Method Article
Bu raporda, üç boyutlu bir cilt, mimari ve kompozisyon insan deri taklit modeli yeniden açıklar. Melanosit fizyolojisi, melanom ilerlemesi ve dermal kök hücre kaderi cilt modeli yeniden kullanarak incelenmiştir. Model preklinik ilaç değerlendirilmesi için bir araç olarak da yararlıdır.
Biriken hücreler farklı davranırlar 3D ekstra-hücresel matrisi içinde yetiştirilen ve aynı zamanda diğer hücreleri ile (1-5) etkileşim içinde olduğunu gösterir iken Çoğu in vitro çalışmalarda deneysel cilt biyoloji, 2-boyutlu (2D) monokültürler yapılmıştır var . Fare modelleri geniş in vivo doku morfolojilerinden incelemek için kullanılmıştır. Ancak fare ve insan deri, hücre mimarisi ve fizyolojisi, zor insanlar için fare çalışmalar yapmamızı da yapar önemli farklılıklar var. Fare deride melanosit çoğunlukla saç köklerinin lokalize olduğundan, onlar, epidermisin bazal tabaka öncelikle bulmak insanların bu farklı biyolojik özellikleri var. 3D insan derisinin son gelişme modelleri, hücre-matriks ve hücre-hücre etkileşimleri farklı hücre türleri arasındaki araştırmak için alanında sağladı yeniden. Gömülü fibroblastlar kollajen I matrisi, tabakalı, farklılaştırılmış keratinositler ve fonksiyonel bir bazal membran, dermis epidermis ayıran oluşan bir "Epidermis", bir "dermis" oluşur yeniden yapılandırır. Kollajen, iskele, besin teslimat ve hücre-hücre etkileşimi için potansiyeli sağlar. Melanositik hücreler, insan derisinde melanosit homeostazı ve melanom ilerlemesi doğal özellikleri özetlemek içeren 3D deri modelleri. In vivo olarak, yeniden inşa deride melanosit, bazal tabaka keratinositler serpiştirilmiş bazal membran lokalize . Melanom hücreleri, in vivo olarak orijinal tümör evresi (ALP, VGP ve metastatik melanom hücrelerinin) yansıtan aynı özellikleri gösterirler . Son zamanlarda, dermal kök hücreler, insan dermis (6) tespit edilmiştir. Bu çok güçlü kök hücreleri epidermisin göç ve melanosit ayırt etmek için kullanılır.
1. Üç Boyutlu İnsan Cilt Modeli Yeniden İnşa:
2. Temsilcisi Sonuçlar:
Cilt Normal melanositler ve dermal kök hücreleri ile yeniden yapılandırır
Cilt, ekleriyle birlikte özel bir 6 kuyu tepsi kültüre yeniden yapılandırır. Dermal bölmesi (Şekil 1A), ilk dört gün için% 10 FBS ile DMEM kültür. Cilt yeniden orta keratinositler melanosit veya melanom hücrelerinin (Şekil 1B) numaralı seribaşı zaman kullanılır. Epidermis 9 gün havaya maruz kalan ve bu keratinositler (Şekil 1C) ayırt etmek için izin verir. 18 gün, cildin epidermis tabakalı keratinosit katmanlardan oluşmaktadır yeniden yapılandırır. Farklılaşmamış sırayla farklılaşmış bazal tabaka ve katmanları dikey odaklı (Şekil 1D). Lekemelanositik işaretleyici S100 ile yeniden yapılandırır bölümünde ing bu melanositlerin bazal tabakası olan epidermis ve iletişim dendrit uzantıları (Şekil 1E) yoluyla birden fazla keratinositler hizalanır gösterir. Dermal bölmesi bir kollajen tip I matriks içinde gömülü fibroblastlar içerir. Tevdi kollajen IV epidermis, dermis (Şekil 1F) ayıran bazal membran gösterir. Dermal kök hücreler (GFP lentiviral vektör ile etiketlenen) fibroblastlar kollajen ben matris gömülü ettiklerinde, epidermisin göç ve melanosit (1), (Şekil 2) farklılaşırlar. Epidermisin keratinositlerin çoklu katmanlar geliştirilmiştir.
Cilt melanom tümörleri, yeniden yapılandırır
Klinikopatolojik çalışmalar göstermektedir ki melanomlar kademeli bir şekilde ilerleme: sık görülen edinsel nevus, displastik nevüs, ALP (radyal büyüme fazı) melanomlar, VGP melanomlar (dikey büyüme fazı) ve metastatik melanomlar (7). Melanom hücre hatları farklı aşamalarında 2-GE kültürü (Şekil 3A-D) birbirlerine morfolojik olarak benzer ancak cildi yeniden yapılandırır dahil olduğunda, hücrelerin davranışını in vivo özellikleri yansıtır . Konumu ve normal melanosit büyüme hızı, sıkı deri (Şekil 3E) yeniden yapılandırır kontrol edilir. VGP melanomlar WM793 dermis (Şekil 3G) invaziv büyümeye ise ALP primer melanomlar WM35, epidermis (Şekil 3F) ağırlıklı olarak çoğalırlar. Metastatik melanomlar 1205Lu agresif derin dermis (Şekil 3H) işgal etti.
