Method Article
Ce protocole décrit l'utilisation du peptide: CMH tétramères et les microbilles magnétiques pour isoler des populations de basse fréquence de cellules T spécifiques d'épitopes et les analyser par cytométrie en flux. Cette méthode permet l'étude directe des populations de cellules T endogènes d'intérêt de In vivo Systèmes expérimentaux.
Une nécessité fondamentale pour les chercheurs qui étudient l'immunité adaptative avec des modèles expérimentaux in vivo est une capacité à identifier les cellules T en fonction de leur récepteur antigène des cellules T (TCR) spécificité. Nombreuses méthodes indirectes qui sont disponibles dans une population de cellules T en vrac est stimulé in vitro avec un antigène spécifique et spécifiques d'épitope des cellules T sont identifiés au moyen de la mesure d'une réponse fonctionnelle telles que la prolifération, la production de cytokine, ou l'expression de marqueurs d'activation 1. Cependant, ces méthodes seulement d'identifier l'épitope des cellules T spécifiques présentant l'une des nombreuses fonctions possibles, et ils ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter épitope des cellules T spécifiques à des fréquences précurseurs naïfs. Une alternative populaire est le modèle TCR transgénique transfert adoptif, dans lequel les cellules T monoclonaux à partir d'une souris TCR transgénique sont ensemencées dans des hôtes histocompatibles pour créer une population de précurseurs grand nombre de cellules T spécifiques d'épitopes qui peuvent être easily suivi de l'utilisation d'un anticorps marqueur congénique 2,3. Bien que puissante, cette méthode souffre d'artefacts expérimentaux liés à la fréquence non physiologique des cellules T avec une spécificité pour un seul épitope 4,5. En outre, ce système ne peut pas être utilisée pour étudier l'hétérogénéité fonctionnelle des épitopes spécifiques des clones de lymphocytes T au sein d'une population polyclonale.
Le moyen idéal pour étudier l'immunité adaptative devrait impliquer la détection directe de l'épitope des cellules T spécifiques du répertoire des cellules T endogènes en utilisant une méthode qui distingue la spécificité du TCR uniquement par sa liaison au peptide apparenté: CMH (pMHC) complexes. L'utilisation de tétramères pMHC et cytométrie de flux accomplit cette 6, mais il est limité à la détection de populations de haute fréquence de cellules T spécifiques d'épitope ne se trouvent induite par un antigène suivant l'expansion clonale. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode qui coordonne l'utilisation de tétramères pMHC et magnetic technologie d'enrichissement de cellules pour permettre la détection de cellules de fréquence extrêmement basse T spécifiques d'épitope à partir de tissus lymphoïdes de souris 3,7. Avec cette technique, on peut suivre en détail entières populations spécifiques d'épitopes de cellules T endogènes chez la souris à toutes les étapes de la réponse immunitaire.
1. Isolement cellulaire à partir des tissus lymphoïdes
2. La coloration tétramère
3. L'enrichissement magnétique
4. Cytométrie en flux
5. Analyse des données
La figure 1 illustre représentant parcelles de cytométrie en flux de pMHCII tétramère enrichi la rate et les échantillons de ganglions lymphatiques de souris naïves, tandis que la figure 2 montre des données représentatives pour souris préalablement immunisées avec le peptide pertinent + CFA. Déclenchement de série supprime autofluorescentes et d'autres événements indésirables de l'analyse des CD4 + populations de lymphocytes T. Le CD8 + population de cellules T sert de témoin négatif interne utile pour pMHCII tétramère coloration des cellules T CD4 +. Notez que fractions liées à l'enrichissement contiennent généralement une proportion significativement plus élevée de cellules autofluorescentes que les fractions non liées, ce qui rend plus difficile de déclenchement.
Nombre absolu de lymphocytes T spécifiques d'épitope dans un échantillon sont calculés en multipliant le nombre total de toutes les cellules dans la fraction liée de l'échantillon enrichi, tel que déterminé à partir de l'analyse de comptage de talon, avec la proportion de ces cellules qui sont + tétramère, comme déterminationnie de l'analyse coloration des cellules (encadré 1).
Pour la souris naïve dans la figure 1, la concentration de toutes les cellules dans la fraction liée de l'échantillon est (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / ml. Le nombre total de toutes les cellules dans l'échantillon est (6,31 x 10 6 / ml) (0,095) = 6,00 x 10 5. Enfin, le nombre total d'épitopes spécifiques lymphocytes T CD4 + est (6,00 x 10 5) (41,5%) (96,6%) (10,2%) (62,3%) (0,64%) = 98.
Pour la souris immunisée à la figure 2, la concentration de toutes les cellules dans la fraction liée de l'échantillon est (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / ml. Le nombre total de toutes les cellules dans l'échantillon est (1,43 x 10 7 / ml) (0,095) = 1,36 x 10 6. Enfin, le nombre total d'épitopes spécifiques lymphocytes T CD4 + est (1,36 x 10 6) (40,9%) (93,9%) (9,54%) (72,0%) (42,7%) = 1,53 x 10 4 </ Strong>.
L'efficacité des baisses d'enrichissement que le nombre de cellules T spécifiques d'épitopes augmente 8, de sorte tétramère cellules + peut être vu dans la fraction libre d'échantillons contenant de très hautes fréquences de lymphocytes T spécifiques d'épitopes. Dans de tels cas, le nombre de cellules T spécifiques d'épitopes présents dans la fraction libre peut être calculée séparément et ajoutée à la valeur trouvée dans la fraction liée. Par conséquent, dans la figure 2, la concentration de toutes les cellules de la fraction libre de l'échantillon est (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / ml, le nombre total de toutes les cellules est (7,46 x 10 7 / ml) (2,0) = 1,49 x 10 8, et le nombre total des épitopes spécifiques cellules T CD4 + est (1,49 x 10 8) (62,7%) (96,4%) (44,5%) (54,7%) (0,0409 %) = 8,97 x 10 3. Additionnant les nombres dans les fractions liées et non liées, il ya 1,53 x 10 4 + 8,97 x 10 3 = 2,43 x10 4 Total épitope CD4 + spécifiques des cellules T dans l'échantillon entier. En effet, si l'expansion des cellules épitope spécifique est suffisamment robuste, le processus d'enrichissement peuvent être ignorés.
Fluorochrome | Anticorps |
Pacific Blue | dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80) |
Pacifique orange | CD8 |
FITC | CD3 |
PE | pMHC tétramère ou marqueur phénotypique |
PerCP | CD4 |
APC | pMHC tétramère ou marqueur phénotypique |
AlexaFluor 700 | CD44 |
Tableau 1. Suggéré stratégie coloration des anticorps
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Figure 1. L'analyse par cytométrie de flux spécifiques d'épitopes T CD4 + chez des souris naïves suivants pMHCII tétramère basée sur l'enrichissement. Parcelles représentatives sont présentées pour la borne (A) et non liée (B) des fractions. Une succession de portes sont fixées pour sélectionner lymphoïde-diffusion +, side-scatter-widthlo, bennes basculantes, CD3 + événements. Parmi ceux-ci, CD4 + ou CD8 + événements sont déclenchés pour l'analyse des cellules T spécifiques d'épitope ou une coloration de fond. Des aliquotes de cellules non colorées de la borne (C) et non liée (D) fraction fluorescentes ont été mélangés avec billes de comptage et analysés séparément. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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L'analyse des flux Figure 2. Cytométrie de spécifiques d'épitopes T CD4 + en peptide-souris immunisées après pMHCII tétramère basée sur l'enrichissement. Parcelles représentatives sont présentées pour la borne (A) et non liée (B) des fractions. Une succession de portes sont fixées pour sélectionner lymphoïde-diffusion +, side-scatter-widthlo, bennes basculantes, CD3 + événements. Parmi ceux-ci, CD4 + ou CD8 + événements sont déclenchés pour l'analyse des cellules T spécifiques d'épitope ou une coloration de fond. Des aliquotes de cellules non colorées de la borne (C) et non liée (D) fraction fluorescentes ont été mélangés avec billes de comptage et analysés séparément. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Encadré 1. Calcul des épitopes spécifiques nombre de lymphocytes T
Nombre absolu de lymphocytes T spécifiques d'épitope sont les plus propres à l'aide de billes fluorescentes de comptage. Une aliquote de tachecellules de chaque échantillon est mélangé à un volume défini de billes de comptage fixées à une concentration connue et ensuite analysées par cytométrie de flux. La concentration de cellules dans l'échantillon peut être déduite à partir d'une comparaison de la fréquence de la concentration connue de fluorescence des billes de comptage.
Le nombre total de cellules dans l'échantillon est ensuite calculée en multipliant la concentration de cellules avec le volume total de l'échantillon.
Le nombre total d'épitope des cellules T spécifiques de l'échantillon est simplement le nombre total de toutes les cellules dans l'échantillon multiplié par le pourcentage de cellules qui sont tétramère positif.
Le pMHC tétramère méthode basée sur l'enrichissement de cellules présenté par ce protocole est un outil puissant pour étudier épitope des cellules T spécifiques de cellules T endogènes répertoires. L'utilisation de tétramères pMHC permet la détection de cellules T spécifiques d'épitope basé directement sur la capacité de se lier à leurs TCR ligands apparentés pMHC. L'enrichissement fournit un niveau de sensibilité de telle sorte que les populations extrêmement rares de cellules T spécifiques de l'antigène peut être détecté à partir de répertoires endogènes de cellules T sans aucune manipulation de leur matériel génétique ou de la fréquence des précurseurs. En conséquence, cette technique permet au chercheur de suivre directement endogènes spécifiques de l'antigène populations de cellules T à partir de systèmes expérimentaux in vivo de leurs niveaux naïfs à travers toutes les étapes de la réponse immunitaire.
Ce protocole a été optimisé pour l'utilisation de pMHC classe II (pMHCII) tétramères d'enrichir spécifiques d'épitopes T CD4 + de l'organe lymphoïde secondaires de souris. Cependant, la technique est également applicable à pMHC classe I (pMHCI) tétramères et lymphocytes T CD8 + 9. Contrairement CD4, le corécepteur CD8 joue un rôle important dans la stabilisation de TCR-CMH interactions, et cela peut avoir des implications pratiques pour pMHCI tétramère coloration 10. Plus particulièrement, l'utilisation de CD8 devrait être limitée à des clones qui ne compromettent pas CD8 tétramère contraignant, et ils devraient être ajoutés à des cellules après coloration tétramère. En effet, certains tétramères pMHCI ont été conçus avec mutés CMHI-CD8 sites de liaison pour atténuer liaison non spécifique aux cellules T CD8 + 11,12.
Concentration tétramère, le temps d'incubation et la température d'incubation peut grandement influer sur l'efficacité de la coloration tétramère, et les conditions doivent être optimisées pour obtenir la meilleure combinaison de tétramère de signal élevé, faible signal de fond, l'internalisation tétramère bas, et des changements minimes de la physiologie cellulaire. Idéalement, ces conditions devraient be déterminée empiriquement pour chaque réactif unique. Dans nos mains, cependant, une concentration finale de 10 nM et une incubation de 1 h à température ambiante offre de bonnes conditions génériques pour la plupart des tétramères pMHCI ou pMHCII. En général, les tétramères pMHCI semblent tache plus facilement que les tétramères pMHCII, et la coloration peuvent souvent être réalisées à 4 ° C pour aussi peu que 30 minutes.
L'ampleur de cette procédure est adaptée pour l'analyse de presque tous les organes lymphoïdes secondaires d'une souris à un seul échantillon. Par conséquent, chaque échantillon représente une analyse assez complète de l'ensemble du répertoire de circulation cellule T périphérique d'une souris. Spécifiques d'épitopes des cellules T peut également être enrichie d'autres tissus pertinentes, y compris l'13,14 thymus. Lorsque thymii 4-5 semaines d'âge souris sont analysés, spécifiques d'épitopes simples thymocytes positifs peuvent être détectés à des chiffres similaires à ceux de la périphérie des cellules T naïves. Spécifiques d'épitopes thymocytes double-positifs,cependant, sont très difficiles à détecter en raison de leurs faibles niveaux d'expression du TCR.
Ce protocole peut également être adapté pour détecter spécifiques d'épitopes CD4 + humains ou cellules T CD8 + dans le sang ou d'autres tissus 15-17. La fréquence des cellules T spécifiques d'épitopes est sensiblement la même entre les souris et les humains 17, si l'analyse de 50 à 100 ml de sang donnerait un nombre comparable de l'épitope des cellules T spécifiques comme la rate et les ganglions lymphatiques commun d'une souris 18.
Un défi majeur dans l'analyse par cytométrie en flux des cellules suivantes tétramère basée sur l'enrichissement est distinctives des événements cellulaires véritables de fond. Ceci est largement dû au fait que de nombreuses cellules autofluorescentes sont également non spécifique enrichie au cours du processus. Si ce n'est pas soigneusement fermée, ces cellules autofluorescentes peut apparaître comme faux tétramère cellules positives et se débarrasser de l'exactitude de l'analyse, en particulier dans le cas des lymphocytes T naïfs rare populations. Notre protocole utilise une stratégie de déclenchement en deux étapes dans lequel les événements CD3 + sont d'abord fermée loin de la lignée de vidage + événements, puis CD4 + événements sont déclenchés loin de CD8 + événements. Dans le processus, les cellules autofluorescentes, qui ont tendance à longer le centre diagonale de toute parcelle FACS, sont hors gated de l'analyse en deux étapes itératives. L'élimination effective des événements autofluorescentes se fait au prix de beaucoup de couleurs fluorescentes, nous recommandons fortement l'utilisation du cytomètre de flux capables d'au moins 6 paramètres fluorescentes.
Tétramères plus pMHC sont conjugués à PE et APC en raison de la luminosité de ces fluorochromes, et anti-PE et anti-APC microbilles magnétiques sont facilement accessibles pour permettre un enrichissement avec eux. Toutefois, d'autres fluorochromes peut également être utilisé pour autant que des microbilles magnétiques correspondants sont disponibles. En effet, tétramères multiples avec différents fluorochromes étiquettes peuvent être utilisées conjointement avec l'anticorps conjugué correspondant microrobeads à enrichir simultanément plusieurs épitopes spécifiques populations de lymphocytes T provenant du même échantillon. Nous avons présenté un très basique anticorps-fluorochrome configuration qui est optimisé pour l'utilisation de PE-APC et marqués par des tétramères (tableau 1), mais de nombreuses autres combinaisons efficaces sont possibles pour augmenter la flexibilité dans l'étude de marqueurs phénotypiques.
CD8 + populations de cellules T peut être utilisé en tant que contrôle interne négatif, puisqu'ils ne doivent pas se lier à des ligands pMHCII (et vice-versa pour l'épitope CD8 + spécifiques d'enrichissement de cellules T). La fréquence des tétramères + CD8 + dans un échantillon fournit une bonne évaluation du niveau de coloration tétramère de fond, bien que de bonne foi tétramère positifs lymphocytes T CD8 + avec croix-restricted spécificité aux épitopes pMHCII peut exister à des fréquences très faibles 19. De temps en temps lors de très fortes réponses immunitaires, ces cellules peuvent exister à des fréquences accrues. Si vous le souhaitez, TCR transgénique cellules T with ou sans spécificité épitopique en cause peut être utilisé en tant que d'autres contrôles positifs et négatifs. Notez que pour des raisons inconnues, certaines cellules TCR transgéniques et des hybridomes ne tachent pas bien avec leurs tétramères pertinents.
Notre protocole implique l'utilisation de billes de comptage fluorescents pour aider dans le calcul du nombre de cellules. Alors que nombre de cellules peut également être réalisé manuellement à l'aide d'un hématimètre, nous constatons que l'utilisation des résultats de comptage perles en précision expérimentale beaucoup plus grande, en particulier lorsque plusieurs chercheurs sont impliqués. En raison de leur faible nombre et le volume des cellules qui sont traitées dans ce protocole, la minimisation de l'erreur expérimentale devrait être une priorité élevée.
Coloration tétramère est compatible avec la fixation et perméabilisation cellulaire, et plusieurs études ont analysé avec succès cytokine intracellulaire et l'expression du facteur de transcription dans les cellules après un enrichissement de cellules tétramère basée 20,21.Toutefois, les étapes supplémentaires que cela implique contribuer aux pertes de cellules supplémentaires dans les échantillons.
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Les auteurs tiennent à remercier André Han Yen-Laurent et de l'assistance technique, et les membres du laboratoire Jenkins de l'aide à l'élaboration de ce protocole.
Réactif Fournisseur
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PE ou APC conjugué pMHC tétramère (ou multimère) | Fabriqué par l'enquêteur, obtenu à partir du noyau NIH tétramère ou achetés auprès de sources commerciales | ||
Anti-PE conjugués des microbilles magnétiques | Miltenyi | 130-048-801 | |
Anti-APC conjugués des microbilles magnétiques | Miltenyi | 130-090-855 | |
Colonnes LS magnétiques | Miltenyi | 130-042-401 | |
MidiMACS ou QuadroMACS aimant | Miltenyi | 130-042-302 130-090-976 ou | |
Perles de comptage de cellules | Life Technologies | PCB-100 |
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