Kök Hücreler Ferumoxytol, FDA Onaylı Demir Oksit Nanopartikül Etiketleme

Biz, FDA onaylı, süperparamanyetik demir oksit (SPIO), ferumoxytol (Feraheme) ile kök hücre etiketleme ve izleme için kullanılan bir tekniktir açıklar. Hücresel görüntüleme tekniği, manyetik rezonans görüntüleme (MR) görüntüleme için kullanır Bu, başarılı ya da başarısız hastalarda kök hücre engraftments uzun vadeli izleme ve teşhis için kolay erişilebilir.

Kök hücre temelli tedaviler rejeneratif tıp alanında önemli bir potansiyel sunmaktadır. Ancak, çok nakledilen hücrelerin in vivo kinetiği ile ilgili olarak anlaşılmalıdır kalır. In vivo olarak nakledilen kök hücrelerin arka arkaya izlemek için bir non-invaziv yöntem, araştırmacılar kök hücre nakli doğrudan izlemek için izin ve başarılı veya başarısız engraftman sonuçların belirlenmesi .

Kök hücrelerin geniş bir yelpazede sayısız uygulamalar için soruşturma devam ediyor. Insan embriyonik böbrek, 293 (HEK293) hücreler, insan mezenkimal kök hücreler (hMSC) ve uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri: Bu protokol, 3 farklı kök hücre popülasyonlarının üzerinde duruluyor. HEK 293 hücreler makaslanmış adenovirüs 5 DNA kültür yetiştirilen insan embriyonik böbrek hücreleri elde edilir. Bu hücreler kolayca kültüre, çünkü araştırma yaygın olarak kullanılan, hızlı büyümek ve kolayca transfekte. hMSCs yetişkin kemik iliği bulunur. Bu hücreler ca,multipotency veya sınırlı sayıda hücre kaderi içine ayırt etmek için potansiyel korurken n farklılaşmamış hücreler olarak çoğaltılan. hMSCs osteoblastlar, adipositler, kondrosit, tendon, kas ve kemik iliği stroma içeren mezenkimal doku, soy ayırt edebilirsiniz. iPS hücreleri, genetik, genler ve benzeri faktörler, embriyonik kök hücreleri tanımlayan özellikleri ifade etmek için değiştirilmiş yetişkin hücreler reprogrammed. Bu hücreler, tüm hücre ^soyları 1 içine ayırt etmek için kapasitesine sahip pluripotent anlamı vardır . Her iki hMSCs ve iPS hücreleri, doku yenileyici kapasitesi in vivo göstermiştir .

Süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nanoparçacık hücre etiketleri kullanımı ile birlikte manyetik rezonans (MR) görüntüleme yakın mikroskobik anatomik çözünürlük nedeniyle kök hücrelerin in vivo takibi için etkili olduğu kanıtlanmıştır, bu yarı-ömrü daha uzun bir kan uzunlamasına görüntüleme ve izin yüksek sensitivity SPIO MR tarafından sağlanan hücre tespiti için ^2-4 nanopartiküller. Buna ek olarak, SPIOs kullanımı ile MR görüntüleme klinik olarak çevrilebilir. SPIOs bioreactive demir çekirdek plazma bileşenleri içeren hizmet veren bir dekstran, carboxydextran veya nişasta yüzey tabakası ile demir oksit çekirdek oluşur. Bu ajanlar, T2-ağırlıklı MR ^{görüntüleri} 5 bir azalma sinyal yol yerel manyetik alan homojen olmayan düzensizlikleri oluşturun . Ne yazık ki, SPIOs artık üretilmektedir. İkinci nesil ultrasmall SPIOs (USPIO), ancak, bir alternatif sunuyoruz. Ferumoxytol (FerahemeTM) polyglucose sorbitol carboxymethylether kat ile çevrili olmayan bir stokiyometrik manyetit çekirdek oluşan bir USPIO. Ferumoxytol kolloidal, parçacık boyutu, ışık saçılması tarafından belirlenen 17-30 nm. Molekül ağırlığı 750 kDa ve 2T MR alanında sabit relaksivite 58,609 mM-1 sn-1 gücü ^4. Ferumoxytol yakın zamanda FDA onaylı bir, böbrek ^yetmezliği 6 olan hastalarda demir eksikliği tedavisi için bir demir takviyesidir . Grubumuz, bu ajan uygulanan hücre etiketleme uygulamaları için "off label" kullanım vardır. Bizim teknik, MR görüntüleri etiketli hücrelerinin önemli MR sinyali etkilere yol açar ferumoxytol ile kök hücreleri etkin bir etiketleme göstermektedir. Bu teknik, kök hücre tedavileri, klinik öncesi ve klinik ortamlarda non-invaziv izlenmesi için uygulanabilir.

