Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés de In vivo Los sistemas experimentales.

Una necesidad básica para los investigadores que estudian la inmunidad adaptativa con modelos experimentales in vivo es la capacidad de identificar las células T en función de su receptor de antígeno de células T (TCR) especificidad. Muchos métodos indirectos están disponibles en el que una población mayor de células T se estimularon in vitro con un antígeno específico y el epítopo de células T específicas se identifican a través de la medición de una respuesta funcional, tal como la proliferación, producción de citoquinas, o la expresión de marcadores de activación ^1. Sin embargo, estos métodos sólo identificar epítopos de células T específicas que presentan una de las muchas posibles funciones, y que no son lo suficientemente sensibles como para detectar epítopos de células T específicas en las frecuencias precursoras ingenuas. Una alternativa popular es el modelo de transferencia adoptiva TCR transgénico, en la que las células T monoclonales de un ratón TCR transgénico se siembran en hosts histocompatibles para crear una población grande precursor de células T específicos para el epítopo que pueden ser easiLy seguido con el uso de un anticuerpo marcador congenic ^2,3. Mientras potente, este método adolece de artefactos experimentales asociados con la frecuencia no fisiológica de las células T con especificidad para un epítope ^4,5 sola. Además, este sistema no se puede utilizar para investigar la heterogeneidad funcional del epítopo específicos de clones de células T dentro de una población policlonal.

La forma ideal para estudiar la inmunidad adaptativa debe implicar la detección directa de epítopo de células T específicas del repertorio de células T endógeno utilizando un método que distingue la especificidad TCR únicamente por su unión a péptido cognado: complejos de MHC (pMHC). El uso de tetrámeros y citometría de flujo pMHC logra esto ^6, pero se limita a la detección de poblaciones de alta frecuencia de células T específicos para el epítopo que sólo se encuentran siguiente inducida por antígeno expansión clonal. En este protocolo, se describe un método que coordina el uso de tetrámeros pMHC y magnetic tecnología de enriquecimiento de células para permitir la detección de células de frecuencia extremadamente baja T específicos para el epítopo de los tejidos linfoides de ratón ^3,7. Con esta técnica, se puede realizar un seguimiento integral enteros específicos de epítopo poblaciones endógenas de las células T en ratones en todas las etapas de la respuesta inmune.

1. Aislamiento de células del tejido linfoide

1. Añadir 1 ml de hielo frío cEHAA (EHAA + 10% de FBS, penicilina / estreptomicina, gentamicina, 2 mM de L-glutamina, 55 mM de 2-mercaptoetanol) u otro medio equivalente de las células T, a una placa de cultivo de 60 mm que contiene un pequeño cuadrado de 100 micras de malla de nylon y colocar en hielo.
2. Eutanasiar ratón.
3. Retire el bazo y como muchos nodos linfáticos fácilmente accesibles como sea posible. Estos deben incluir al menos las inguinales, axilares, ganglios linfáticos cervicales, braquial, y mesentérica. Colocarlos en la parte superior de la malla de nylon en la placa de cultivo.
4. Usando la parte superior plana cerrada de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, suavemente mezcla el tejido linfoide sobre la malla de nylon para liberar a los linfocitos. Añadir otra ml de 1 cEHAA y pipetear hacia arriba y hacia abajo para trabajar las células en una suspensión. Transferir las células a través de otra pieza de malla de nylon coloca sobre la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. Enjuagar la cápsula y de malla con otro 1 ml de hielo frío cEHAA, poOling los volúmenes en el mismo tubo. Repetir para conseguir un volumen de suspensión celular final de 4 ml.
5. Añadir tampón clasificador de frío (PBS + 2% de FBS, 0,05% de azida) hasta un volumen final de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
6. Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en Fc bloque (clasificador de tampón + 2.4G2 anticuerpo) a un volumen final igual a aproximadamente el doble de la del propio gránulo. Por ejemplo, el bazo y nódulos linfáticos de un ratón naive por lo general produce un sedimento celular de aproximadamente 100 l. En este caso, añadir 100 ml de bloque Fc para llevar el volumen a 200 l. Si un alto grado de aglutinación de células se ha producido, retirar cuidadosamente el agregado celular en este punto con una punta de pipeta.

2. Tetramer tinción

1. Añadir PE-o APC marcada con pMHC tetrámero a una concentración final de 10 nM (o concentración empíricamente optimizado).
2. Mix and incubaciónTE durante 1 hora a temperatura ambiente (o tiempo empíricamente optimizado y temperatura).
3. Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. Mantener las muestras en hielo oa 4 ° C a partir de ahora.
4. Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 200 l. Para el enriquecimiento tetrámero doble, resuspender hasta un volumen final de 150 l.

3. Enriquecimiento magnética

1. Añadir 50 l de microperlas Miltenyi anti-PE o anti-APC. Para el enriquecimiento tetrámero doble, se añaden 50 l de ambos.
2. Mezclar e incubar durante 20 min a 4 ° C.
3. Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
4. Mientras se espera, configure una columna Miltenyi LS magnético en un imán midiMACS o QuadroMACS. Posicionar un abierto 15 ml de polipropileno en un tubo de centrífugaacumular directamente debajo de la columna.
5. Añadir 3 ml de tampón clasificador a la parte superior de la columna, lo que permite que se drene en el tubo de 15 ml.
6. Colocar un nylon 100 micras de malla cuadrada en la parte superior de la columna.
7. Cuando las células han terminado de hilado, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de tampón clasificador.
8. Transferir la suspensión celular a través de la malla de nylon en la parte superior de la columna.
9. Cuando la suspensión de células se haya vaciado completamente en la columna, enjuagar el tubo original con otro ml de tampón 3 clasificador y transferir el tampón a través de la malla de nylon en la columna, lavar la malla en el proceso. Deseche la malla de nylon.
10. Cuando la memoria intermedia se haya vaciado completamente en la columna, añadir otro 3 ml de tampón clasificador a la columna.
11. Repetir el paso 10 para un total de 3 x 3 lavados ml.
12. Retirar la columna del imán y colocada en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno.
13. Añadir 5 ml de tampón clasificador para tél columna.
14. Inmediatamente inserte el émbolo en la parte superior de la columna y en un movimiento continuo, empuje el émbolo hacia abajo, forzando el tampón de la columna en el tubo.
15. Centrifugar los tubos que contenían la fracción eluida unida y la fracción no unida de flujo a través durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
16. Aspirar con cuidado el sobrenadante de la fracción unida, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 95 l exactamente. Aspirar y volver a suspender la fracción no unida a un volumen final de 2 ml.

4. Citometría de Flujo

1. Para cada fracción, quitar 5 l y añadir a 200 l de perlas de conteo (ajustado a una concentración de 200.000 / ml en tampón clasificador) en un tubo de 5 ml FACS. De lado a 4 ° C para su posterior análisis. Para ahorrar tiempo, los granos pueden ser pre-alícuotas a tubos etiquetados antes del comienzo del experimento.
2. Preparar amaster mezcla de anticuerpos para teñir los marcadores de superficie en las células (Tabla 1). Para ahorrar tiempo, esto se puede hacer antes del comienzo del experimento.
3. Para la fracción unida, añadir una dosis de cóctel de anticuerpos directamente al ~ 90 l de células en el tubo. Si el análisis de la fracción no unida se desea, transferir 90 l de células a un tubo de 5 ml FACS y añadir una dosis de cóctel de anticuerpos.
4. Crear un panel de controles de compensación de un solo color para el citómetro de flujo. Para cada fluorocromo a utilizar, mezclar 50 l de células sobrantes fracción no unida en un tubo de 5 ml FACS con 1 l de anticuerpo anti-CD4 conjugado con el fluorocromo correspondiente. Recuerde que debe establecer un control sin mancha también.
5. Agitar e incubar las muestras durante 30 min a 4 ° C.
6. Añadir 5 ml de tampón clasificador a cada tubo y centrifugar durante 5 min a 300 xg, 4 ° C.
7. Para la fracción unida, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de buf clasificadorfer. Transferir las células a un microtubo de 1,2 ml FACS. Enjuague el tubo con otro 200 l de tampón clasificador y la piscina en el mismo microtubo. Si los agregados celulares son evidentes, pasar las células a través de un filtro de 50 micras.
8. Para la fracción no unida y controles de compensación, decantar o aspirar el sobrenadante y se resuspende en 2 ml de tampón clasificador.
9. Configurar el citómetro de flujo utilizando los controles de compensación de un solo color. Seleccione el lado de dispersión de ancho (SSC-W) como un parámetro adicional que desee grabar.
10. Analizar las muestras teñidas utilizando una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar CD4 + o CD8 + células T como se ilustra en las Figuras 1 y 2. Para las fracciones consolidados, recoger las células tanto como sea posible hasta un máximo de 2.000.000 de eventos totales. Para las fracciones no unidas, recoger 1.000.000 eventos totales. Mantener la velocidad de adquisición en o debajo de 3.000 eventos por segundo.
11. Uso de los ajustes de la máquina misma, analizar las muestras de conteo de cuentas. Recoge un total de 10.000 eventos.
12. Guarde todos los datos como archivos de FCS.

5. Análisis de Datos

1. Analizar FCS archivos de datos para las muestras de recuento de talón utilizando software FlowJo. Parcela dispersión frontal por FITC y configurar una puerta aroung las perlas de recuento (véanse las Figuras 1 y 2). Determinar el número total de recuento de granos detectados en cada muestra. Restar de la cantidad total de eventos recogidos para determinar el número de eventos celulares recogidas.
2. Calcule el número total de todas las células en cada muestra utilizando las ecuaciones descritas en el Cuadro 1.
3. Analizar FCS archivos de datos de las muestras teñidas fracción unida y no unida. Configurar una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar + linfoide, ^lo lado de ancho de dispersión, vertimiento, CD3 +, CD4 + o CD8 +, tetrámero + células T en cada muestra como se ilustra en las Figuras 1 y 2.
4. Multiplicar el número total de células en la muestra por las frecuencias de cada una de las puertas de inclusión utilizados para definir CD4 + tetrámero+ O CD8 + tetrámero + células para calcular el número total de epítopos de células T específicas (Cuadro 1).

La Figura 1 muestra representativas parcelas de citometría de flujo de pMHCII tetrámero bazo enriquecidos y muestras de ganglios linfáticos de ratones sin tratamiento previo, mientras que la Figura 2 muestra los datos representativos de ratones previamente inmunizados con el péptido relevante + CFA. Gating serie elimina eventos no deseados autofluorescentes y otro a partir del análisis de las células CD4 + T poblaciones celulares. El CD8 + población de células T sirve como un control negativo interno útil para pMHCII tinción de tetrámero de células T CD4 +. Tenga en cuenta que las fracciones unidas de enriquecimiento por lo general contienen una proporción significativamente mayor de células autofluorescentes que las fracciones no unidas, haciendo más difícil gating.

Los números absolutos de células T específicos para el epítopo en una muestra se calcula multiplicando el número total de todas las células en la fracción unida de la muestra enriquecida, tal como se determina a partir del análisis recuento de bolas, con la proporción de estas células que son + tetrámero, como determinaciónnida a partir del análisis de tinción celular (Cuadro 1).

Para el ratón ingenua en la Figura 1, la concentración de todas las células en la fracción unida de la muestra es (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 ⁶ / ml. El número total de todas las células en la muestra es (6,31 x 10 ⁶ / ml) (0,095) = 6,00 x 10 ^5. Por último, el número total de epítopos CD4 + específicas de las células T es (6,00 x 10 ⁵⁾ (41,5%) (96,6%) (10,2%) (62,3%) (0,64%) = 98.

Para el ratón inmunizado en la Figura 2, la concentración de todas las células en la fracción unida de la muestra es (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 ⁷ / ml. El número total de todas las células en la muestra es (1,43 x 10 ⁷ / ml) (0,095) = 1,36 x 10 ^6. Por último, el número total de epítopos CD4 + específicas de las células T es (1,36 x 10 ⁶⁾ (40,9%) (93,9%) (9,54%) (72.0%) (42.7%) = 1,53 x 10 ⁴ </ Strong>.

La eficacia de la disminución de enriquecimiento como el número de epítopos de células T específicas aumenta ^8, por lo que las células de tetrámero + se puede ver en la fracción no unida de las muestras que contienen frecuencias muy altas de células T específicos para el epítopo. En tales casos, el número de epítopos específicos de las células T presentes en la fracción no unida puede calcularse por separado y se añade a la cantidad encontrada en la fracción unida. Por lo tanto, en la Figura 2, la concentración de todas las células en la fracción no unida de la muestra es (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 ⁷ / ml, el número total de todas las células es (7,46 x 10 ⁷ / ml) (2,0) = 1,49 x 10 ^8, y el número total de epítopos CD4 + específicas de las células T es (1,49 x 10 ⁸⁾ (62,7%) (96,4%) (44,5%) (54,7%) (0,0409 %) = 8,97 x 10 ^3. Adición de los números de las fracciones unida y no unida, hay 1,53 x 10 ⁴ + 8,97 x 10 x ³ = 2,4310 ⁴ Total de epítopos CD4 + específicas de las células T en la muestra completa. En efecto, si epítopo específico de la expansión de células es suficientemente sólido, el proceso de enriquecimiento se puede omitir.

Tabla 1. Sugerido estrategia anticuerpo tinción

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Figura 1. Análisis de citometría de flujo de epítopo CD4 + específicas de las células T en ratones sin tratamiento previo siguientes pMHCII tetrámero basado en el enriquecimiento. Parcelas representativos se muestran en la cota (A) no unido y (b) las fracciones. Una sucesión de puertas se establecen para seleccionar linfoides dispersión +, dispersión lateral widthlo volquetes, CD3 + eventos. De estos, CD4 + o CD8 + eventos son gated para el análisis de células T específicos para el epítopo o la tinción de fondo. Las alícuotas de las células teñidas de la cota (C) y sin unir (D) fracción se mezclaron con perlas fluorescentes contar y analizar por separado. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Figura 2. Análisis citométrico de flujo de epítopo CD4 + específicas de las células T en ratones inmunizados con péptido siguientes pMHCII tetrámero basado en el enriquecimiento. Parcelas representativos se muestran en la cota (A) no unido y (b) las fracciones. Una sucesión de puertas se establecen para seleccionar linfoides dispersión +, dispersión lateral widthlo volquetes, CD3 + eventos. De estos, CD4 + o CD8 + eventos son gated para el análisis de células T específicos para el epítopo o la tinción de fondo. Las alícuotas de las células teñidas de la cota (C) y sin unir (D) fracción se mezclaron con perlas fluorescentes contar y analizar por separado. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Cuadro 1. Cálculo de específicos de epítopo número de células T

Los números absolutos de epítopo de células T específicas se calculan mejor con la ayuda de perlas fluorescentes de conteo. Una alícuota de teñircélulas de cada muestra se mezcla con un volumen definido de rosarios fijados a una concentración conocida y luego analizadas por citometría de flujo. La concentración de células en la muestra se puede deducir de una comparación de la frecuencia con la concentración conocida de perlas fluorescentes de conteo.

El número total de células en la muestra se calcula entonces multiplicando la concentración celular con el volumen total de la muestra.

El número total de epítopos de células T específicas de la muestra es simplemente el número total de todas las células en la muestra multiplicado por el porcentaje de células que son tetrámero positivo.

El pMHC tetrámero basado en el método de enriquecimiento de células presentada por este protocolo es una poderosa herramienta para el estudio de epítopo de células T específicas de repertorios de células T endógenas. El uso de tetrámeros de pMHC permite la detección de células T específicos para el epítopo basado directamente en la capacidad de sus TCR para unir ligandos cognados pMHC. El enriquecimiento proporciona un nivel de sensibilidad de tal manera que las poblaciones extremadamente raros de antígenos específicos de células T se puede detectar a partir de repertorios endógenos de las células T sin ninguna manipulación de su composición genética o frecuencia del precursor. Como resultado de ello, esta técnica permite al investigador para rastrear directamente endógenas específicas de antígeno a partir de poblaciones de células T in vivo en sistemas experimentales de sus niveles ingenuos a través de todas las etapas de la respuesta inmune.

Este protocolo se ha optimizado para el uso de pMHC de clase II (pMHCII) tetrámeros para enriquecer epítopo CD4 + específicas de células T de los órganos linfoides secundarioss de ratones. Sin embargo, la técnica es también aplicable a pMHC Clase I (pMHCI) tetrámeros y CD8 + células T ^9. A diferencia de CD4, el co-receptor CD8 juega un papel importante en la estabilización de las interacciones TCR-MHC, y esto puede tener implicaciones prácticas para pMHCI tinción de tetrámero ^10. En particular, el uso de anticuerpos CD8 debe limitarse a los clones que no perjudiquen CD8-tetrámero de unión, y que debe ser añadido a las células después de la tinción de tetrámero. De hecho, algunos tetrámeros pMHCI han sido diseñados con mutadas MHCI-CD8 sitios de unión para mitigar la unión no específica de células T CD8 + ^11,12.

Concentración de tetrámero, tiempo de incubación y temperatura de incubación puede afectar enormemente a la eficiencia de la tinción de tetrámero, y las condiciones deben ser optimizados para lograr la mejor combinación de la señal de alta tetrámero, señal de fondo baja, internalización tetrámero bajo, y mínimos cambios en la fisiología celular. Lo ideal sería que estas condiciones debe be determinado empíricamente para cada reactivo único. En nuestras manos, sin embargo, una concentración final de 10 nM y una incubación de 1 hora a temperatura ambiente proporciona buenas condiciones genéricas para la mayoría de los tetrámeros pMHCI o pMHCII. En general, tetrámeros pMHCI parecen mancha más fácilmente que los tetrámeros pMHCII, y la tinción con frecuencia se puede realizar a 4 ° C para tan poco como 30 min.

La escala de este procedimiento es adecuado para el análisis de casi todos los órganos linfoides secundarios de un ratón en una sola muestra. Por lo tanto, cada muestra representa un análisis bastante completo de toda la circulación periférica repertorio de células T de ratón. Epítopo de células T específicas también puede enriquecerse a partir de otros tejidos relevantes, incluyendo el timo ^13,14. Cuando timos 4 a 5 semanas de edad ratones se analizan, específicos para el epítopo timocitos positivos individuales se puede detectar en números similares a los de la periférica de células T vírgenes. Específicos para el epítopo doble positivas timocitos,sin embargo, son muy difíciles de detectar debido a sus bajos niveles de expresión de TCR.

Este protocolo también puede ser adaptado para detectar específicos de epítopo CD4 + humanas o células T CD8 + en la sangre u otros tejidos ^15-17. La frecuencia de epítopo específico de células T es aproximadamente la misma entre ratones y seres humanos ^17, por lo que el análisis de 50 - 100 ml de sangre se dan números comparables de epítopo de células T específicas como el bazo y los ganglios linfáticos agrupados de un ratón ^18.

Un reto importante en el análisis de citometría de flujo de células después de tetrámero basado en el enriquecimiento es distinguir los verdaderos de los eventos celulares fondo. Esto se debe principalmente al hecho de que muchas células autofluorescentes son también no específicamente enriquecido durante el proceso. Si no fuera cuidadosamente cerrada, estas células autofluorescentes puede aparecer como falsos positivos tetrámero-células y quitarse la exactitud del análisis, en particular en el caso de las células T naive rara populations. Nuestro protocolo emplea una estrategia de puerta de dos pasos en el que los eventos CD3 + de primera gated lejos de linaje de volcado + eventos y, a continuación CD4 + eventos son gated lejos de CD8 + eventos. En el proceso, las células autofluorescentes, que tienden a encuentran a lo largo del centro de la diagonal de cualquier parcela FACS, están fuera cerrada del análisis en dos etapas iterativas. La supresión efectiva de los hechos autofluorescentes se produce a costa de muchos colores fluorescentes, por lo que es muy recomendable el uso de citómetros de flujo capaz de por lo menos 6 parámetros fluorescentes.

Tetrámeros más pMHC son conjugado con PE y APC debido al brillo de estos fluorocromos, y anti-PE y anti-APC microperlas magnéticas están disponibles fácilmente para permitir el enriquecimiento con ellos. Sin embargo, otros fluorocromos también se puede utilizar siempre y cuando correspondientes microperlas magnéticas están disponibles. En efecto, tetrámeros múltiples con diferentes etiquetas fluorocromo se puede utilizar junto con el correspondiente anticuerpo conjugado con micrófonorobeads para enriquecer simultáneamente múltiples epítopos específicos de poblaciones de células T a partir de la misma muestra. Hemos descrito una muy básica anticuerpo-fluorocromo configuración que está optimizado para el uso de PE y APC marcados-tetrámeros (Tabla 1), pero muchas combinaciones eficaces son posibles otras para aumentar la flexibilidad en el estudio de marcadores fenotípicos.

CD8 + poblaciones de células T se puede utilizar como un control negativo interno, ya que no deberían unirse a ligandos pMHCII (y viceversa para el epítopo CD8 + específicas de enriquecimiento de células T). La frecuencia de tetrámero + células CD8 + en una muestra proporciona una buena evaluación del nivel de tinción de fondo tetrámero, aunque de buena fe positivos tetrámero CD8 + células T con especificidad cruzada restringido a epítopos pMHCII pueden existir en frecuencias muy pequeñas ^19. Ocasionalmente, durante las respuestas inmunitarias muy fuertes, estas células pueden existir en las frecuencias expandidas. Si lo desea, TCR transgénico células T ingenioh o sin especificidad de epítopo relevante puede ser utilizado como adicionales controles positivos y negativos. Tenga en cuenta que, por razones desconocidas, algunas células transgénicas TCR y los hibridomas no se tiñen bien con sus correspondientes tetrámeros.

El protocolo implica el uso de perlas fluorescentes de conteo para ayudar en el cálculo del número de células. Aunque los recuentos de células también se puede lograr manualmente con un hemocitómetro, se encuentra que el uso de los resultados de recuento de granos en la precisión experimental mucho mayor, especialmente cuando están implicados varios investigadores. Debido al pequeño número y el volumen de las células que se manejan en este protocolo, la minimización del error experimental debería ser una alta prioridad.

Tinción del tetrámero es compatible con la fijación de células y la permeabilización, y varios estudios han analizado con éxito intracelular de citoquinas y la expresión de factor de transcripción en las células después del enriquecimiento de células tetrámero basado ^20,21.Sin embargo, los pasos adicionales asociados contribuyen a las pérdidas celulares adicionales en las muestras.

No hay conflictos de interés declarado.

Los autores desean dar las gracias a Andre Han y Yen Lawrence para la asistencia técnica, y los miembros del laboratorio de Jenkins en busca de ayuda en el desarrollo de este protocolo.