Şekil 1. Cilt Normal melanositler ile yeniden yapılandırır. Cildin brüt görünümü AC gösterilir yeniden yapılandırır. A. Fibroblastlar kollajen ile karışık% 10 içeren DMEM FBS ve form dermal bölmesi yetiştirilmektedir. B. Keratinositler ve melanosit dermisin üst numaralı seribaşı ve yeniden orta deride gelişir. C. Epidermis 9 gün havaya maruz kalmaktadır. D. H & E-lekeli cilt yeniden dikey olarak oluşan Epidermis, bazal tabaka odaklı, ve sırayla farklılaşmış tabakalı hücre tabakaları sunar. Dermis kollajen tip I matris gömülü fibroblastlar içerir. E. S100-pozitif melanosit (siyah ok), bazal membran ve iletişim birden fazla keratinositler ile hizalanır. F. Kollajen IV-boyama, epidermis, dermis ayıran bazal membran, gösterir. DF tüm renklendirmeler formalin ile fikse, parafine gömülü bölümler yapıldı.
Şekil 2. Ciltte dermal kök hücreleri, epidermisin göç ve melanosit içine ayırt yeniden yapılandırır. Tohumlama keratinositler At 5 gün sonra, tek GFP pozitif hücreler (yeşil) kürelerden göç başlar . Epidermis, hala tek bir katman oluşur. 8 gün, birkaç hücre epidermis-dermis arabirimi ulaşır. 10. günde, GFP pozitif hücreler bazal membran pozisyonda sıkıca hizalanır. Göç, GFP pozitif hücreler epidermisin ifade melanositik işaretleyici HMB45 (kırmızı, beyaz oklarla gösterildiği gibi). Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Epidermis çoklu katmanlar olarak geliştirilmiştir. Bazal membran beyaz noktalı çizgiler ile gösterilir.
Şekil 3. Cilt melanomlar farklı aşamalarında yeniden yapılandırır: AD. Normal melanositler ve melanom hücrelerinin 2D kültürlerde büyüdü. A. sünnet derisi Melanositler. B. ALP WM35 hücreleri. C. VGP WM793 hücreleri. D. metastatik melanom 1205Lu hücreleri. E. Normal melanositler bazal membran bulunmaktadır. F. ALP melanom WM35 hücreler epidermiste hücre kümeleri olarak büyür. G. VGP melanom WM793 hücreler bazal membran ile dermis içine işgal etti. H. metastatik melanom 1205Lu hücreleri agresif dermis derinliklerine işgal etti.
Sorun Giderme
Sorun | Sorun Giderme |
Kollajen karışım katılaşmaya değildir | Kollajen karışımı rengi pembe saman sarı olmalıdır, aksi takdirde pH yanlış ve kollajen jel olmayabilir. Sarı rengi parlak, daha fazla sodyum bikarbonat damla damla ilave edilmelidir. |
Kollajen erken mixuture içinde çökeltileri | Tüm bileşenleri kollajen karışımı yerleştirin üzerine yerleştirilir kadar buz tutunuz |
Sözleşmeli kolajen (bir tarafı diğer tarafı daha kalın) bile değildir | Kalibre raf kuluçka |
Epidermis en az üç keratinosit katmanları ile oluşur. | Alt geçişleri farklılaşmamış keratinositler kullanın |
Biz 3D cilt üreten normal insan melanosit, deri kök hücreleri ve melanom hücreleri ile yeniden yapılandırır tarif var. Tek tabakalı kültür yetiştirilen, melanositik hücreler, benzer bir morfoloji (basık, mil veya dendritik şekilli daha) klinik evre kökenlerine bakılmaksızın sunar. Buna karşılık, 3D cilt, melanom hücrelerinin aşamalı özgü özellikleri özetlemek yeniden yapılandırır. Normal insan melanosit tek bir hücre olarak epidermal ve dermal katmanlar arasındaki bazal membran bulunur. Daha agresif VGP melanom hücrelerinin bazal membran dermis içine kırarak büyük kümeler olarak büyümeye ise ALP primer melanom hücrelerinin bazal membran boyunca küçük küme olarak büyür. Metastatik melanom hücrelerinin tüm yönlerde büyümeye ve tek hücre veya kümeler gibi dermis derinliklerine işgal. Kantitatif analizler, invazyon derinliği ve yayılması ölçüde ölçerek bu model üzerinde yapılabilir. Yanı sıra, normal ve malign melanositik hücrelerin karakterizasyonu, model kullanarak doğrudan (E-kaderin upregülasyonu yoluyla keratinositler iyi niyetli iletişim kurmak epidermisin bazal tabaka ev ve olgunlaştı melanosit dermal kök hücrelerin farklılaşma, uyarabilir 6).
Viral vektörler kullanarak, ya da etkinleştirmek veya melanosit dönüşüm mekanizmaları sadece çalışma için verimli bir model olmayı vaat ediyor dinamikleri ve her hücre türüne göre cilt genlerin fonksiyonel önemi daha iyi bir anlayış yeniden yapılandırır, gen fonksiyonu etkisiz hale değil, aynı zamanda ilerlemesini melanom (8). Hücre fenotipleri Uzun vadeli gözlem cilt bağışık yetmezliği olan hayvanların yeniden yapılandırır, aşılama ile mümkün olmuştur. Böyle bir insan-fare cilt chimera melanomagenesis ve melanom metastazı çalışma için mükemmel bir araştırma aracı.
Cilt ilaç değerlendirilmesi için yararlı bir platform da olabilir yeniden yapılandırır. 2D kültür koşullarda kanser hücrelerini yok Birçok ilaç genellikle deneysel ve klinik uygulamalarda çok az etkisi var. Görüldüğü gibi in vivo tümör, 3D kültürlerde melanom hücrelerinin mikroçevresinin melanom sinyal yolları modüle düşündüren, 2D kültürlerde hücrelere yanıt ilaçlara dirençli. Başarılı bir ilaç keşfi için, 3D cilt yeniden modeli, in vivo bileşikler (9,10) etkileri tahmin etmek için ideal bir preklinik bir araçtır.
Özetle, deri modelleri, in vitro ve in vivo çalışmalar arasında köprü yeniden . Onlar bu dönüşüme katkıda bulunan genler dönüşüm ve kök hücre nasıl yer aldığı daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.
Çıkar çatışması ilan etti.
Biz Wistar Enstitüsü Hayvan Tesisi, Mikroskopi Tesis, Histotechnology Tesis ve Araştırma Kaynağı Merkezi teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık CA 076.674 Enstitüleri, CA 098.101, 025.874 CA ve CA 10815 hibe kısmen finanse edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | |
---|---|---|---|
10x EMEM | Bio Whittaker | 12-684F | |
L-glutamin | Gibco | 25030-081 | |
Fetal sığır serumu | Hyclone | SH-30.071,02 | |
Sığır Tendon Asit-Çıkarılan Kollajen | Organogenez | 200/50 | |
Doku Kültürü ekler ile 6-iyi Tepsiler | Organogenez | 9285 | |
Keratinosit Serum Ücretsiz Orta | Gibco | 17005042 | |
Diyaliz Fötal Buzağı Serumu | Hyclone | SH-30.079,03 | |
Rekombinant İnsan Kök Hücre Faktörü | Fitzgerald Sektörler | RDI-307-255X | |
Temel FGF | Fitzgerald Sektörler | 30R-AF015 | |
Endotelin-3, insan | Amerikan Peptid A.Ş. | 88-5-10 | |
Kalsiyum Klorür | Sigma | C-7902 | |
DMEM | JRH biyoloji | 56.430-10L | |
F12 (HAM Kullanıcı) | Gibco | 11765-54 | |
Hidrokortizon | Sigma | H-0888 | |
İnsülin, transferrin, etanolamin, Selenyum (ITES) | BioWhittaker | 17839Z | |
O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P0503 | |
Adenin | Sigma | A9795 | |
Progesteron | Sigma | P-8783 | |
Triiyodotironin | Sigma | T-5516 | |
Yenidoğan buzağı serumu | Hyclone | SH3011802 | |
10% formalin tampon | Surgipath | 00600 | |
Optimal kesme sıcaklığı donma medya (OCT) | Sakura | 4583 | |
Çok kasetleri | Surgipath | 02.293-BX | |
TBS biyopsi kağıtları | Üçgen Biyomedikal Bilimleri | BP-B | |
TBS biyopsi kağıtları | Üçgen Biyomedikal Bilimleri | BP-B | |
Tek kullanımlık Base Kalıplar | Balıkçı | 15-182-501C | |
Bileşik benzoin tentürü | Profesyonel Tek, Inc. | S42450 | |
Alkol Hazırlık Swablar | CVS eczane | ||
İpek Siyah Örgülü 5-0 | Ethicon | 682G | |
Tül süngerler (steril) | CVS eczane | ||
Forseps | Roboz | RS5070 | |
İris makası | Roboz | RS5913 | |
Cerrahi bıçaklar | Tüy | 2976 | |
EZ anestezi | Euthanex Corp. | ||
SCID tüysüz outbred fare | Charles nehir |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır