Method Article
في هذا التقرير ، إلا أننا تصف البشرة ثلاثي الأبعاد إعادة بناء النموذج الذي يحاكي الجلد البشري في مجال العمارة وتكوينها. وقد تم التحقيق في فسيولوجيا الخلايا الصباغية ، تطور سرطان الجلد ومصير الخلايا الجذعية عن طريق الجلد باستخدام نموذج إعادة بناء الجلد. هذا النموذج هو مفيد أيضا كأداة لتقييم ما قبل السريرية على المخدرات.
وقد تم القيام به في معظم الدراسات المختبرية في مجال البيولوجيا التجريبية في الجلد 2 الزراعات الأحادية الأبعاد (2D) ، في حين أن الأدلة تشير إلى أن تراكم الخلايا تتصرف بشكل مختلف عندما يتم تربيتها داخل المصفوفة خارج الخلوي 3D ، وكذلك تتفاعل مع الخلايا الأخرى (1-5) . وقد تم استخدام نماذج الماوس على نطاق واسع لدراسة التشكل الأنسجة في الجسم الحي. لكن الماوس وجلد الإنسان واختلافات كبيرة في مجال العمارة والفيزيولوجيا الخلوية ، مما يجعل من الصعب استقراء دراسات الماوس إلى البشر. لأن معظمها مترجمة الخلايا الصباغية في الجلد الماوس في بصيلات الشعر ، لديهم الخصائص البيولوجية تختلف عن تلك التي للبشر ، والذي حدد في المقام الأول الطبقة القاعدية من البشرة. التطورات الأخيرة في جلد الإنسان 3D إعادة نماذج مكن هذا المجال لتحقيق مصفوفة الخلايا والخلايا خلايا التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. ويعيد تتكون من "الأدمة" مع الليفية مضمن في مصفوفة أنا الكولاجين ، وهو "البشرة" ، التي تتألف من الخلايا القرنية ، طبقية متمايزة والغشاء القاعدي وظيفية ، والذي يفصل بين البشرة من الأدمة. الكولاجين ويوفر السقالات وإيصال المواد الغذائية ، وإمكانية الخلية الى خلية التفاعل. نماذج دمج خلايا الجلد الصباغية 3D ألخص ملامح التوازن الطبيعي للخلايا الصباغية وتطور سرطان الجلد في جلد الإنسان. كما هو الحال في الجسم الحي ، والمترجمة الخلايا الصباغية في الجلد بناؤها في الغشاء القاعدي تتخللها الكيراتينية الطبقة القاعدية. خلايا سرطان الجلد يحمل نفس الخصائص التي تعكس مرحلة الورم الأصلي (RGP ، VGP وخلايا سرطان الجلد المنتشر) في الجسم الحي. مؤخرا ، تم التعرف على الخلايا الجذعية في الجلد والأدمة الإنسان (6). يمكن لهذه الخلايا الجذعية متعددة قوية الهجرة إلى البشرة وتفرق إلى الخلايا الصباغية.
1. الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي :
2. ممثل النتائج :
يعيد الجلد الطبيعي مع الخلايا الصباغية الجلدي والخلايا الجذعية
الجلد ويعيد المثقف في علبة 6 - جيدا خاصة مع إدراج. هو مثقف المقصورة الجلدي في DMEM FBS مع 10 ٪ خلال الأيام الأربعة الأولى (الشكل 1A). الجلد هو إعادة بناء المتوسطة كنت عند المصنف الكيراتينية مع الخلايا الصباغية أو خلايا سرطان الجلد (الشكل 1B). تتعرض البشرة في الهواء في يوم 9 ، وهذا يسمح للتمييز بين الخلايا القرنية (الشكل 1C). في يوم 18 ، ويعيد بناء البشرة من الجلد وتتكون من طبقات خلية كيراتينية الطبقية. الطبقة القاعدية غير متمايزة ومتباينة الطبقات بالتسلسل موجهة عموديا (شكل 1D). وصمةجي يعيد المقطع من علامة مع S100 الصباغية يبين أن يتم محاذاة الخلايا الصباغية في الطبقة القاعدية من البشرة والتواصل مع الخلايا القرنية متعددة من خلال التمديدات تغصن (الشكل 1E). مقصورة جلدي يحتوي على الخلايا الليفية مضمن في مصفوفة من النوع الأول الكولاجين. أودعت الكولاجين الرابع يدل على الغشاء القاعدي ، الذي يفصل بين البشرة من الأدمة (الشكل 1F). عندما يتم تضمين الخلايا الجذعية عن طريق الجلد (المسمى مع GFP lentiviral ناقلات) مع الليفية في الكولاجين أنا المصفوفة ، تهاجر إلى البشرة وتفرق في الخلايا الصباغية (1) ، (الشكل 2). وضعت عدة طبقات من الخلايا القرنية في البشرة.