1. 1. Gün

1) Plaka hücreleri

1. Etiketleme için en az 18-24 saat önce T75 confluency 80% balonuna Plaka hMSC. Alternatif gemiler için talimat için Tablo 1'e bakınız.

2. 2. Gün

2) etiketleme çözümü hazırlayın. Bu preparat, 400 mikrogram Fe / ml 'lik bir konsantrasyon ile% 80 confluency az bir (1) T75 şişesi etiketi. Alternatif gemiler için talimat için Tablo 1'e bakınız.

1. 15 ml konik boru: 1 ml serum özgür medya ve 93.1 ul ferumoxytol (30 mg / ml hisse senedi) karıştırarak bir çözüm (solution 1) oluşturun.
2. Ikinci bir 15 ml konik tüp: Serum özgür medya ve protamin sülfat 7 ul (10 mg / ml hisse senedi) 1 ml karıştırılarak ikinci bir çözüm (çözüm 2) oluşturun.
3. Her çözüm 5 dakika dinlenmek için izin verin.
4. Çözüm 1 ve 2 birlikte ekleyin. Yeni etiketleme çözümü yavaşça karıştırın. 5 dakika dinlenmek için çözüm USPIO-pro izin için izin verbronşial histamin sülfat kompleksleri oluşturur.
5. SPIO / son bir hacim 7 ml protamin sülfat çözeltisi karışık 2 ml 5 ml serum ücretsiz medya ekleyin.

3) etiketlenmesi için hücreleri hazırlayın

1. Hücrelerden medya aspire.
2. Önceden ısıtılmış Mg / Ca-ücretsiz D-PBS veya serum ücretsiz medya 2-3 ml kontrast madde alımı ve etiketleme verimliliği bozabilecek artık serum proteinlerinin ve diğer medya bileşenleri nazikçe yıkayın hücreleri bir kez yıkayın. Durulama sıvısı aspire.

4) Etiket hücreleri

1. Hücreler için çözüm etiketleme tam 7 ml ekleyin.
2. Bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO ₂₎ ve hücrelerin, 4 saat boyunca etiketleme çözümü inkübe izin icine koyun hücreleri .
3. % 10 son bir serum konsantrasyonu elde etmek için FCS 700 ul hücrelerin etiketleme çözümü ekleyin. Serum hücreleri alışkın olan zenginleştirilmiş ortam yeniden kurmak için, ve mil yardımcı olmak için eklenirani bir kayma serum serbest bir ortamda 24 saat maruz kalma hücre ölümüne neden olabilir nimizing.
4. Hücreleri etiketleme çözümü ile ek bir 20 saat süreyle inkübe izin ver.

3. 3. Gün

5) işaretli hücrelerin hazırlayın

1. Etiketleme çözümü hücreleri aspire.
2. Önceden ısıtılmış Mg / Ca-ücretsiz D-PBS 2-3 ml hücreleri nazikçe yıkayın. PBS aspire. Bu ücretsiz PBS-Mg / Ca, Mg ve Ca sonraki adımda tripsin verimliliğini olumsuz olarak kullanmak önemlidir.
3. Hücrelerin% 0.05 tripsin önceden ısıtılmış 2 ml ekleyin ve balon balonun tüm yüzey sağlamak için ileri ve geri eğim tripsin ince bir tabaka ile kaplıdır. Hücrelerin bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO ₂₎ yerleştirin ve hücreleri plaka ayırmak alıncaya kadar hücreleri veya 5-7 dakika dinlenmek için izin. Bu mikroskop altında dekolmanı onaylamak için gerekli olabilir. Yavaşça gerekirse fa balonun iki dokununhücre yüzeyi dekolmanı cilitate.
4. Tripsin nötralize etmek için balona 4 ml önceden ısıtılmış eksiksiz bir medya ekleyin. Hafifçe birkaç kez tripsin / medya / hücre çözümü yukarı ve aşağı pipetleme şişeyi çalkalayın. 15 ml konik bir tüp içinde tüm çözüm toplayın. 5 dakika boyunca 400 RCF hücre çözümü santrifüjleyin.
5. Hücre pelletini bozmadan süpernatantı dikkatlice aspire. Medya 5 ml (serum içeren veya serum) hücrelerin tekrar 5 dakika boyunca 400 RCF hücre çözümü santrifüjleyin.
6. Adım 5.5 'de açıklanan hücre yıkama tekrarlayın. Toplamda, hücreler üç kez medya ve hücre yüzeyinde kalan, ücretsiz kontrast madde kaldırmak için durulanır olacaktır.
7. Hücreleri önceki yıkama esnasında kaybolacak gibi, en doğru hücre sayısını elde etmek için, bu noktada hücreleri güvenin. Bir hücre canlılığı testi yapın. Hücreler artık bir sonraki analiz ya da deneysel uygulama için hazır. MR görüntüleme ve T1-w ile yapılabilir T2-w parametreleri, ferumoxytol T2-w kontrast madde olmasına rağmen, çünkü ferumoxytol de T1 etkileri sergiler. Görüntü ferumoxytol etiketli hücreler için kullanılabilir Temsilcisi T2-w MR parametreler şunlardır: 60-80 ms 2000-2500 ms ve TE TR FSE veya SE_Multislice dizileri. T1-w bir görüntü elde etmek için, FSE TE değeri veya SE_Multislice dizisi azaltmak veya yüksek TR ve TE düşük GRE dizisi kullanmak. Şekil 4, in vivo uygulama etiketli kök hücre görüntüleme için önemli bir potansiyel göstermektedir .

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Etiketli hücreleri T2 ağırlıklı MR görüntülerinde önemli koyulaşması veya negatif kontrast etkisi ve T1 ağırlıklı MR görüntülerinde bir parlatma veya pozitif kontrast etkisi (Şekil 2) göstermektedir. Boyuna MR ve canlılık testleri, 5 gün etiketleme anlamlı MR sinyal ve etiketsiz denetimleri (veriler gösterilmemiştir) ile karşılaştırıldığında canlılığı üzerinde anlamlı bir etkiye gösterdi yapıldı.

Şekil 1, kök hücreler, demir oksit nanoparçacık, ferumoxytol etiketlenmesi için şematik zaman çizgisi.

Şekil 2. hücre pelletini hücreleri ile sagittal kesitte thrrough Eppendorf tüpleri MR görüntüleri. A) Etiketsiz kontrolleri. B) veya negatif kontrast madde etkisi önemli bir T2 T2 ağırlıklı FSE SE_Multislice görüntüleme ve T1 ağırlıklı GRE sekansında T1 ya da pozitif bir kontrast madde etkisi gösteren Etiketli hücreleri.

Şekil 3 Eppendorf tüpleri hücreleri ile hücre pel sagittal kesitlersağlar. Az 10.000 ferumoxytol etiketli hücreleri, T2-w MR ile tespit edilebilir.

Şekil 4 ferumoxytol etiketli kök hücrelerin MR görüntüleme fare serebral ventriküller içine enjekte. A) Aksiyel hiçbir USPIO etiketli kök hücre enjeksiyonu ile fare Barin, MR görüntüsü. B) Koronal Aksiyal, C), ve D) sagital MR görüntüleri bir fare beynine enjekte USPIO etiketli kök hücreler (beyaz ok) T2, negatif kontrast etkisi gösteren.

Tablo 1. alternatif damarlarında hücrelerin etiketlenmesi için Miktar adaptasyonlar.

Kök hücre engraftments etkinliğini artırma rejeneratif tıbbın ilerlemesi için kritik öneme sahiptir. In vivo kök hücreleri için bir non-invaziv görüntüleme tekniği önemli ölçüde başarılı engraftman sonuçlara yol açan mekanizmaları anlamak için yeteneğimizi artırır. Manyetik etiketleme için prosedür olarak ortaya koyduk MR görselleştirme, MR görüntüleme ile kök hücrelerin in vivo takibi sağlar. Manyetik etiketli kök hücreleri hedef dokulara daha önce nakledilen ve MR ⁷ haftaya kadar görüntülendi edilmiştir. Uzun vadeli etiketleme ve boyuna görüntüleme ⁸ hücreleri içindeki demir oksit nano-lizozomal depolama nedeniyle mümkündür. Zorluklar Ancak, uzun vadeli izleme demir etiketli hücreleri ile uyumlu. Bir meydan okuma ile ilişkili demir etiketli hücreleri boyuna görüntüleme gibi sağlıklı, canlı hücreler, kontrast madde kızı fu dağıtılır çoğaldığınır hücreler. Kontrast madde kızı hücrelere dağılımı eşit değildir ve zaman içinde belirgin bir kontrast madde seyreltme etkisi. Demir işaretli hücrelerin uzun süreli izleme ile ilgili ikinci bir sorun aslen etiketli orjinal etiketli, ölü hücreleri ⁴ kontrast madde serbest fagosite olabilecek böyle bir makrofajlar gibi yerleşik fagositler, canlı hücreler arasındaki farklılıklarda. Grubumuz ferumoxytol ^9-11 dışındaki demir oksit nano ile etiketlenmiş olmuştu yaşayabilir ve apoptotik kök hücre nakli, uzun vadeli sinyal kinetik farklılıkları tespit etmiştir. Gelecek çalışmalar, bu ilkelerin aynı zamanda ferumoxytol etiketli hücre nakli için geçerli olup olmadığı belirlemek için gereklidir.

Bu çalışmada potansiyel etkileri ferumoxytol etiketleme incelenmedi kök hücreleri farklılaşma kapasitesi sergilemek olsa da, önceki çalışmalarda ayırıcı bir SPIO doza bağımlı etkisi göstermiştirdüşündüren, kök hücrelerin farklılaşma kapasitesine zarar vermeyen bir ferumoxtyol doz, farklılaşma potansiyeli engellemeyecektir parçası mı kapasitesi ve SPIO dozları da ^{12, 13} tespit edilebilir.

Büyük SPIOs (hidrodinamik çapı> 50 nm) gibi, protamin lipofectin ve poli-L-lisin (PLL) ³ elektroporasyon veya transfeksiyon ajanlar ile basit inkübasyon ve transfeksiyon dahil olmak üzere çeşitli etiketleme teknikleri ile kök hücre etiketleme aşağıdaki hücre izleme amaçları için daha önce uygulanmış olan ^{, 13-16,} SPIOs hücre etiketleme, hücre etiketlenmesi için transfeksiyon yöntemleri için her zaman gerekli değildir, etiketleme kolaylaştırmak ve etiketleme verimliliği ^artırarak 15 için yararlı olduğu ispatlanmış olmasına rağmen . Ancak, hücre etiketlenmesi için kullanılan SPIOs ticari nedenlerle üretiliyor artık. Ferumoxytol Ultrasmall olarak SPIO (USPIO, hidrodinamik çapı <50 nm), diğer taraftan hala üretiliyorama verimli hücresel alımı ⁸ ulaşmak için bir transfeksiyon ajan yardım gerektirir. Protamin sülfat, kök ^hücreler 17 kontrast madde fagositik alımını kolaylaştırmak için USPIOs kompleksleri oluşturan klinik olarak uygulanabilir transfeksiyon ajandır. Kombinasyonu FDA onaylı, FDA onaylı USPIO, ferumoxytol, protamin sülfat, bu ajanın etiket dışı kullanımı yoluyla kök hücre izleme teknikleri klinik çeviri için bir potansiyel sağlar. Notu, ferumoxytol klinik çalışmalarda ¹⁸ mükemmel bir güvenlik profili gösterdi. Biri olarak gösterilen bir teknik ile nakledilen hücrelerin doğrudan görselleştirme teşvik etmek ya da olumsuz, başarılı bir kök hücre transplantasyon ve klinik uygulamalar için en umut verici teknikleri belirlemek için yardımcı faktörlerin daha iyi anlaşılması için izin verecek. Klinik olarak uygulanabilen hücre belirteçleri ve görüntüleme ekipmanı kullanımı, bu görüntüleme tekniği, prensip olarak kolay erişilebilirkök hücre nakli uygulanan hastaların.

Bu çalışmada, tüm katkıda açıklamalar sunuyoruz.

3R01AR054458-02S2: Bu çalışma, Ulusal Artrit ve Kas-İskelet Sistemi Enstitüsü ve Cilt Hastalıkları bir hibe ile desteklenmiştir.