Kemik Metastaz Modelleri

Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Kemik metastazları, meme, prostat ve akciğer gibi çeşitli maligniteler, ortak bir olay vardır. Bir kez kemik yılında kurulan, tümörler önemli morbidite ve mortalite ¹ sorumludur. Bu nedenle, kemik tümörlerinin oluşturulması, büyüme ve aktivitesini kontrol eden moleküler mekanizmalarının anlaşılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Vivo modellerde birçok bu olayları incelemek üzere kurulan ve her özel yararları ve sınırlamaları vardır edilmiştir. En sık kullanılan modeli doğrudan atimik (çıplak) BalbC farelerin arteriyel kan akımı içine tümör hücrelerinin intrakardiyak inokülasyon kullanır. Bu işlem birçok farklı tümör tipleri (PC-3 prostat kanseri, akciğer kanseri ve fare meme yağ yastığı tümörleri dahil) uygulanabilir, ancak bu makalede biz, MDA-MB-231 meme kanseri modeli üzerinde durulacak. Bu modelde biz başlangıçta San Antonio ² Dr Mundy grubu olarak elde edilen bir çok kemik seçici klon, kullanmak, hberi GFP ifade için transfekte ve bizim grup ³ ile yeniden klonlanmış gibi. Bu klon bir osteotropism oranı yüksek ve akciğer, karaciğer ya da böbrek üstü bezlerinin çok az metastazı olan bir kemik metastatik çeşididir. Intrakardiyak enjeksiyonlar en yaygın olarak, belli durumlarda kemik metastazı ² çalışmaları için kullanılsa da ⁴ intratibial ya da memenin yağlı pedine enjeksiyon daha uygundur. , Kemik tutuklamak hayatta kalmak, çoğalırlar ve kanser-kaynaklı kemik hastalığı haline tümörler kurmak için, özellikle kanser hücrelerinin metastaz yeteneği daha sonraki aşamalarında izleme amacı ile, insan tümör hücrelerinde kullanıldığında kalp içi enjeksiyon tipik olarak gerçekleştirilir. Bir tümör saptandığında metastatik kemik hastalığını kabaca ilişkilidir kemik, metastas sonra kanser hücreleri ve kemik ilişkisi üzerinde duruluyor varsa Intratibial enjeksiyonlar yapılır. Emboli ve giriş için ne bu modellerin recapitulates metastatik süreci erken adım öncekidolaşıma tümör hücrelerini yok etmektedir. Kemik birincil sitesinden primer tümörün büyümesi veya metastaz izlenmesi, sonra memenin yağlı pedine aşılar genellikle tercih olmakla birlikte, çok az sayıda tümör hücre hatları sürekli, 4T1 kemik tercihli klonları ile, birincil sitesinden kemik, meme fare metastaz olur karsinom, istisna ^5,6 olmak.

Bu yazının ayrıntıları aşılama işlemleri ve sonrası aşılama analizlerde golleri önemli adımlar. Özellikle, hücre kültürü, intrakardiyak ve intratibial aşılar için tümör hücre aşılama işlemleri yanı sıra, röntgen, floresans ve histomorfometrik analizleri ile haftalık izleme ile ilgili özet bilgiler içerir.

1. Hücre Bakım

1. MDA-MB-231 çoğu kemik metastazı yola çıkılarak alt klonlar kemik kolonizasyon ve büyüme için değişken eğilime sahip oldukları mevcut. Bizim deneyler için biz UTHSCA ² geliştirilen GFP etiketli MDA-MB-231 türetilmiş bir klonu kullanın. Bu belirli bir alt-klon 4 hafta özveri ile, yaklaşık 3 hafta sonrası aşılama görülebilir osteolitik kemik lezyonları oluşturacaktır.
2. DMEM,% 5-8, ₂ ⁷ CO içinde 37 ° C 'de% 10 FBS, 0.1 mg / ml penisilin-streptomisin içeren hücreler koruyun.
3. 1:10 dilüsyon% 80-90 izdiham ve re-plaka Passage hücreler (bu hücre tipi ve boyut plaka bağlı olarak değişir. T-75 MDA-MB-231 hücre için bu yaklaşık 6x10 ^5'tir), hangi Yaklaşık her 72 saat.
4. MDA-MB-231 hücrelerinde çok sayıda pseudopodia ile genel fibroblastik görünümünü korumak. Herhangi bir yuvarlama aşırı kalabalık veya diğer istenmeyen gerilme göstergesi olup, bu kaçınılmalıdırin vivo metastatik potansiyel etkileyebilir.
5. İdeal olarak, hücreler inokülasyon (biz az 1 wk tavsiye ya da deney için yeterli hücre elde edene kadar) daha önce sadece kısaca kültür tutulmalı ve yuvarlama veya hücre büyüme oranı değişikliği oluşursa, yeni bir flakon çözdürülmelidir.

2. Hücre Hazırlanması

1. % 0.15 ile% 80-90 izdiham hücreleri Trypsinize tripsin / EDTA (PBS içinde% 0.5 Gibco Tripsin EDTA 01:02 sulandırmak). Bu konsantrasyon hızlı ayrılma (<2 dakika) için olanak sağlar ve hücre kümelenmesi azaltır.
2. Hemen 10 ml buz-soğuk DMEM, 5 dakika boyunca 200 xg'de 15 ml konik santrifüj tüpü içine ve% 10 FBS, pipet ile levha içeren hücreleri çıkarmak.
3. 25 ml buz gibi soğuk PBS (Ca ve Mg olmadan) ve sayma içinde bir 50 ml'lik konik bir tüp içinde süspanse pelet.
4. Yeniden pelet Santrifüj ve ml (intrakardiyak) başına 10 ⁶ hücre ya da buz gibi soğuk PBS 250.000 cells/10 ul (intratibial) de tekrar süspansiyon haline getirin. TemperaPBS Ture hücreleri ve enjeksiyon sonrası sonraki emboli Topaklanmaması için önemlidir. Hücre süspansiyonu enjeksiyon yaparken buz üzerinde kalmalıdır ve yaşayabilir olması ve 30 dakika için un-clumped kalacaktır. Gerekli plaka sayısını tam araştırmacıdan araştırmacıya değişir iken, biz genellikle 8-10 fareler arasında 1 T-75 kullanın.

3. İntrakardiyak Aşılama

1. 4-6 haftalık dişi (Foxn nu-/ -: Harlan) da olabilir diğer immün yetmezlikli farelerde (- -, RAG2-/, SCID, XID, vb RAG1-/) ama fareler, bu deneyler için kullanılır insan kanser hücre deneyleri ile birlikte kullanılabilir.
2. Enjeksiyon prosedürü gelen mortaliteyi azaltmak ve görüntüleme işlemleri arka plan floresan azaltmak için enjeksiyon öncesinde çıplak farelerin beslenen Teklad 2920x diyet 5-10 gün olmalıdır (gıda yonca ücretsiz olduğundan).
3. Nu / nu dışında fare kullanıyorsanız, ventral abdominal ar tıraş veya Nair (bizim deneyim Nair iyi çalışır olarak) kullanarak tüyleriyordamına başlamadan önce ea.
4. Veya diğer tercih edilen anestezi (bizim deneyim izofluran intrakardiyak aşılar için tolere iyi): Bir izofluran buharlaştırıcı (2-3 L / dk O _2% 2.5 Iso) kullanarak bir izolasyon odasında fare uyuştur.
5. Bir paslanmaz çelik havalandırılmış kaput içinde anestezi makinenin burun konisi bir defada bir fareyi hareket ettirin.
6. Göğüs yukarı bakacak sırtında her fare yerleştirin.
7. 2 kez yinelenen,% 70 etanol ardından% 10 povidon / iyot swab / çözeltisi ile göğüs yıkayın.
8. Enjeksiyon için Mark Farenin göğüs (steril bir kalem kullanarak veya enjeksiyon yerinde steril tutmak için biraz yana işaretleme). Biz sternumun bir işareti konumu sternal çentik ve xyphoid sürecinin üst arasında tam orta ve hafif sola (anatomik) kullanın. 300 ul 28 g ½ insülin şırınga pistonu ve menisküs arasındaki boşluk (kardiyak nabız görmek için önemli) oluşturmak için şırınga içine küçük bir hava kabarcığı çizin vehücrelerinin 100 ul hazırlar.
9. Dik iğne tutun. Diğer elinizle gergin fare deri tutarken, iğne takın.
10. Sol kalp ventrikül içine Başarılı ekleme şırınga kan farklı bir parlak kırmızı darbe ile sonuçlanmalıdır. Bu derinlikte, dikkatle göğüs boşluğuna kalp veya dökülmesini hücreleri delinmesiyle önlemek için iğne önemli hareketi olmadan, şırınganın pistonu (100 ul hacim) basın.
11. Hücreleri enjekte edildikten sonra, göğüs boşluğu içine hücre damlama azaltmak için negatif bir basınç yaratmak için az miktarda dalma pistonu üzerine hafifçe yukarı çekmek.
12. Kalp zarının yırtılmasına ve kanamaya neden olabilir kaldırma sırasında eğilme iğne önlemek için emin olurken doğrudan göğüs iğne çekin.
13. Kanamayı azaltmak için enjeksiyon sitesi üzerinden göğsüne hafif basınç uygulayın.
14. Burun konisi gelen fareyi çıkarın ve yaklaşık 1 dakika boyunca hafif bir baskı uygulamaya devam ediyoruz.
15. Tam con kadar ısıtma pedi için fareyi hareket ettirinscious.
16. Fare spin veya kurtarma sonra seğirme başlarsa, olası nedeni, bir emboli. Damar direnci azaltırken kan akımı ve kardiyak outputu artırır ketamin 80-120 mg / kg intraperitoneal yolla fare enjekte. Bu fare pıhtı geçmek yardımcı olmalıdır. Bu oluşur, sonra bu hücreler topaklanma olduğunu gösterir gibi, bu, hücre hazırlıkları değiştirmek en iyisidir. Biz yaklaşık 8 fareler sonrası hücre preparatları değiştirmek veya 30 dk.

4. Intratibial

1. Buprenex (0.1 mg / kg) ya da hemen işlem öncesinde benzer onaylanmış analjezik ile fare enjekte.
2. Izofluran kullanarak fare uyuştur, sonra burun konisi taşımak ve anesteziyi idame ettirmek.
3. % 10 povidon / iyot ile iki bacak temizleyin çubukla / çözüm, 2 kez tekrarlayarak, etanol izledi. Önce kürk varsa temizlik için tüylerini ayakları (Nair veya benzer ürün ile).
4. Yavaşça lateral malleol, medial malleol ve işaret parmağı ve inci ile tibia alt yarısında kavramakumb, sonra dirsek bacak (diz görünür ve erişilebilir şekilde fleksiyon ve lateral rotasyon kombinasyonu.
5. Ayrı, kalın, beyaz bir çizgi olarak görünür olmalıdır patellar ligaman, altta yatan görünürlüğünü artırmak için% 70 EtOH ile cildi ıslatın. Sıkıca 28g fare insert ½ iğne patellanın altında patellar bağ ortasından ayak bileği / bacak kavrama ve tibia üst anterior interkondiler alana da.
6. Tibia içine iğne takarken, hafif delme işlemi ile sürekli, sert basınç kullanarak büyüme plağı dikkatle rehberlik.
7. Tibial büyüme plağının penetrasyonu üzerine, iğne ile daha az direnç karşılaşacak.
8. Iğne tibia ve büyüme plağı geçer sağlamak için iğne yumuşak, yanal hareket kullanın. İğne tibia içinde uygun bir yer olup olmadığını Hareketi sınırlı olacaktır.
9. Yavaşça hücre çözümü 10 ul enjekte pistonu bastırın. Hiçbir direniş Little bu noktada hissettim olmalıdır.
10. SloWLY iğne ayıklayın.
11. Aynı prosedür izlenerek, PBS 10 ml enjekte yanındaki bacağa geçin.
12. Anesteziden fareyi çıkarın ve düzelene kadar ısıtma yastığı tutmak.
13. Sonraki 24 saat boyunca farelere Monitör ve hayvanların sıkıntı belirtileri göstermeye devam ederse ek buprenex ile her 12 saat enjekte.

5. Görüntüleme Zaman Kursu

1. Lusiferaz Görüntüleme: Uygulanamaz, lusiferaz görüntüleme 7 gün sonrasında tümör hücre aşılama (çoğu kemik metastazı model olsa da, yakın günü 14 saptanabilir) başlayan kullanılmalıdır nerede. Fare 150 mg / kg luciferase, anestezi ile intraperitoneal ve IVIS ekipmanlar ⁸ kullanarak enjeksiyondan sonra 8 dakika olarak görüntülenir.
2. GFP görüntüleme: Genellikle GFP ifade tümörler Maestro görüntüleme ekipmanı (CRi) ⁹ kullanarak intrakardiyak deneyler için intratibial enjeksiyonları ve 16-21 için günde 10-14 etrafında algılanabilir olmaya başlar. Kısaca, fareler izofluran ile anestezi uygulanmıştır (% 3) Ve Maestro görüntüleme odasında bir burun konisi ile anestezi altında yapılmaktadır. Bizim eGFP salgılayan hücrelerin için biz 10 nm adımlarla 500 ms maruziyet de mavi filtre seti (eGFP için 498 excitation/515 emisyon) kullanın.
3. Faxitron (X-ray): X-ışınları haftalık 14 günlük 7 arasında başlayan alınır. Lezyonlar 21. günde intrakardiyak modelinde görünür ve bir hafta önce intratibial enjeksiyonları ³ olacaktır. Ex vivo ve in vivo Bizim radyografik veriler maruziyet 8 saniye için 35 kV bir Faxitron LX-60 ile elde edilmiştir.
4. Diğer Görüntüleme: Görüntüleme yöntemleri tamamen özel araştırma dayalı olacaktır. Yukarıdaki yöntemlere ek olarak, 3D mikro-bilgisayarlı tomografi (μCT), mikro-pozitron emisyon tomografisi (μPET), ve diğer modaliteler ^10,11 dayalı canlı hayvan görüntüleme değerli bilgiler sağlayabilir.

6. Fare Kurban

1. Her model biraz farklı bir zaman süreci vardır. MDA-MB-2 ile birlikte31 hücreleri fareler genellikle 21 ve 35 gün ve genellikle günde yaklaşık 28 (BT 21-28 gün arasında farelere enjekte) arasındaki kaşektik veya felçli hale gelir.
2. Bir kez birkaç fare kortikal kemik kırmaya felçli olmak, ya da vücut ağırlığının% 10-20 arasında, servikal dislokasyon (veya diğer IACUC onaylanmış yöntem) ile xylazine / ketamine doz kullanılarak çalışmadaki bütün fareler kurban kaybetmeye başlar lezyonlar gelişir.
3. Tamponlu% 4 formalin daha fazla çalışma ve mağaza için gerekli kemikleri çıkarın.
4. Göğüs tümörü olan Fare cevapsız enjeksiyon bir işareti ve çalışma dışında tutulmalıdır.

7. Ex Vivo Analizi

1. μCT:% 70 EtOH içinde tarama kemik aynı numune üzerinde ölçülür için yapısal ve histolojik parametreler için olanak sağlar.
2. Kontur ve bireysel deney tasarımı ve ekipmanları mevcut ^10'a göre analiz. Bizim verilerimiz 12 mcM çözünürlük kullanarak Scanco μCT 40 ile elde edilmiştir.
3. Histomorphometry: Tercih histolojik yöntemler kullanılarak Süreç örnekleri ve Hematoksilen / Eosin ⁷ ile lekesi

8. Temsilcisi Sonuçlar

Tümör hücrelerinin intrakardiyak veya intratibial aşılama (Şekil 1) takiben fareler röntgen ve flöresanlı (ya da lüminesans) ile haftada bir izlenir. Onlar modeli (Şekil 2) bağlı olarak, haftada 2 gibi erken floresans ve lüminesans görülebilir iken Lezyonlar normalde haftada 2 ve 3 arasında x-ray tarafından anlaşılacaktır. Lezyonlar kemik karanlık delikler gibi görünür, ve zaman (Şekil 3) ile daha belirgin hale gelir. Lezyonlar radyografiler Metamorph analizi kullanılarak ölçüldü ve floresan Maestro (CRi) görüntüleme toplama ve analiz yazılımı kullanılarak ölçüldü. Lezyonlar büyümeye başlaması, fareler sıkça kaşektik olur. Farelerin başlangıç ​​vücut ağırlığının% 10-20 arasında bir kayıp olduğunda Kurban gereklidir. Durumu farelerin hızla değiştirebilir ve gün boyunca birden çok kez kontrol edilmelidir. 3-4 hafta arası farelerde bir veya arka bacaklarda hem sürüklemeye başladığını ve tüm çalışma kurban edildi. Görüntüleri feda öncesinde alınmıştır. Anestezi overdose sonra kan kemik döngüsü veya diğer faktörler belirteçleri ölçmek için toplandı. Servikal dislokasyon sonra, cilt eksize fare ve kemiklerinden sıyrılmış ve en az 7 gün önce in vivo görüntüleme teknikleri daha tümör odaklarının görüntülenmesine izin verecektir ex vivo görüntüleme (Şekil 3) için temizlenmiş. Bir kez görüntüleme tamamlanan kemiklerde etiketli kasetleri yerleştirilir ve fiksasyon ve ileri histolojik işleme veya μCT analizi için formalin bekletildi. ΜCT kemik bozulumu miktarı (Şekil 4) ölçmek için bir incik kemiği üzerinde yapıldı sonra histomorfometri tümör yükü ve BV / TV gösteren numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir.

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
Şekil 1. Enjeksiyon doğru yerleştirilmesi. Ventral radyografik görünümü (A) ^4. interkostal ve intrakardiyak aşılama için sol ventrikül içine iğne doğru yerleştirilmesi gösteren erişkin fare toraks. Anatomik görülecek sternum (beyaz özetlenen) yatay kesikli çizgi ile gösterilmiştir. Fare derisi üzerinde sternal çentik ve xyphoid süreci simgesel olarak hizmet ve iğne sternum sol biraz eklenir. Ventral radyografik görünümü (B) kondiller arasındaki hizalanır, proksimal tibia iğnenin doğru yerleştirilmesi gösteren erişkin fareden bacak. Yanal bir perspektiften bakıldığında iğne ucu tibia tuberositas ve epifiz plaka derin arkasına yerleştirilir. Enjeksiyon için ideal bir konuma beyaz bir daire ile gösterilir.

Şekil 2. Kemik metastazı modellerin Zaman elbette. Ca ilerlemesincer indüklediği kemik hastalığı x-ışınları ve GFP ile gösterilen + tümörlerin floresan görüntüleri intratibial enjeksiyonları (A) ve intrakardiyak enjeksiyon (B) in vivo.

Şekil 3,. . MDA-MB-231 intrakardiak gün sonra 0, 14, 21, ve 28 de GFP floresan gösteren ex vivo İmaj: intrakardiyak MDA-MB-231 modelinin Top Row Zaman elbette. Günde 14 tümör odakları yumuşak doku çıkarıldıktan sonra ex vivo sadece görünür olduğunu unutmayın. Alt satır: osteolitik kemik lezyonlar gösteren aynı femurların ex vivo radyografik görüntüler. Kemik yıkımı 3 hafta kardiyak enjeksiyonu kadar sonra genellikle görünür değildir unutmayın.

Şekil 4. Tibi ve Maestro görüntüleme ex vivo tarafından görüntülenmiştir gibi kemik metastatik hastalık. GFP Niceleme + tümörolmayan bir tümörlü fare (A) ve 4 hafta MDA-MB-231 subclone (B) GFP ifade eden bir intrakardiak sonra, bir fare ae. Tümör odakları Faxitron (D) tarafından gösterildiği gibi kemik yıkım alanları ile ilişkili tümör (C) olmadan bir kemik karşılaştırıldı. MikroBT ölçümlerden Kemik yapısal ve mineral verilerin sağlıklı bir kemik (E) ve tümörlü kemik (F) kemik yıkım alanları void alanı olarak gösterilmiştir 3d görüntü olarak işlenir. Daha sonra kemik ve tümör ayrıntılı karşılık H & E ile boyanmış histolojik kesitler (G & H) görülür.

Tümör kaynaklı kemik hastalığı Çalışmaları en sık kullanılan iki intrakardiyak ve intratibial aşıları olmak üzere çeşitli hayvan modelleri üzerinde güveniyor. Birçok durumda, intrakardiyak kemik metastazı incelemek için en iyi seçenek olmakla birlikte, bu tam metastaz temsil etmez ve bu nedenle, memenin yağlı pedine ya da diğer enjeksiyon ortotopik ideal olarak, bu amaca yönelik kullanılmalıdır. Tümör hücreleri insan hücreleri kullanarak birçok çalışmada birincil sitesinden kolayca metastaz yapmazlar, ve eğer öyleyse, bunlar öncelikle akciğere metastaz. 4T1 hücreleri bazı suşları kemik ^5,6 metastaz, ancak lezyonlar ölçmek için daha zordur, daha küçük olan, ve hücreleri daha çok insan, mürin vardır. Buna ek olarak, GFP tanımı 4T1 klon sık sık uzun süreli metastaz çalışmaları ¹² karmaşık olabilir kullanılan bağışıklık yetkili bir model bir bağışıklık tepkisi uyandırabilir. Tümör kaynaklı kemik hastalığı diğer modeller, miyelom gibi, kuyruk veni inj kullanmakections ^13. Ancak, bu yaklaşım solid tümör metastazı çalışmaları için işe yaramaz o akciğerlere tohum tümörleri, farelerin kemik metastazları geliştirmeden önce akciğer hastalığı ölüme neden ezici olacak gibi. Intratibial enjeksiyonları bu metastazı modeli temsil, daha ziyade kurulan metastatik kemik hastalığının ilerlemesini değil, genel olarak, daha az elverişli diğer yöntemlerden daha baktı, ve enjeksiyon yerinde enflamasyon neden olabilir. Bununla birlikte, bu işlem son evre kanser kaynaklı kemik hastalığı üzerinde doğrudan etkileri ilk metastatik adımları ve kuruluş ayırmak için yararlıdır. Ayrıca, birçok prostat tümör modellerinden durumda, kemik ⁴ tutarlı tümör büyümesini sağlayan tek bir yaklaşımdır.

Izleme kemik hastalığı tekniklerinin seçimi gibi kritik ve inokülasyon rota olarak çalışmaya özgüdür. Bizim grupta biz t, çalışmaya bağlı olarak çok farklı teknikleri kullanmakbunların en yaygın o x-ray, floresans ve histoloji vardır. Birçok grup lusiferaz görüntüleme geçtiğinizden ederken, biz lusiferaz-transfekte hücreler ve floresan görüntüleme ve x-ışınları ile daha kolay işbirliği lokalizasyonu ile daha iyi anatomik detay almak daha az kemik metastazı olsun bulduk. Ayrıca, modaliteleri arasında doğrudan karşılaştırma kemik erken tespiti için lusiferaz görüntüleme için önemli bir avantaj vermemiştir. Ancak, bu deneyler her grup kendi çalışmaları için her bir yaklaşımın yararını değerlendirmek gerekir.

Ayrıca, gerçi birçok diğer modellerde kullanılan, detaylı ex vivo analiz teknikleri kemik özgüdür. Biz sık μCT tarafından kemik kaybı analiz. Normal kemik analiz çalışmalarına benzer performans iken, tümör taşıyan kemiklerin analizi bir marker olarak büyüme plağının sık kaybı veya bozulması nedeniyle karmaşıklaşır. Histolojik analizlerde de biraz tümör nüanslı edilirTaşıyan kemikler dışı tümörlü kemik ve yumuşak dokular için geliştirilen protokoller ile karşılaştırıldığında. Bu protokolde, en yaygın olarak bizim bu grup tarafından kullanılan bu odak korumak için ex vivo analizler açıklama sınırlıdır. In vivo analizlerde olduğu gibi, her grup yaklaşımları onların çalışma için en uygun hangi belirlemek gerekir.

Çıkar çatışması ilan etti.

P01CA040035 (FE / JAS) ve VA Kariyer Geliştirme Ödülü (JAS): Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarından kabul.