Method Article
Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma sağlar In vivo Deneysel sistemler.
Vivo deneysel modellerde olan adaptif bağışıklık inceleyen araştırmacılar için temel bir gereklilik kendi T hücre antijen reseptör (TCR) özgüllük esas T hücreleri belirlemek için bir yetenek. Pek çok dolaylı yöntemlerle T-hücrelerinin bir yığın nüfus belirli bir antijen ile epitopu özgü T hücreleri proliferasyonu, sitokin üretimi, ya da aktivasyonu 1 ifadesi olarak işlevsel bir yanıt ölçümü ile tespit edilir ile in vitro uyarılmış olduğu kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birçok olası fonksiyon gösteren bir epitopuna özgü T hücreleri belirlemek, ve saf haberci frekanslarda epitopa spesifik T hücreleri saptamak için yeterli değildir. Popüler bir alternatif, TCR transjenik adoptif aktarım modeli olan bir TCR transjenik fare monoklonal T hücreleri EASI olabilir epitopa spesifik T-hücrelerinin geniş bir haberci nüfus oluşturmak için histocompatible taşıyıcılara yerleştirildiği tohumlanmıştırly bir congenic işaretleyici antikor 2,3 kullanımı ile izlenir. Güçlü olmakla birlikte, bu yöntem, 4,5, tek bir epitopu için spesifikliğe sahip olan T hücrelerinin unphysiological frekansı ile ilişkili deneysel eser uğrar. Ayrıca, bu sistem, bir poliklonal popülasyon içindeki epitopa spesifik T hücre klonlarının fonksiyonel heterojen araştırmak için kullanılamaz.
MHC (pMHC) kompleksleri: kazanılmış bağışıklık incelemek için ideal bir şekilde sadece kendi akraba peptid bağlayıcı ile TCR özgüllük ayıran bir yöntem kullanılarak, endojen T-hücresi epitopu repertuarından-spesifik T hücrelerinin doğrudan saptanması içermelidir. PMHC tetramerleri ve akış sitometrisi kullanımı bu 6 gerçekleştirir, ancak şu antijen kaynaklı klonal büyüme bulunamadı epitopa spesifik T-hücrelerinin yüksek frekans popülasyonlarının tespiti ile sınırlıdır. Bu protokol, bir pMHC tetramerleri kullanımı ile koordine yöntem ve magnezyum tanımlamaktik hücre zenginleştirme teknoloji fare lenf dokuları 3,7 son derece alçak frekans epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlamaktır. Bu teknik sayesinde, bir kapsamlı immün yanıtın tüm aşamalarında farelerde endojen T hücrelerinin tamamı epitop özel popülasyonlarda izleyebilirsiniz.
1. Lenfoid Doku gelen Hücre İzolasyonu
2. Tetramer Boyama
3. Manyetik Zenginleştirme
4. Akış Sitometri
5. Veri Analizi
Şekil 2'de daha önceden ilgili peptid + CFA ile bağışık hale getirilen farelerin için temsilci veriler göstermektedir iken Şekil 1, saf farelerden alınan pMHCII tetramer zenginleştirilmiş dalak ve lenf düğümü numuneleri için temsili akış sitometrisi parselleri göstermektedir. Seri yolluk CD4 analizi + T hücre popülasyonlarının gelen autofluorescent ve diğer istenmeyen olaylar kaldırır. CD8 + T hücre populasyonunun CD4 pMHCII tetramer boyama + T hücreleri için kullanışlı bir iç negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Zenginleştirme bağlı kesirler genellikle yolluk daha zorlu hale, ilişkisiz fraksiyonları hariç autofluorescent hücrelerin daha büyük bir bölümünü içeren unutmayın.
Bir örnek olarak epitopu-spesifik T hücrelerinin mutlak sayılarının belirleyiciler olarak, tetramer + vardır, bu hücrelerin oranı ile, boncuk sayısı analizi ile belirlendiği gibi, zenginleştirilmiş örnek bağlı fraksiyonu içinde tüm hücrelerin toplam sayısı çarpılarak hesaplanırHücre boyama analizi (Kutu 1) Ned.
Şekil 1 'de saf fare için, numunenin bağlı fraksiyonu içinde tüm hücrelerin konsantrasyonu (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / ml idi. Örnekteki tüm hücrelerin toplam sayısı (6.31 x 10 6 / ml) (0.095) = 6.00 x 10 5. Son olarak, epitop-spesifik toplam CD4 + T hücre sayısı olduğu (6.00 x 10 5) (% 41.5) (% 96.6) (% 10.2) (% 62.3) (0.64%) = 98.
Şekil 2 'de immünize fare için, numunenin bağlı fraksiyonu içinde tüm hücrelerin konsantrasyonu (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / ml idi. Örnekteki tüm hücrelerin toplam sayısı (1.43 x 10 7 / mL) (0.095) = 1.36 x 10 6. Nihayet, epitop-spesifik CD4 sayısı + T hücreleri (1.36 x 10 6) (% 40.9) (% 93.9) (9.54%) (72.0%) (42.7%) = 1.53 x 10 4 <> / Strong.
Epitopa spesifik T hücrelerinin sayısını gibi zenginleştirme azalır 8 verim artar, böylece tetramer + hücrelerinin epitopa spesifik T-hücrelerinin çok yüksek frekanslar içeren örneklerin ilişkisiz bir fraksiyonu olarak görülebilir. Bu gibi durumlarda, epitopa spesifik T hücrelerinin sayısını ilişkisiz fraksiyonunda mevcut ayrı ayrı hesaplanır ve bağlı fraksiyonu içinde bulunan numarası için ilave edilebilir. Bu nedenle, Şekil 2 'de, örnek ilişkisiz fraksiyonu içinde tüm hücrelerin konsantrasyonu (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / ml, bütün hücrelerin toplam sayısı (7,46 x 10 7 / ml) (2.0) = 1.49 x 10 8 ve epitopu özgü CD4 toplam sayısı + T hücreleri (1.49 x 10 8) (% 62.7) (% 96.4) (% 44.5) (% 54.7) (0,0409 %) = 8.97 x 10 3. İlişkili ve ilişkisiz fraksiyonları numaraları ekleme, 1.53 x 10 4 + 8.97 x 10 3 = 2.43 vardır x10 4 toplam epitop-spesifik CD4 + tüm örneklem T hücreleri. Epitopa spesifik hücre genişleme yeterince güçlü olması durumunda Nitekim, zenginleştirme işlemi atlanabilir.
Florokrom | Antikor |
Pacific Blue | dökümü (B220, CD11b, CD11c F4/80) |
Pasifik Turuncu | CD8 |
FITC | CD3 |
PE | pMHC tetramer veya fenotipik belirteç |
PerCP | CD4 |
APC | pMHC tetramer veya fenotipik belirteç |
AlexaFluor 700 | CD44 |
Tablo 1. Antikor boyama stratejisi Önerilen
: İçerik-width = "6in" fo: src = src = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg" / "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg">
Şekil 1. Epitopu özgü CD4 akış sitometrik analizi + pMHCII tetramer tabanlı bir zenginleştirme ardından saf farelerde T hücreleridir. Örnek parselleri bağlı (A) ve ilişkisiz (B) fraksiyon için gösterilmiştir. Kapıları ardına +, yan-saçılım-widthlo damperli, CD3 + olaylar lenfoid-dağılım seçmek için ayarlanır. Bunlar arasında, CD4 + ya da CD8 + olaylar epitopu özgü T hücreleri veya arka plan boyama analizi için kapı vardır. Bağlı (C) ve ilişkisiz (D) fraksiyondan boyanmamış Hücrelerin alikotlan floresan sayma boncuklar ile karıştırılır ve ayrı ayrı analiz. Edildi büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
oad/4420/4420fig2.jpg "/>
Epitopu özgü CD4 + pMHCII tetramer tabanlı bir zenginleştirme aşağıdaki peptit aşılanmış farelerde T hücrelerinin Şekil 2. Akım sitometrik analizi. Örnek parselleri bağlı (A) ve ilişkisiz (B) fraksiyon için gösterilmiştir. Kapıları ardına +, yan-saçılım-widthlo damperli, CD3 + olaylar lenfoid-dağılım seçmek için ayarlanır. Bunlar arasında, CD4 + ya da CD8 + olaylar epitopu özgü T hücreleri veya arka plan boyama analizi için kapı vardır. Bağlı (C) ve ilişkisiz (D) fraksiyondan boyanmamış Hücrelerin alikotlan floresan sayma boncuklar ile karıştırılır ve ayrı ayrı analiz. Edildi büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Kutu 1. Epitop-spesifik T hücre sayıları hesaplanması
Epitopa spesifik T hücrelerinin mutlak sayılarının en iyi şekilde floresan sayma boncuklar yardımıyla hesaplanır. Boyanmamış bir kısımHer bir numune bir hücre akış sitometrisi ile analiz bilinen bir konsantrasyonda ayarlanmış boncuk sayma ve daha sonra belirli bir hacmi ile karıştırılır. Örnek olarak hücrelerin konsantrasyonu floresan sayma boncuk bilinen konsantrasyon ile bir frekans karşılaştırma sonucuna varılabilir.
Örnek olarak hücrelerin toplam sayısı daha sonra, toplam numune hacmi ile hücre konsantrasyonu çarpılması ile hesaplanır.
Örnek olarak epitopu-spesifik T hücrelerin sayısı sadece tetramer pozitif olan hücrelerin yüzdesi ile çarpılan örnek olarak bütün hücrelerin toplam sayısıdır.
Bu protokol tarafından sunulan pMHC tetramer tabanlı cep zenginleştirme yöntemi endojen T hücre çizgilerinden epitop-spesifik T hücreleri incelemek için güçlü bir araçtır. PMHC tetramerleri kullanımı, doğrudan doğruya aynı kökten gelen pMHC ligandlar bağlamak için kendi TCRS yeteneğine dayalı epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlar. Zenginleştirme antijen-spesifik T hücrelerinin çok nadir topluluğunun, genetik ya da haberci frekans herhangi bir düzenlemesi olmadan T hücrelerinin endojen çizgilerinden tespit edilebilir ki bu tür bir hassasiyet düzeyi sağlar. Sonuç olarak, bu yöntem araştırmacının, doğrudan bağışıklık tepkisinin her aşamasında yoluyla saf düzeylerini in vivo deneysel sistem içinde dan endojen antijen-spesifik T hücre popülasyonu izlemesine olanak verir.
Bu protokol epitop-spesifik CD4 + ikincil lenfoid organ T hücreleri zenginleştirmek pMHC sınıf II (pMHCII) tetramers kullanımı için optimize edilmiştirfarelerin s. Bununla beraber, bu teknik, aynı zamanda pMHC sınıf I (pMHCI) tetramerleri ve CD8 + T hücreleri 9 için de geçerlidir. CD4 aksine, CD8 coreceptor TCR-MHC etkileşimleri stabilize önemli bir rol oynar ve bu pMHCI tetramer boyama için 10 pratik etkileri olabilir. En önemlisi, CD8 antikor kullanımı CD8-tetramer bağlayıcı zarar vermemesi klonları ile sınırlı olması gerektiğini ve tetramer boyama sonrasında hücreler ilave edilmelidir. Gerçekten de, bazı pMHCI tetramers CD8 + T hücrelerinin nonspesifik bağlayıcı 11,12 hafifletmek için mutasyona MHCI-CD8 bağlayıcı sitelerle tasarlanmış edilmiştir.
Tetramer konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve inkübasyon sıcaklığı büyük ölçüde tetramer boyama verimini etkileyebilir ve koşulları yüksek tetramer sinyal, düşük arka sinyal, düşük tetramer içselleştirilmesi ve hücre fizyolojisi minimal değişiklikler en iyi kombinasyonunu elde etmek için optimize edilmelidir. İdeal olarak, bu koşullar b gerekirE ampirik benzersiz her reaktifin belirlenir. Bizim elimizde Bununla birlikte, 10 nM bir nihai konsantrasyon ve oda sıcaklığında 1 saat arasında değişen bir inkübasyon en pMHCI veya pMHCII tetramerleri için iyi bir genel koşullar sağlar. Genel olarak, pMHCI tetramerleri pMHCII tetramerleri göre daha kolay bir şekilde leke görünmektedir ve boyanması genellikle yalnızca 30 dk için 4 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
Bu prosedürün ölçekli tek bir örnek bir fare neredeyse tüm ikincil lenfoid organlara analizi için uygundur. Bu nedenle, her örnek bir fare genelinde dolaşan periferik T hücre repertuarı oldukça kapsamlı bir analizini temsil eder. Epitop-spesifik T hücreleri de dahil olmak üzere, timüs 13,14 ilgili diğer dokular, zenginleştirilmiş olabilir. 4-5 haftalık fareler thymii analiz edildiğinde, tek bir epitopuna spesifik olarak timositlerde pozitif çevresel saf T hücreleri ile benzer numaralar tespit edilebilir. Epitop özel çift pozitif timositleri,Ancak nedeniyle TCR ifade onların düşük seviyelere tespit etmek çok zordur.
Bu protokol, aynı zamanda kan veya diğer dokulara 15-17 + ya da CD8 + T hücreleri epitopu özgü insan CD4 tespit etmek için adapte edilebilir. 100 ml kan toplanmış ve bir fare dalak 18 lenf düğümleri olarak epitopu-spesifik T hücrelerin sayısı karşılaştırılabilir doğuracak - epitopa spesifik T-hücrelerinin frekans kabaca farelerde ve insanlarda 17 arasında aynı olduğu, 50, analiz yani.
Tetramer tabanlı zenginleştirme takiben hücre akım sitometri analizi büyük bir meydan okuma arka plandan ayırt gerçek hücre olaylardır. Bu birçok autofluorescent hücrelerinin sürecinde de non-spesifik olarak zenginleştirilmiş olması büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Dikkatli bir şekilde kapı üzerinden değil ise, bu autofluorescent hücreler yanlış tetramer pozitif hücrelerde ortaya çıkabilir ve özellikle nadir saf T-hücresi p durumunda, analiz doğruluğu kurtulmakopulations. Bizim protokol CD3 + olayları uzak dökümü soyu + olaylar ve ardından CD4 gelen ilk kapı olduğu bir iki adım yolluk strateji benimseyerek + olaylar uzaklıkta CD8 + olaylardan kapı vardır. Bu süreç içinde, herhangi bir FACS arsa çapraz merkez boyunca uzanmak eğilimindedir autofluorescent hücreler, iki aşamada iteratif analiz tetkik vardır. Autofluorescent olayların etkili temizlenmesi birçok floresan renkler maliyetle geliyor, bu yüzden biz son derece en az 6 floresan parametreleri yeteneğine akışı sitometrinin kullanılmasını öneririz.
En pMHC tetramers PE ve APC bu florokromlar ait parlaklık nedeniyle konjuge olan ve anti-PE, anti-APC manyetik mikroboncukları kolayca onlarla zenginleştirme sağlamak için kullanılabilir. Karşılık gelen manyetik mikro-küreler olarak kullanılabilir Bununla birlikte, diğer florokromlar de o kadar uzun süre kullanılabilir. Gerçekten de, farklı florokrom etiketler ile çoklu tetramerleri, karşılık gelen antikor-konjuge mikrofon ile birlikte kullanılabiliraynı anda aynı örnekten birden epitop-spesifik T hücre popülasyonlarının zenginleştirmek robeads. Biz PE-ve APC-etiketli tetramers (Tablo 1) kullanımı için optimize edilmiş bir çok temel antikor-florokrom kurulum ana hatlarıyla, ama birçok diğer etkili kombinasyonları fenotipik belirteçlerin çalışma esnekliği artırmak mümkündür.
Bunlar pMHCII giren ligandlar olan (ve-epitopuna spesifik CD8 + T hücre zenginleştirme için tersi de geçerlidir) bağlamak gerekir beri CD8 + T hücre popülasyonu, dahili bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. PMHCII epitoplara çapraz kısıtlı özgüllük ile iyi niyetli tetramer-pozitif CD8 + T hücreleri çok küçük frekanslarda 19 itibariyle mevcut olsa da bir örnek tetramer + CD8 + hücrelerinin sıklığı, plan tetramer boyanma düzeyi iyi bir değerlendirme sağlar. Bazen çok güçlü bir bağışıklık yanıtları sırasında, bu hücrelerin genişletilmiş frekanslarda bulunabilir. Arzu edildiği takdirde, TCR transjenik T hücreleri yânih ya da uygun epitop özgünlüğü olmadan ek bir pozitif ve negatif kontroller olarak kullanılabilir. Bilinmeyen nedenlerle, bazı TCR transgenik hücreleri ve hibridomlar bunların ilgili tetramers iyi leke unutmayın.
Bizim protokol hücre sayıları hesaplanmasına yardımcı floresan sayma boncuk kullanımı içerir. Hücre sayımı da hemasitometre ile manuel elde edilebilir olsa da, biz çok daha fazla deneysel hassas boncuk sonuçları sayma kullanımı, birden fazla araştırmacı katılıyor özellikle bulabilirsiniz. Bu protokolde işlenir hücrelerin az sayıda ve hacimleri nedeniyle, deneysel hata minimizasyonu yüksek bir öncelik olmalıdır.
Tetramer boyama hücre fiksasyon ve geçirgenliği ile uyumludur ve çeşitli çalışmalar başarıyla tetramer tabanlı cep zenginleştirme 20,21 takiben hücrelerde intrasellüler sitokin ve transkripsiyon faktörü ekspresyonu analiz edilmiştir.Bununla birlikte, söz konusu ilave adımlar örneklerinde ek hücre kaybına katkıda bulunur.
Çıkar çatışması ilan etti.
Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi için yardım Jenkins laboratuar Andre Han ve Lawrence Yen teknik yardım ve üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Reaktif Bayilik Katalog numarası
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PE veya APC konjuge pMHC tetramer (veya multimer) | NIH tetramer çekirdek elde, araştırmacı tarafından yapılmış, ya da ticari kaynaklardan satın | ||
Anti-PE konjuge manyetik mikroboncukları | Miltenyi | 130-048-801 | |
Anti-APC konjuge manyetik mikroboncukları | Miltenyi | 130-090-855 | |
LS manyetik sütunlar | Miltenyi | 130-042-401 | |
MidiMACS veya QuadroMACS mıknatıs | Miltenyi | 130-042-302 veya 130-090-976 | |
Hücre sayımı boncuk | Yaşam Teknolojileri | PCB-100 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır