Las mitocondrias asociadas ER membranas (MAM) y glicoesfingolípidos microdominios enriquecidos (GEMS): Aislamiento de cerebro de ratón

Este procedimiento muestra cómo aislar del cerebro del ratón adulto las membranas de las mitocondrias ER-asociados o mams y los glucoesfingolípidos fracciones enriquecidas microdominio de MAM y preparaciones mitocondriales.

Orgánulos intracelulares son estructuras altamente dinámicas con diferentes forma y composición, que son sometidos a células específicas de señales intrínsecas y extrínsecas. Sus membranas son a menudo yuxtapuestos en sitios de contacto definidas, que se convierten en los cubos para el intercambio de moléculas de señalización y los componentes de membrana ^1,2,3,4. Los inter-organellar microdominios de membrana que se forman entre el retículo endoplasmático (ER) y la mitocondria en la apertura de la Ca ^IP3-2 sensible son conocidos canal ⁺ como las mitocondrias asociado-ER membranas o MAMS ^4,5,6. La composición de proteína / lípido y propiedades bioquímicas de estos sitios de membrana de contacto han sido ampliamente estudiados en particular en relación con su papel en la regulación intracelular de Ca ^{2 + 4,5,6.} El ER sirve como el almacén principal de la concentración de Ca ^{2 +,} y en esta capacidad regula una gran variedad de procesos celulares aguas abajo de Ca ^{2 +} señalización, including post-traduccional plegamiento de la proteína y proteína maturation7. Las mitocondrias, por otra parte, mantener la homeostasis del Ca ^{2 +,} por la precarga de concentración citosólica de Ca ^{2 +} evitando de este modo la iniciación de las vías de apoptosis aguas abajo de Ca ^{2 +} desequilibrio ^4,8. La naturaleza dinámica de los mames hace sitios ideales para diseccionar los mecanismos básicos celulares, incluyendo Ca ^{2 +} señalización y regulación mitocondrial de Ca ^{2 +} concentración supervivencia, la biosíntesis de lípidos y el transporte, la energía y el metabolismo celular ^{4,9,10,11,12.} Varios protocolos se han descrito para la purificación de estos microdominios de tejido hepático y células cultivadas ^13,14.

Tomando los métodos publicados anteriormente en cuenta, se ha adaptado un protocolo para el aislamiento de las mitocondrias y MAM desde el cerebro de ratón adulto. Para este procedimiento se ha agregado una etapa de purificación adicional, a saber, una extracción de Triton X100, que enables el aislamiento de la glicoesfingolípido enriquecido microdominio (GEM) de la fracción de los mames. Estas preparaciones GEM comparten varios componentes de proteínas con balsas caveolas y lípidos, derivados de la membrana de plasma u otras membranas intracelulares, y se proponen para funcionar como puntos de encuentro para el agrupamiento de proteínas receptoras y para las interacciones proteína-proteína ^4,15.

El siguiente protocolo está diseñado para el aislamiento y purificación de MAM y gemas de cerebro de ratón

Soluciones necesario para el aislamiento de las mitocondrias, MAM y gemas

Fraccionamiento de obtener preparación mitocondrial crudo:

Solución A: 0,32 M sacarosa, 1 mM NaHCO _3, 1 mM MgCl _2, 0,5 mM CaCl ₂ + Inhibidores de la proteasa (añada fresca, según sea necesario)

Solución B: 0,32 M de sacarosa, 1 mM NaHCO ₃ + Inhibidores de la Proteasa (agregar fresco, según sea necesario)

MAM aislamiento:

Medio de aislamiento: 250 mM de manitol, 5 mM de HEPES, pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA

Tampón de gradiente: 225 mM de manitol, 25 mM de HEPES, pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (concentración final)

GEMs aislamiento:

GEM solubilizantes Tampón: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + inhibidores de proteasa (agregar fresco, según sea necesario).

1. Fraccionamiento subcelular Primer Paso: Las células de eliminación de los núcleos, no lisadas y restos celulares

1. Eutanasiar ratón en la cámara de CO _2.
2. Retire inmediatamente cerebro, reducir a la mitad, colocar en tubos de 2 ml en hielo y pesar.

Nota: Mantenga mitades del cerebro separado a lo largo de todo el procedimiento. Lo siguiente se aplica para el tratamiento de un medio único cerebro.

3. Place cerebro medio en un pre-refrigerados 2 molino de vidrio tejido Dounce ml que contiene 1 ml de solución fría A. Homogeneizar con 15 golpes de una mano de mortero total de espacio libre grande.
4. Transferir a un tubo Falcon de 15 ml, en hielo, y se diluyehomogeneizado hasta 10 volúmenes p / v, por ejemplo, 0,225 g a 2,25 ml.
5. Centrifugar la muestra a 1.400 xg durante 10 min a 4 ° C.
6. Retirar con cuidado el sobrenadante y transferir a un 30 ml de fondo redondo de tubo de centrífuga de vidrio, en hielo. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
7. Resuspender el precipitado en las mismas 10 volúmenes de la solución A. Homogeneizar en el mismo molino, con 3-6 golpes de una mano de mortero de espacio libre pequeño, 1 ml a la vez.
8. Transferir a un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 710 xg durante 10 min a 4 ° C. Esto da como resultado un sedimento de núcleos y restos celulares.
9. Retire con cuidado el sobrenadante y la piscina con el sobrenadante guardó en el paso 1.6.

2. Segundo Paso: Aislamiento mitocondrias crudo

1. Centrifugar los sobrenadantes a 13.800 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, en hielo
3. Resuspender el sedimento en 10 volúmenes de solución A. Homogeneizar en el mismo molino, con 3-6 golpes de una mano de mortero de espacio libre pequeño, 1 ml a la vez.
4. Centrifugar como el paso 2.1.
5. Repita los pasos 2.2-2.4.
6. El sedimento resultante es una fracción enriquecida mitocondrial. Reunir los sobrenadantes (citosol y ER), cubrir con parafilm y mantener en hielo.
7. Resuspender el precipitado con 6 golpes de una mano de mortero pequeña holgura, en 4,8 ml / g (g se refiere al peso del cerebro original) de la solución B, en un homogeneizador fresco.
8. Utilizando pipetas Pasteur de vidrio, preparar un gradiente discontinuo de sacarosa en un tubo de centrífuga Beckman Ultra-Clear, añadiendo posteriormente a la parte inferior del tubo de la siguiente manera, cuidadosamente, asegurándose de que no se forman burbujas:
   Resupended Pellet (0,32 M de sacarosa)
   3 ml 850 mM de sacarosa (en 1 mM NaHCO ₃₎
   3 ml 1 M de sucrosa (en 1 mM NaHCO ₃₎
   3 ml 1,2 M de sucrosa (en 1 mM NaHCO3)
9. Centrifugar a 82.500 xg durante 2 horas a 4 ° C. La separación resultante al final del gradiente se producen tres bandas y un pellet: 1) la mielina y otros contaminantes de membrana (0,32 M - 0,85 M interfaz), 2) ER, Golgi, las membranas plasmáticas (0,85 M - 1 M interfaz); 3) sinaptosomas (1 M - 1,2 M interfaz), 4) crudo mitocondrias (pellet) que se utiliza para las etapas de purificación posteriores

3. Aislamiento de mitocondrias asociada a la membrana ER, MAM

1. Resuspender el crudo recién aisladas las mitocondrias de una mitad del cerebro, en 2 ml de medio de aislamiento que contiene recién añadidos inhibidores de la proteasa.
2. Preparar un gradiente de Percoll al 30% con tampón Gradient 8 ml por cada mitad del cerebro, y colocar en un tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman.

* Nota: Asegúrese de tampón de gradiente más concentrado (1,43 veces) para lograr la correcta concentración final después diluting Percoll al 30%.

3. Capa de suspensión mitocondrial en la parte superior del gradiente preparado lentamente para evitar las burbujas.
4. Centrifugar a 95.000 xg durante 30 min, 4 ° C.
5. 1. Retire la fracción pesada (banda inferior) primero con una pipeta Pasteur de vidrio y transferir a un tubo de vidrio de fondo redondo, fresco, en hielo.
   2. Retire la fracción ligera (banda superior) SEGUNDA con otra pipeta Pasteur de vidrio y transferir a un tubo nuevo aparte de vidrio de fondo redondo, sobre el hielo.
6. Diluir ambas fracciones recogidas en el paso 10 con 3,5 ml de medio de aislamiento y se centrifuga a 6.300 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Eliminar el sobrenadante de la fracción pesada obtenida en el paso 3,6, resuspender el precipitado con otro 10 ml de medio de aislamiento y se centrifuga de nuevo, como paso 3,6. El sedimento resultante será la fracción mitocondrial puro.
8. Transferir el sobrenadante a partir de la luz Fracción obtenida en el paso 3,6 a un tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, en hielo. Descartar el sedimento.
9. Añadir medio de aislamiento suficiente para el sobrenadante obtenido en el paso 3,8 para llenar el tubo y centrifugar a 100.000 xg durante 1 h, 4 ° C. El sedimento resultante será la fracción de MAM. Con cuidado, retirar y desechar el sobrenadante.

Nota: En este paso, es posible que también se centrifuga a 100.000 xg durante 1 hora a 4 º C, el sobrenadante guardado en el paso 2.6. El sedimento será la fracción de ER y el sobrenadante de la fracción citosólica.

4. Extracción de glicoesfingolípidos-microdominios enriquecidos, gemas

1. Lyse fracciones puras mitocondrias y / o MAM en 500 l-1 ml de tampón de extracción durante 20 min en hielo.
2. Centrifugar lisados ​​a 15.300 xg durante 2 min a 4 ° C.
3. Recoger los sobrenadantes (Triton X-100 material soluble) y pellets de centrífuga de re-durante 2 minutos para retirar los restos de material soluble. (Triton X-100 extrae mitocondrias y / o Triton X-100 MAM extraídos).
4. Solubilizar gránulos en la solubilización de Estabilización. Este material solubilizado representa las fracciones de GEM y se puede utilizar para el análisis adicional.

Basándonos en nuestra experiencia con el uso de este protocolo con seguridad puedo recomendar para el aislamiento y purificación de MAM, gemas y fracciones mitocondriales de cerebro de ratón. El procedimiento presentado es altamente reproducible y consistente. En la Figura 1 se muestra una imagen representativa de la forma pura capa de mitocondrias y MAM en un gradiente de Percoll (paso 3,4). De una banda definida, lechoso que contiene purificó mitocondrias (Mito-P) se segrega en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga, mientras que la fracción MAM constituye una banda difusa y amplia por encima de la mitocondria. Después de la recuperación cuidadoso de las bandas individuales de gradiente, las fracciones purificadas se resuspenden en un tampón de lisis, se separaron en geles de poliacrilamida SDS y se transfirieron a membranas de PVDF. Las transferencias se probaron con una batería de anticuerpos para marcadores específicos de la proteína que va a determinar la pureza de las fracciones y su composición de proteínas. Figura 2A muestra la distribución de Cytosmarcadores Olic, ER y mitocondrial en los MAM aislados y fracciones mitocondriales. Pure preparativos mitocondrias debe estar desprovisto de ambos marcadores ER y citosólica. La aposición estrecha entre ER y las membranas mitocondriales en los sitios de contacto MAM explica la presencia de calreticulina (ER marcador) y Tom-20 (marcador de mitocondria) en estas preparaciones purificadas. También es posible utilizar MAM marcadores específicos FACL4 y PACS2, así como otros marcadores enriquecidos dentro de estos dominios, tales como IP3R-1 y ⁴ Grp75. El MAM se extrae adicionalmente con Triton X-100 para obtener las gemas. Estos microdominios, que contienen componentes de las balsas de lípidos y / o caveolae son caveolina-1 positivo, como se muestra en la Figura 2B.

Figura 1. Muestra una imagen de las capas de la membrana mitocondrial asociada a ER (MAM) y el purofracciones mitocondriales (mito-p).

Figura 2. A) muestra transferencias Western funcionar para comprobar la pureza y la distribución de citosólica, ER y marcadores mitocondriales en citosólicas (cito) -, ER-, puros fracciones mitocondriales (mito-p) -. Fracciones y MAM-B) Western blots de la purificado glucoesfingolípidos microdominios enriquecidos (GEM) y Triton X-100 (fracciones extraídas Triton extr. MAM) aisladas de MAM.

Los sitios de contacto entre las membranas intracelulares o entre orgánulos y la membrana plasmática de las células dinámicas representan plataformas de señalización para los procesos celulares básicos. La caracterización exacta de su función y composición, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas requiere protocolos de purificación fiables y reproducibles. Los métodos detallados aquí han sido específicamente optimizada por nuestro laboratorio para el aislamiento y purificación de los MAM y sus gemas correspondientes del cerebro de ratón adulto. Este protocolo se ha aplicado con éxito para la identificación de los efectores moleculares que especifican estos microdominios, y subyacen aguas abajo de ruta apoptótica de Ca ^{2 +} desequilibrio que conduce a la muerte celular neuronal en enfermedades neurodegenerativas metabólico en niños de ^4.

Ninguno de los autores tiene conflicto de intereses que declarar.

Reconocemos la contribución de Renata Sano en la concepción del protocolo inicial. Ad'A. contiene los joyeros de la Infancia (JFC) Cátedra de Genética y Terapia Génica. Este trabajo fue financiado en parte por el NIH subvenciones GM60905, DK52025 y CA021764, y los americanos libaneses Caridades sirios asociados (ALSAC).