الجلد القتامي يعيد للأورام
دراسات تشير إلى أن المدارسة السريرية الميلانينية التقدم بطريقة متدرجة : وحمات المشتركة المكتسبة ، وحمات خلل التنسج ، RGP (شعاعي مرحلة النمو) الميلانينية ، VGP (مرحلة النمو الرأسي) الميلانينية والنقيلي الميلانومات (7). مراحل مختلفة من خطوط الخلايا القتامي تشبه شكليا لبعضها البعض في 2 مد الثقافة (الشكل 3A - D) ولكن عندما يتم إدراجها في الجلد يعيد ، وسلوك الخلايا يعكس الخصائص في الجسم الحي. تخضع لرقابة مشددة من الموقع ومعدل نمو الخلايا الصباغية في الجلد الطبيعي يعيد (الشكل 3E). RGP الأولية الميلانينية WM35 تنتشر في الغالب في البشرة (الشكل 3F) ، في حين تنمو VGP الميلانينية WM793 جراحية في الأدمة (الشكل 3G). النقيلي الميلانينية 1205Lu غزو بقوة في عمق الأدمة (الشكل 3H).
الشكل 1. يعيد الجلد مع الخلايا الصباغية الطبيعية. مظهر الجسيمة ليعيد الجلد هو مبين في ميلان. تزرع الخلايا الليفية ألف مختلطة مع الكولاجين في DMEM تحتوي على 10 ٪ وشكل FBS مقصورة الجلدية. هي المصنفة الكيراتينية وباء الخلايا الصباغية في أعلى الأدمة في الجلد وتنمو إعادة المتوسط. تتعرض البشرة وجيم في الهواء في يوم 9. D. H & E - الجلد الملون إعادة يعرض البشرة تتكون عموديا ، الطبقة القاعدية المنحى ، وطبقات متمايزة بالتسلسل الخلية الطبقية. تحتوي الأدمة الليفية مضمن في مصفوفة من النوع الأول الكولاجين. يتم محاذاة E. S100 إيجابية الخلايا الصباغية (الأسهم السوداء) على الغشاء القاعدي والتواصل مع الخلايا القرنية متعددة. F. الكولاجين IV - تلطيخ يدل على الغشاء القاعدي ، الذي يفصل بين البشرة من الأدمة. أجريت في كل stainings مدافع ثابت عن الفورمالين المقاطع جزءا لا يتجزأ من البارافين.
الشكل 2. الخلايا الجذعية في الجلد الجلد يعيد الهجرة إلى تفرق في البشرة والخلايا الصباغية. وفي يوم 5 بعد الكيراتينية البذر ، وخلايا GFP ايجابي واحد (الأخضر) يبدأ ترحيل الخروج من المجالات. وتتألف تزال البشرة من طبقة واحدة. في يوم 8 من بضع خلايا في الوصول إلى واجهة البشرة ، الأدمة. بعد يوم 10 ، يتم محاذاة بإحكام GFP إيجابية الخلايا في الطابق السفلي موقف الغشاء. وGFP إيجابية ترحيل الخلايا في البشرة علامة الصباغية أعرب HMB45 (أحمر ، كما يتبين من السهام البيضاء). هي ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). يتم تطوير البشرة وطبقات متعددة. يشار إلى الغشاء القاعدي مع خطوط بيضاء منقطة.
الشكل 3. يعيد الجلد من مراحل مختلفة من الميلانومات : م. الخلايا الصباغية الطبيعية وخلايا سرطان الجلد المزروع في الثقافات 2D. الخلايا الصباغية من ألف القلفة. باء RGP WM35 الخلايا. جيم VGP WM793 الخلايا. دال خلايا سرطان الجلد 1205Lu الإنتقالية. تقع الخلايا الصباغية E. عادي في الغشاء القاعدي. F. RGP القتامي WM35 الخلايا تنمو كتل الخلايا في البشرة. G. VGP خلايا سرطان الجلد WM793 غزو في الأدمة من خلال الغشاء القاعدي. H. النقيلي خلايا سرطان الجلد 1205Lu غزو بقوة في عمق الأدمة.
المشاكل
مشكلة | المشاكل |
مزيج الكولاجين لا يصلب | لون مزيج الكولاجين وينبغي القش الأصفر إلى الوردي ، ودرجة الحموضة وإلا خاطئ والكولاجين قد لا هلام. إذا كان لون أصفر مشرق ، يجب إضافة مزيد من بيكربونات الصوديوم قطرة قطرة. |
الكولاجين يترسب قبل الأوان في mixuture | إبقاء جميع المكونات على الجليد حتى يوضع الخليط على إدراج مادة الكولاجين |
الكولاجين هو التعاقد ولا حتى (واحد هو الجانب سمكا من الجانب الآخر) | معايرة الجرف من الحاضنة |
يتم تشكيل البشرة مع أقل من ثلاث طبقات خلية كيراتينية. | استخدام الخلايا القرنية غير متمايزة في الممرات السفلى |
وقد وصفت لنا توليد 3D يعيد الجلد الصباغية مع الإنسان العادي ، والخلايا الجذعية خلايا الجلد وسرطان الجلد. عندما نمت في الثقافة أحادي الطبقة ، والخلايا الصباغية تقديم التشكل مماثلة (سويت بالارض والمغزل أو أكثر على شكل شجيري) بغض النظر عن أصلهم من المرحلة السريرية. في المقابل ، يعيد الجلد 3D ألخص مرحلة معينة من خصائص خلايا سرطان الجلد. الصباغية الإنسان العادي يقيم في الطابق السفلي الأغشية بين البشرة وطبقات الجلد والخلايا واحدة. خلايا سرطان الجلد RGP الابتدائية تنمو في شكل مجموعات صغيرة على طول الغشاء القاعدي في حين أن خلايا سرطان الجلد أكثر عدوانية VGP تنمو كتل كبيرة اختراق الغشاء القاعدي في الأدمة. تنمو خلايا سرطان الجلد المنتشر في كل الاتجاهات وغزو عميقا في الأدمة كخلايا مفردة أو مجموعات. يمكن إجراء التحليلات الكمية على هذا النموذج من خلال قياس عمق غزو ومدى الانتشار. بالإضافة إلى توصيف الخلايا الصباغية العادية والخبيثة ، وذلك باستخدام نموذج يمكن أن تحفز مباشرة تمايز الخلايا الجذعية إلى الخلايا الصباغية الجلدي نضجت ، والتي تضم الطبقة القاعدية من البشرة وإقامة الاتصالات مع حسن النية من خلال القرنية upregulation من E - كادهيرين ( 6).
باستخدام ناقلات فيروسية ، ونحن قادرون على تفعيل أو تعطيل وظيفة الجين لفهم أفضل للديناميات وأهميتها الوظيفية من الجينات التي أعرب عنها كل نوع من الخلايا في الجلد يعيد ، والتي تبشر بأن تكون نموذجا فعالا لدراسة آليات التحول ليس فقط من الخلايا الصباغية ، ولكن أيضا تطور سرطان الجلد (8). أصبح على المدى الطويل مراقبة الظواهر الخلية ممكن من خلال ترقيع الجلد يعيد العوز المناعي للحيوانات. مثل هذا الإنسان جلد الفأر الوهم هو أداة ممتازة لدراسة البحوث melanomagenesis والانبثاث سرطان الجلد.
يعيد الجلد يمكن أيضا أن تكون منبرا مفيدا لتقييم المخدرات. العديد من الأدوية التي قضاء على الخلايا السرطانية في ظروف ثقافة 2D غالبا ما يكون تأثير يذكر في مجال التطبيقات التجريبية والسريرية. كما رأينا في الورم في الجسم الحي ، وخلايا سرطان الجلد في الثقافات 3D غالبا ما تكون مقاومة للعقاقير التي الخلايا في الاستجابة للثقافات 2D ، مما يوحي بأن المكروية ينظم مسارات إشارات في سرطان الجلد. لاكتشاف المخدرات ناجحة ، والجلد 3D إعادة بناء النموذج هو أداة مثالية قبل السريرية على التنبؤ بآثار المركبات في فيفو (9،10).
باختصار ، إعادة بناء نماذج الجلد جسر الفجوة بين في التجارب المختبرية والدراسات المجراة. سوف يؤدي إلى فهم أفضل لجينات التي تشارك في عملية التحول ، وكيف الخلايا الجذعية تسهم في هذا التحول.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
نشكر الحيوان معهد ويستار مرفق ، ومرفق المجهري ، ومرفق Histotechnology ومركز الأبحاث التموين. وقد تم تمويل هذه الدراسة في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة CA 076674 ، CA 098101 ، 025874 و CA CA 10815.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
---|---|---|---|
10X EMEM | الحيوي ويتاكر | 12 - 684F | |
L - الجلوتامين | Gibco | 25030-081 | |
المصل البقري الجنين | Hyclone | SH - 30071.02 | |
وتر البقري حمض الكولاجين المستخرجة | Organogenesis | 200/50 | |
الثقافة الأنسجة 6 صواني جيدا مع إدراجات | Organogenesis | 9285 | |
خلية كيراتينية متوسطة المصل الحرة | Gibco | 17005042 | |
مدال مصل العجل الجنين | Hyclone | SH - 30079.03 | |
المؤتلف الخلايا الجذعية البشرية عامل | فيتزجيرالد صناعات | RDI - 307 - 255X | |
جمعية جيل المستقبل الأساسية | فيتزجيرالد صناعات | 30R - AF015 | |
Endothelin - 3 ، الإنسان | شركة أمريكية الببتيد | 88-5-10 | |
كلوريد الكالسيوم | سيغما | C - 7902 | |
DMEM | JRH العلوم البيولوجية | 56430 - 10L | |
F12 (HAM ل) | Gibco | 11765-54 | |
هيدروكورتيزون | سيغما | H - 0888 | |
الأنسولين ، ترانسفيرين ، الإيثانول ، السيلينيوم (خائبي) | BioWhittaker | 17839Z | |
O - Phosphorylethanolamine | سيغما | P0503 | |
الأدينين | سيغما | A9795 | |
البروجسترون | سيغما | P - 8783 | |
ثلاثي يودوثيرونين | سيغما | T - 5516 | |
العجل الوليد المصل | Hyclone | SH3011802 | |
10 ٪ العازلة الفورمالين | Surgipath | 00600 | |
وسائل الإعلام الأمثل تجميد خفض درجة الحرارة (أكتوبر) | ساكورا | 4583 | |
أشرطة متعددة | Surgipath | 02293 - BX | |
TBS خزعة ورقات | مثلث العلوم الطبية الحيوية | BP - B | |
TBS خزعة ورقات | مثلث العلوم الطبية الحيوية | BP - B | |
قوالب قاعدة المتاح | الصياد | 15-182 - 501C | |
مركب صبغة الجاوي | المستهلكات المهنية ، المؤتمر الوطني العراقي ، | S42450 | |
مسحات الكحول الإعدادية | CVS الصيدلة | ||
الحرير الأسود مزين 5-0 | Ethicon | 682G | |
الإسفنج شاش (العقيمة) | CVS الصيدلة | ||
ملقط | Roboz | RS5070 | |
مقص القزحية | Roboz | RS5913 | |
شفرات جراحية | ريشة | 2976 | |
EZ التخدير | Euthanex كورب | ||
SCID الماوس outbred أصلع | نهر تشارلز |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved