Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

Burada sunulan Direkt PCR yaklaşım doğrudan arıtılmadan bitki ve hayvan dokusu küçük miktarlarda PCR kolaylaştırır.

Doğrudan PCR yaklaşımı, doğrudan arıtılmadan örnek küçük miktarlarda PCR amplifikasyon kolaylaştırır, ve çeşitli bitki ve hayvan dokuları (Şekil 1) için burada gösterilmiştir. Direkt PCR onları böyle inhibitörleri yüksek tolerans gibi benzersiz özellikleri veren bir çift iplikli DNA bağlayıcı etki alanı içeren özel tasarlanmış Thermo Scientific Phusion ve phire DNA polimerazlar esas alınmaktadır.

PCR tabanlı hedef DNA tespiti bitki genotip analizi ve transgenlerin doğrulanması dahil olmak üzere bitki araştırma birçok uygulama vardır. Bitki dokuları PCR geleneksel pahalı veya toksik reaktifler gerektirebilir ilk DNA izolasyonu adım içerir. Süreci zaman alıcıdır ve çapraz kontaminasyon ^{1, 2} riskini artırır. Tersine, Thermo Scientific phire Bitki Direkt PCR kiti kullanılarak hedef DNA kolayca önceden DNA ekstraksiyonu olmadan tespit edilebilir. Bu modelde, burada bir göstermiştiryarılan amplifiye edilen polimorfik sekans analizi (dCAPS) ^3,4 örnek Arabidopsis bitki yapraklarından direkt olarak yapılır. dCAPS genotipleme deneyleri SNP allel-spesifik endonükleazlar ³ ile tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) tanımlamak için kullanılır.

Bazı bitki örnekleri onlar gibi fenolik bileşikler gibi PCR ile müdahale bileşenleri içerir olarak doğrudan PCR yöntemleri kullanırken daha zor olma eğilimindedir. Bu durumda, bileşikler kaldırmak için ilave bir aşama geleneksel ^2,5 gereklidir. Burada, bu sorun, doğrudan PCR amplifikasyonu (Şekil 1) takip ettiği bir hızlı ve kolay bir seyreltme protokolü kullanılarak bu sorunun üstesinden gelinmemektedir. Numune tanen içeren fenolik bileşikler içerdiği yüksek miktardaki olarak Onbeş yaşındaki meşe yaprağı zorlu tesisleri için bir model olarak kullanılmaktadır.

Fareler içine gen aktarımı genel olarak develo genlerin rollerini araştırmak için kullanılmaktadırpment, fizyolojisi ve insan hastalıkları. Bu hayvanların kullanımı genellikle PCR ile, transgen varlığının taranması gerekir. Geleneksel olarak, bu kulak, kuyruk veya ayak dokuları ^6,7 arındırılan PCR analizi için hangi DNA sırasında zaman alıcı bir DNA izolasyonu adım içerir. Bununla birlikte, Thermo Scientific phire Animal Tissue doğrudan PCR Kit transgenik fareler ile önceden DNA arıtma olmaksızın genotipleme edilebilir. Bu protokol genotipleme transjenik fare gibi bir primer kümesi boyutu büyük ölçüde farklılık gösteren iki parça arasında amplifikasyonu için kullanılan bir zorlu örneğin burada gösterildiği gibi, fare kulak dokular tarafından doğrudan elde edilir.

1. Doğrudan Protokolü Arabidopsis Bitki Bireylerin genotiplendirmesi

1. Arabidopsis bitki yaprağı doğrudan dCAPS genotipleme tahlil başlamak için, ilk olarak Tablo 1'de açıklandığı phire Bitki Direkt PCR Kit kullanarak 20 veya 50 ul PCR reaksiyonları formüle.
2. Sonraki Harris Uni-Core ve Harris Kesme Mat kullanarak Arabidopsis bitki yaprak bir 0.50 mm yumruk kesti. Sıkıca zımba Holding, doku içine kesme kenarına basın ve ileri geri puncher döndürün.
3. PCR reaksiyon karışımı içine zımba diski çıkarmak için dalgıç basın. Örnek PCR çözüm içine düşer ve tüp duvarları sopa değil emin olun.
4. 2% NaClO çözelti içine batırarak çapraz bulaşmayı önlemek için her örnek arasındaki delici ve kesici kenar temizleyin. Dalgıç kadar basın ve aşağı birkaç kez ve temiz bir kağıt havlu ile kesme kenarı silin. Kesme mat de olmalıdırnumuneler arasındaki durulanır.
5. Daha sonra, bir termo Scientific kullanmak piko Cycler ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 2 'de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için 24-iyi termal. PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR termal cycler'ların içinde gerçekleştirilebilir.
6. PCR sonra, bitki materyali aşağı spin. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 5 ul süpernatan aktarın. Su 4 ul ve restriksiyon enzimi, SspI 1 ul ekleyin. Yavaşça karıştırın ve tüpün dibinde içeriği toplamak için kısaca aşağı doğru döndürün. 37. az bir saat boyunca reaksiyon karışımı inkübe ° C. 20 dakika süreyle 65 ° C'de inkübe edilerek kısıtlama enzim inaktive eder.
7. Bitki dokuları doğrudan DNA yükselterek zaman, PCR ürünleri restriksiyon sindirimi enzimi ile etkileşime girebilir bitki ve PCR-türetilmiş bileşenler içerir. Bu nedenle, ya da seyreltik (örn., 1:2 veya su 1:3) ya da t önce PCR ürünü temizlemek için gerekli olabilecekböyle Thermo Scientific GeneJET PCR Saflaştırma Kiti gibi uygun bir ticari kit kullanılarak, örneğin sonraki sindirim,.
8. , Sınırlama enzimi özümlemesi takiben, bir agaroz jeli üzerinde analiz çıkan parçalar. Reaksiyon için 5x yükleme tampon 2.5 ul ekle ve nihai karışım, 10 ul ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirir.

2. 15 yaşındaki Oak Spesifik DNA parçaları yükselterek Seyreltme Protokolü kullanarak Yapraklar

1. Başlamak için, meşe yaprağı 2 mm yumruk kesti.
2. Phire Bitki Direkt PCR Kit ile birlikte Sulandırma Tamponu 20 ul içine örneği yerleştirin. Delici ve kesici kenar temizleyin ve daha önce olduğu gibi mat kesme.
3. Tüp duvara kısaca basarak 100 ul pipet ucu ile yaprak örneği Crush. Bitki materyali bağlı dilüsyon protokolü bazen örnek ezilmeden iyi çalışır.
4. T kadar mikrosantrifüj kısaca örnekleri Spino reaksiyon Tüplerin tabanında yer almaktadır.
5. Süpernatan PCR içinde doğrudan kullanılabilir, ya da örnek türüne bağlı olarak steril su 1:10 ya da 1:100 dilüe edilebilir. Bir 20 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak süpernatan ya da seyreltme 1 ul 0.5 ul kullanın. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi reaksiyonu hazırlayın.
6. Reaksiyonları hazırlanır sonra, bir Thermo Scientific kullanmak piko Cycler ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 2 'de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için 24-iyi termal. PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR termal cycler'ların içinde gerçekleştirilebilir.
7. PCR sonra, reaksiyon için 5x yükleme tamponu 5 ul ekleyin ve nihai karışım, 15 ul ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirir.

3. Seyreltme Protokolü kullanarak Transgenik Farelerin genotiplendirmesi

1. M 2 mm yumruk koyarak transgenik fareler üzerinde seyreltme protokolü Başlayanphire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit ile birlikte DNARelease Katık 0.5 ul içeren Sulandırma Tamponu 20 ul ouse kulak.
2. 98 2 dakika inkübasyon, ardından 2 dk ° C'de için numuneler oda sıcaklığında inkübe
3. Reaksiyon tüplerin alt olana kadar bir mikrosantrifüj içinde kısaca örnekleri Spin.
4. Tablo 3 'de tarif edildiği gibi hazırlanan bir 20 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak 1 ul süpernatan kullanımı. Hemen kullanılmak üzere olmayan herhangi bir Süpernatant yeni bir tüpe aktarılmıştır ve -20 ° C'de saklanabilir
5. Daha sonra, bir termo Scientific piko 24-iyi termal döngü cihazı ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 4 'de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için kullanır. Yine, PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR cycler'ların içinde gerçekleştirilebilir.
6. PCR sonra, reaksiyon için 5x yükleme tamponu 5 ul ekle ve agaroz jel elektroforez w gerçekleştirmekMeydana gelen karışım, Vizyonunda 15 ul.

4. Temsilcisi Sonuçlar

DCAPS teknikte ilgi SNP içinde sınırlandırma bölgesi ya da katılabilmekte ya da hedef DNA bir ya da daha fazla uyumsuzlukları ile bir PCR primer ile yok edilir. Arabidopsis bitki bireylerin Genotiplendirme doğrudan yaprak yumruklar gelen dCAPS tekniği ile yapıldı. Amplifiye ürünler sindirilir ve her bireyin genotipinin ortaya çıkan parçalar (Şekil 2) jel elektroforezi ile analiz edildi.

Bu örnekte, Arabidopsis genom ilgi SNP sitesi (G ya da A alleli) içeren 160 bp PCR ürünleri phire Plant doğrudan PCR Kit ile bitkinin yaprak zımbalar amplifiye edildi. Ileri primer ilgi SNP (A aleli) dahil, ancak, hedef DNA bir SspI özel sınırlama alanı yaratmak, 3 'ucunda bir uyumsuzluk içerdiğiSNP (Şekil 2B) diğer allel içinde.

Seyreltme protokolleri fenolik bileşikler, yüksek konsantrasyonu nedeniyle bu tür meşe yaprağı gibi zorlu bitki materyali, için gereklidir. Seyreltme protokolü kullanılarak burada açıklandığı gibi, chloroplastic DNA 297 bp fragmanı 3 aşamalı bir protokol kullanılarak büyütüldü. Dilüsyondan ile Oak yaprak örneklerinde pozitif ve negatif kontroller ek olarak, Şekil 3 'de gösterilmiştir.

Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit için transgenik fareler için 1500 bp ve 200 bp hem doğru boyutlu ürünlerin bol verimi sonuçlanan bir primer seti büyük bir boyut farkı olan iki parçalarının amplifikasyonu için kullanılan zorlu bir protokol ile istihdam edildi vahşi tip farelerde (Şekil 4). Heterozigot farelerde zayıf üst bant aynı primer çifti için iki şablon (alleli) ve rekabet nedeniyle, ancak, genotiping sonuçlar açık bulunmaktadır.

Seyreltme protokol kullanılarak hazırlanan numunelerin stabilitesi de test edilmiştir. Elde edilen sonuçlar, seyreltme numuneler, en az bir yıl süre ile -20 ° C'de muhafaza edilebilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tekrarlanan donma / çözülme döngüsü anlamlı reaksiyon (Şekil 5) etkilememiştir. Ayrıca phire DNA Polimeraz ve sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz ve saflaştırılmış DNA (Şekil 6) göre doğrudan PCR yöntemiyle fare kulak doku örneklerinden sağlam amplifikasyon olduğu gösterilmiştir.

Tablo 1. Bitki PCR reaksiyon şartları bu protokolü kullanılmıştır.

Tablo 2. Bitki PCR BİSİKLET koşulları bu protokolü kullanılmıştır.

At * Tm hesaplayıcıoscientific.com / pcrwebtools "hedef =" phire Hot Start II DNA polimeraz ile kullanılmak için primerler için Tm belirlerken _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools tavsiye edilmektedir. primerler için tavsiye edilen tavlama sıcaklık ≤ 20 nt kadardır webtool tarafından verilen daha düşük Tm. primerler> 20 nt için bir tavlama sıcaklık 3 ° 'lik C webtool tarafından verilen daha düşük Tm daha yüksektir.

Tablo 3. Hayvansal Doku PCR için reaksiyon koşullarının bu protokolü kullanılmıştır.

Tablo 4. Bu protokolde kullanılan Hayvansal Doku PCR için Bisiklete binme koşulları.

* Olarak Tm hesap makinesi www.thermoscientific.com / pcrwebtools phire Hot Start II DNA polimeraz ile kullanılmak için primerler için Tm belirlerken tavsiye edilir. Primerler ≤ 20 nt için önerilen bir tavlama sıcaklık webtool tarafından verilen daha düşük Tm eşittir. Primerler> 20 nt için bir tavlama sıcaklığı 3 kullanın ° C webtool tarafından verilen düşük Tm daha yüksektir.

Şekil 1. Doğrudan PCR iş akışı. Direkt PCR iki alternatif protokoller kullanılarak yapılabilir. Doğrudan protokol örneği küçük bir miktar doğrudan bilgisayara eklenirR reaksiyonu. Seyreltme protokol numune malzemeden DNA serbest bırakmak için PCR önce, kısa bir ön-kuluçka adım kullanmaktadır.

Şekil 2. Yaprak yumruklar doğrudan dCAPS tekniği ile Arabidopsis bitki bireylerin genotiplendirmesi. A) Şekil 2A dCAPS testinin prensibi gerçekleştirilir göstermektedir. İlgi SNP içinde sınırlandırma bölgesi ya da katılabilmekte ya da hedef DNA bir ya da daha fazla uyumsuzluğu olan bir primer kullanılarak PCR ile uzaklaştırılır. PCR ürünleri sindirilir ve elektroforezi ile analiz edildiğinde çıkan parçalar her bireyin genotipinin ortaya koymaktadır. B) Bitki yapraklarından 0.50 mm yumruklar 50 ul PCR reaksiyonlarında doğrudan yerleştirildi edilir. SNP sitesi (G veya A alleli) içeren 160 baz çiftlik PCR ürünleri primerleri A alleli için eşsiz bir SspI sitesini tanıtan ile amplifiye edildi. Arıtılmadan PCR ürünleri Diges idiSspI restriksiyon enzimi ile ted. Elde edilen fragman, bir% 3 agaroz jeli üzerinde analiz edilmiştir. Lane M boyut işaretleyici olarak kullanılabilir; şerit A ve G'nin her biri numune SNP allel karşılık gelir. Elde edilen sonuçlar PCR ve restriksiyon sindirimi (veriler gösterilmemiştir) tarafından takip DNA ekstraksiyonu geleneksel analizi ile teyit edilmiştir. Şablon DNA olmadan negatif kontrol reaksiyonları kurmak testi dahil ve sindirim (veriler gösterilmemiştir) gerçekleştirmeden önce gerçek PCR reaksiyonları ile paralel ayrı bir agaroz jel üzerinde çalışıldı.

Şekil 3,. Seyreltme protokolü meşe yaprağı örnekleri kullanarak. Seyreltme protokolü (1:100, 1:10, 1 farklı dilüsyonlarda meşe yaprağı örnekleri (3-adım protokolü, 62 ° C'de tavlama) içinde chloroplastic DNA 297 bp parçasının büyütülmesi için kullanılan : 1 ve 2:1) ve pozitif ve negatif controls [C +: C-: Hiçbir şablon DNA negatif kontrol saflaştırılmış DNA (Arabidopsis), pozitif kontrol]. Örnek isimlendirme numune toplama site (Finlandiya kasaba) ve numaralandırma örnek temsil eder.

Şekil 4. Seyreltme protokolü kullanarak bir primer çifti ile transgenik farelerin genotiplendirmesi. Dokuz ayrı fareler (şerit 1-9) Kulak dokuların DNARelease Katkı dahil Sulandırma Tamponu 20 ul yerleştirildi. Oda sıcaklığında inkübe edilmesi ve sonra, 98 ° C, 1 ul süpernatan 20 ul PCR tepkimesinde bir şablon olarak kullanılmıştır. Fragment boyutları: 1500 bp (transgenik) ve 200 bp (yabani-tip).

Şekil 5,. Numuneler uzun süreli depolama boyunca stabildir. Fare kulak doku örnekleri inc olan seyreltme protokolüne göre hazırlanmış DNARelease katkı maddesi de dahil olmak üzere seyreltme tamponu 20 ul içinde ubated ve tekrarlanan donma / çözülme (kulvar 1) tabi tutuldu bir yıl (kulvar 2) için -20 ° C 'de depolandığı ya da PCR (yol 3) için hemen kullanılmıştır. Amplifiye parçası boyutları 900 bp 1.500 bp ve 3.200 bp idi.

Şekil 6. Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit sıcak bir başlangıç ​​Taq DNA polimeraz ile birlikte ticari bir DNA arıtma sistemi geride bırakıyor. Dört amplikonlarının (0.5-1.5 kb) phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit seyreltme protokolü kullanarak fare kulak dokulardan amplifiye edildi. Karşılaştırma için, DNA ilk olarak ticari bir DNA çıkarma kiti kullanılarak ve aynı parçaları üreticilerin önerilerine uygun olarak sıcak bir başlangıç ​​Taq DNA polimeraz kullanılarak amplifiye edildi saflaştırılmıştır. Sadece phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit ile başarıyla güçlendirilmiş dört amplikonlarının vardı.

Burada gösterilen doğrudan PCR yaklaşımı zaman gerekli azaltılması ve bitki ve hayvan genotipleme (Şekil 7) için akışı kolaylaştırmak üzere doğrudan arıtılmadan örneklerinin küçük miktarlarda PCR amplifikasyonu için bir olanak sağlar. Ayrıca burada gösterilen doğrudan PCR yaklaşımı (Şekil 3) ile kombinasyon halinde seyreltme protokolünün kullanılmasıdır. Seyreltme protokolü zor örnekleri (bileşikler müdahale içeren örneğin yaşlı bitki yaprakları, bitki türleri) veya uzun (veya GC-zengin) amplikonlarının ile tavsiye edilir. Reaksiyon optimizasyonu için izin veren yeni bir doğrudan PCR deneyi, başlangıç ​​Bu protokol, özellikle yararlıdır. Protokol, doku malzemesi ve / veya kullanılan primerler farklılıklar nedeniyle düşük ürün verimleri gibi zaman zaman zorlukları gidermek için bir araç olarak hizmet edebilir. Seyreltme protokolü genelinde örnek bir tüketilen değildir sağlarken Ayrıca, aynı örnekten birden fazla reaksiyonlar çalıştırırken kullanmakreaksiyon.

PCR için bitkilerden DNA arındırmak için, kongre potansiyel PCR analizi ⁸ engelliyor olabilir çeşitli bileşenleri kullanılarak DNA izolasyonu takiben hücre lizis yapılmasıdır. Yüksek fenolik içerik, polivinilpirolidon ilavesi ile özellikle zor bitkiler için geleneksel bir hücre parçalama ^2,5 takiben DNA bağlama bileşikleri çıkarmak için kullanıldı. Açıkça burada olduğu gibi, bu karmaşık, zaman yoğun adımları hedef DNA tespit phire Bitki Direkt PCR Kit kullanımı ile önlenebilir. Hücre parçalama ve DNA izolasyonu adımları doğrudan Arabidopsis bitki yaprakları (Şekil 2) duyarlı dCAPS teknikler kullanılarak atlanabilir. Burada gösterildiği gibi, seyreltme protokol etkili bir PCR (Şekil 3) ile karışabilir sorunlu bileşenlerinin varlığını yönetir.

Geleneksel olarak, hayvan genotipleme için bir önkoşul isolati olduorganik çözücü ekstraksiyonu, alkol yağış ve santrifüj adımları ^6,9,10 takip deri ve bağ dokusu, sindirimi proteinaz K ile uzun bir inkübasyon ile karakterize bir toksik, zaman alıcı bir süreç yoluyla hayvan dokusu genomik DNA üzerinde. Olarak burada gösterdi, bu sürecin basitleştirilmesi transgenik farelerin önceden DNA arıtma (Şekil 4) olmadan genotiplenmiştir izin vererek, phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit kullanımı yoluyla elde edilir. Bu makale gösterilen örnek, özellikle tek bir primer seti büyük bir boyut farkı olan iki parçalarının amplifikasyonu için kullanılan gibi zordur. Protokol doğuştan gelen güç olmasına rağmen basit seyreltme protokol iki PCR ürünleri (Şekil 4) yüksek verimle sonuçlandı ile birlikte doğrudan PCR yaklaşımı kullanır.

PCR tabanlı hedef DNA tespiti belirlemek için genotip analizi de dahil olmak üzere, araştırma alanında bir çok uygulama vargelişimi, fizyolojisi ve hastalık genlerin rolleri. Özel DNA polimeraz inhibitörü tolerans sayesinde, önceki protokol DNA arıtma olmadan en az sürede tamamlanabilir.

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Thermo Fisher Scientific, Inc tarafından desteklenen

Arabidopsis örnekleri ve ilgili PCR primerleri için biz Profesör Jaakko Kangasjärvi ve grubu, Bitki Stres Grubu, Bitki Biyolojisi, Biosciences Bölümü, Helsinki Üniversitesi ederim. Geleneksel yöntem ile deneyler Bayan Airi Lamminmäki tarafından yapılmıştır.

Transgenik fare örnekleri Dr Jaana Vesterinen, Biyotıp / Biyokimya Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi tarafından sağlandı.

Harris Uni-Core ve Harris Kesme Mat Tüm diğer ticari markalar Thermo Fisher Scientific Inc ve iştiraklerinin mülkiyetindedir Shunderson Communications Inc ticari markalarıdır.