomínios, que contêm componentes de jangadas lipídicas e / ou cavéolas são caveolina-1 positivo, como mostrado na Figura 2B.

Figura 1. Mostra uma imagem da estratificação do mitocondrial associada ER membrana (MAMs) eo purofrações mitocondriais (Mito-p).

Figura 2. A) mostra manchas ocidentais correr para verificar a pureza ea distribuição de citosólica, ER e marcadores mitocondriais em citosólico (cito) -, ER, puros frações mitocondriais (Mito-p) -. E MAM-frações B) Western blot da purificado glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (Gems) e Triton X-100 (Triton extraídos Extr. MAMs) fracções isoladas de MAMs.

Os locais de contacto entre as membranas intracelulares ou entre organelas e da membrana plasmática de células representam dinâmicas plataformas de sinalização para os processos celulares básicos. A caracterização exata de sua função e composição em ambas as condições fisiológicas e patológicas requer protocolos de purificação confiáveis ​​e reprodutíveis. Os métodos descritos aqui foram especificamente optimizados pelo nosso laboratório para o isolamento e purificação dos MAMs e as suas gemas correspondentes a partir do cérebro do rato adulto. Este protocolo foi aplicado com êxito para a identificação dos efectores moleculares que especificam essas microdomínios, e estão subjacentes a jusante da via de apoptose de Ca ^{2 +} desequilíbrio que leva à morte da célula neuronal na doença neurodegenerativa metabólica em crianças de ^4.

Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de interesse a declarar.

Reconhecemos a contribuição de Renata Sano na concepção do protocolo inicial. Ad'A. detém os joalheiros para Crianças (JFC) cadeira dotada de Genética e Terapia Gênica. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH GM60905, DK52025 e CA021764, e os americanos libaneses sírios Charities Associados (ALSAC).