Трехмерная реконструкция человеческой кожи Модель: инструмент для изучения нормальной кожи и меланомы Прогрессия

В этом докладе мы описываем трехмерных кожи реконструировать модель, которая имитирует человеческую кожу в области архитектуры и композиции. Меланоцитов физиологии, меланома прогрессии и судьба кожные стволовые клетки были исследованы с помощью кожи реконструировать модель. Модель также полезны в качестве инструмента для доклинической оценки наркотиков.

Большинство лабораторные исследования в экспериментальной биологии кожи были выполнены в 2-мерных (2D) монокультур, в то время накапливать данные свидетельствуют о том, что клетки ведут себя иначе, когда они выросли в 3D внеклеточного матрикса, а также взаимодействовать с другими клетками (1-5) . Мышь модели были широко использованы для изучения морфогенеза ткани в естественных условиях. Однако мыши и коже человека имеют существенные различия в клеточной архитектуры и физиологии, что делает ее трудно экстраполировать мыши исследований для человека. С меланоцитов в коже мышей в основном локализована в волосяные фолликулы, они имеют различные биологические свойства от тех людей, которые найти в первую очередь на базального слоя эпидермиса. Недавнее развитие 3D человеческой кожи реконструировать модели позволило поле для исследования клеточной матрице и межклеточных взаимодействий между различными типами клеток. Реконструирует состоят из "дерма" с фибробластами встроенные в коллагеновой матрице я, "эпидермис", которая состоит из слоистой, дифференцированных кератиноцитов и функциональных базальной мембраны, которая отделяет эпидермис от дермы. Коллаген обеспечивает строительные леса, доставку питательных веществ, и потенциал для клетки к ячейке взаимодействия. 3D-моделей кожи включения меланоцитарных клетки резюмировать природные особенности меланоцитов гомеостаза и меланомы прогрессии в человеческой коже. Как и в естественных условиях, в реконструированных меланоцитов кожи локализованы на базальной мембраны с вкраплениями базальных кератиноцитов слоя. Меланома клетки обладают теми же характеристик, отражающих оригинальные стадии опухоли (РГП, VGP и метастатических клеток меланомы) в естественных условиях. Недавно, кожные стволовые клетки были идентифицированы в дерме человека (6). Эти несколько мощных стволовые клетки могут мигрировать в эпидермисе и дифференцироваться в меланоциты.

1. Трехмерная реконструкция человеческой кожи Модель:

1. Подготовка бесклеточной слой: Смешайте следующие реагенты в 50 мл пробирку на льду: 0,59 мл 10X EMEM, 50 мкл 200 мМ L-глутамина, 0,6 мл ФБС, 120 мкл 7,5% бикарбоната натрия и 4,6 мл бычьего коллагена I. Добавьте 1 мл смесь в каждой вставки лотков тканевой культуры. Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре и позволяют закрепить гелем. Цвет смеси должно быть от соломенно-желтого до розового.
2. Trypsinize фибробластов человека от культуры колбы с 0,25% трипсин / ЭДТА, добавить DMEM, содержащей 10% FBS, чтобы нейтрализовать. Сбор клетки центрифугированием и ресуспендируют 0,45 х 10 ^{6 клеток} в 1,5 мл DMEM с 10% FBS. Для кожных стволовых клеток, собирают 6600 кожные сферах (когда кожные стволовые клетки растут в среду стволовые клетки, они образуют сферах в подобной манере к нейросферы), нажав колбу отделить сферы, центрифугирования.
3. Подготовка клеточного слоя: Смешайте следующие в 50 мл пробирку на льду: 1,65 мл 10X EMEM, 150 мкл 200 мМ L-глутамина, 1,85 мл ФБС, 350 мкл 7,5% бикарбоната натрия, 14 мл бычьего коллагена I и 1,5 мл суспензии фибробластов , начиная с шага 2 (альтернативно можно использовать сочетание 0,45 х 10 ⁶ фибробластов и 6600 кожного сферы в 1,5 мл кожи реконструировать среду я для кожных стволовых клеток восстанавливает), хорошо перемешать. Добавьте 3 мл смеси на каждом слое бесклеточной покрытием вставки. Инкубируйте в течение 45 мин при 37 ° С в 5% CO ₂ культуре ткани инкубатора. Цвет смеси должно быть от соломенно-желтого до розового. После гель затвердевает, добавьте DMEM, содержащей 10% FBS (2 внутри мл и 10 мл за пределами вставить в каждую лунку кожи реконструировать лотки). Инкубируйте в течение 4 дней и убедитесь, что гель контрактов.
4. Аспирируйте среду как внутри, так и за ее пределами каждой вставки. Добавить промыванием (HBSS с 1% диализу ФБС) 2 мл на внутреннюю и 10 мл за пределы вставки для того, чтобы смыть регулярные сыворотки. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
5. Подготовка кожи реконструировать среду:
   1. Для нормальных меланоцитов и кожных стволовых клеток восстанавливает: Чтобы сделать основной среде (500 мл), смешать следующие реагенты: 490 мл кератиноцитов бессывороточной среде, 1,8 мл бычьего гипофизарный экстракт, 10 мл диализовали эмбриональной телячьей сыворотки, 500 мкл 10 мкг / SCF мл, 562,5 мкл 4 мкг / мл bFGF и 500 мкл 264 мкг / мл ET-3. Средний I: добавить 10 мкл ЭФР 100 мкг / мл до 100 мл основной среды. Средний II: Добавьте 2 мкл ЭФР до 100 мл основной среды. Средний III: Добавить 720 мкл CaCl ₂ 1 М до 300 мл основной среды.
   2. Для меланомы кожи реконструировать: Для того, чтобы средний I (100 мл), смешать следующие реагенты: 72,5 мл DMEM, 24 мл F12 (ХАМ), 2 мл L-глютамина 200 мм, 200 мкл гидрокортизон из 269 г / мл, 200 мкл ITES из 500X, 200 мкл О-phosphorylethanolamine 0,05 М, 200 мкл аденин 90 мм, 200 мкл Прогестерон 2 нм, 240 мкл CaCl ₂ на 1 м, 200 мкл Трийодтиронин 10-нм и 100 мкл chelexed новорожденных телячьей сыворотки (растворяют 3 г Chelex 100 в 100 мл сыворотки, размешать 1,5 часа при температуре 4 ° С, фильтр стерилизуют). Для того, чтобы средний II (100 мл), смешать следующие реагенты: 72,5 мл DMEM, 24 мл F12 (ХАМ), 2 мл L-глютамина 200 мм, 200 мкл гидрокортизон из 269 г / мл, 200 мкл ITES из 500X, 200 мкл О-phosphorylethanolamine 0,05 М, 200 мкл аденин 90 мм, 200 мкл Прогестерон 2 нм, 240 мкл CaCl2 1 М, 200 мкл Трийодтиронин 10-нм и 100 мкл новорожденных телячьей сыворотки. Для того, чтобы средний III (300 мл), смешать следующие реагенты: 142,5 мл DMEM, 142,5 мл F12 (ХАМ), 6 мл L-глютамина 200 мм, 600 мкл гидрокортизон из 269 г / мл, 600 мкл ITES из 500X , 600 мкл О-phosphorylethanolamine 0,05 М, 600 мкл аденин 90 мм, 600 мкл Прогестерон 2 нм, 720 мкл CaCl ₂ 1 М, 600 мкл Трийодтиронин 10 нМ и 6 мл новорожденных телячьей сыворотки.
6. Trypsinize кератиноцитов человека от культуры колбы с 0,05% трипсин / ЭДТА, нейтрализации трипсина с соевого ингибитора трипсина (250 мг / л в 1x фосфатным буферным солевым раствором), спин вниз, ресуспендируют осадок клеток в 4,17 x10 ⁶ клеток / мл в кожу реконструировать среду I.
7. Trypsinize человека меланоцитов или клетки меланомы от культуры колбы с 0,05% трипсин / ЭДТА, нейтрализации трипсина с соевым ингибитором трипсина фасоль, спин вниз, ресуспендируют осадок клеток в 0,83 x10 ⁶ клеток / мл в кожу реконструировать среду I.
8. Удалить промыванием как изнутри, так и за ее пределами каждой вставки.
9. Добавить кожи реконструировать среду я (1,5 мл на внутреннюю и 10 мл за пределы каждой вставки).
10. Возьмите 600 мкл суспензии клеток кератиноцитов и 600 мкл суспензии клеток меланоцитов или клетки меланомы, хорошо перемешать. Внесите 200 мкл смешанного капля суспензии клеток за каплей, чтобы внутри каждой вставки. Для кожных стволовых клеток восстанавливать, используйте 100 мкл кератиноцитов приостановления деятельности только. Инкубируйте в течение 2 дней при температуре 37 ° C.
11. Аспирируйте кожи реконструировать среду яс обеих внутри и за пределами каждой вставки. Добавить кожи реконструировать среду II (2 мл на внутреннюю и 10 мл на улице). Инкубируйте в течение еще 2 дней при температуре 37 ° C.
12. Аспирируйте кожи реконструировать среду II изнутри и снаружи каждой вставки, добавить 7,5 мл кожи реконструировать среду III только снаружи. С этой точки, поверхность реконструирует начинается подвергаясь воздуха. Изменение среды III через день до 18 дня.
13. Урожай кожи реконструировать на 18 день:
    1. Аспирируйте СМИ изнутри и снаружи вставками.
    2. Удалить вставками из лотка щипцами.
    3. Вырежьте реконструировать (в том числе поликарбоната фильтр), прослеживая круг близко к краю с лезвие скальпеля.
    4. Вырезать реконструировать и фильтр в половине на твердую поверхность.
14. Для парафиновых срезов: место половине реконструировать в гистологии кассеты между 2 черных TBS работ биопсии и впитать все кассеты в 10% формалине в течение более 4 часов. Затем положите кассету в 70% этанола и хранить его при температуре 4 ° С, пока вы готовы к процессу реконструкции для парафина вложение.
15. Для замороженных срезах:
    1. Место другую половину реконструкции в 50% сахарозы, при температуре 4 ° С в течение 1-2 часов, затем изменить сахарозы до 2M и хранить его при температуре 4 ° C в течение еще 1-2 часа.
    2. Внесите оптимального раскроя температура замерзания СМИ (октябрь) в одноразовые формы базу так, чтобы она заполняет около 50% от лодки. Избегайте пузырьков в октябре
    3. Захватите край реконструировать щипцами и удалить реконструировать из сахарозы. Поставьте его на Kimwipes до Kimwipes поглощать сахарозу.
    4. Передача реконструировать в базу плесени на вершине октября, с помощью щипцов и шпателем. Обложка начало реконструкции с более октября, пока база пресс-формы полностью. Убедитесь, что вы не имеют никаких пузырьков в октябре, которые сделают резки трудно.
    5. Место базы плесень равномерно на измельченного сухого льда, и позволяют октября о замораживании полностью.
    6. Оберните базы плесень в фольгу и хранить его при температуре -70 ° С, пока вы готовы резать криостата.
16. Graft кожи реконструировать на мыши:
    1. Подготовка 50 мл сокола трубку с 5 мл DMEM (для замораживания и размораживания кожи мыши).
    2. Используйте женский голый SCID беспородных мышей около 6 недель.
    3. Мышь анестезией с изофлуран (EZ системы анестезии): начальная анестезия выполняется в индукции камера с 4% изофлуран (до мышь перемещается в хирургическом постели) и поддержания анестезии через головная часть передышку во время процедуры (изофлуран: 1,5-2% ). Тепло поддержки подогревом площадку, чтобы предотвратить переохлаждение и стерильной глазной смазки используются для профилактики глазных травм во время анестезии.
    4. Положить 600 мл воды в стакан и оставить на вершине горячей плите, чтобы вода температурой от 40 до - 60 ° C.
    5. Очистите кожу мыши соединение настой бензоина и мазки алкоголя преп.
    6. Марк линии на верхней части спины мыши сохранить те же позиции для наложения швов позже.
    7. Вырезать круглой кроватью рану около 1,2 см в диаметре, на верхней части спины мыши использованием Ирис ножницами и щипцами. Обложка рану стерильную постель с губки марлю. Положите круглые кожи мыши в 5 мл DMEM, затем оставить в жидком азоте контейнер, пока он полностью заморожены. Размораживания труба в горячую воду на вершине горячей плите, пока полностью разморозится. Повторить 3 раза.
    8. Отсоедините кожи реконструировать с помощью хирургического transwell лезвием и удалить мембраны очень тщательно, передача коже восстановить (эпидермис стороной вверх) на вершине раны кровати.
    9. Наведите кожи (эпидермис стороной вверх) на поверхности кожи реконструировать.
    10. Сделайте первый шов на маркер ранее помечены, второй на дно, затем еще два швы по бокам, чтобы исправить мыши кожи.
    11. Чистая кожа мыши после трансплантации. Удалить головная часть и держать мышь на площадку нагревается до проснулся и амбулаторно.
    12. Положите мышь в новую клетку.
    13. Сообщение оперативного обезболивания: Мелоксикам (1 мг / кг) в виде подкожных инъекций сразу после операции, 24 часов и 48 часов после операции.

2. Представитель Результаты:

Кожа восстанавливает с нормальным меланоцитов и кожных стволовых клеток
Кожа восстанавливает культивируют в специальных 6-и поднос с вставками. Кожные отсек культивировали в DMEM с 10% FBS в течение первых четырех дней (рис. 1А). Кожи реконструировать среду я используется, когда кератиноциты высевают с меланоцитов или клетки меланомы (рис. 1В). Эпидермис подвергается воздействию воздуха на 9-й день, и это позволяет дифференцировать кератиноцитов (рис. 1в). На 18 день, эпидермис кожи восстанавливает состоит из слоистой кератиноцитов слоев. Недифференцированные базального слоя и последовательно дифференцированные слои вертикально ориентированных (рис. 1D). ПятноING разделе реконструирует с меланоцитарных маркер S100 показывает, что меланоциты выравниваются в базального слоя эпидермиса и общаться с несколькими кератиноцитов через дендрит расширений (рис. 1E). Кожные фибробласты отделение содержит встроенные в коллагена типа I матрицы. Депонированные коллагена IV указывает на базальной мембране, которая отделяет эпидермис от дермы (рис. 1е). При кожных стволовых клеток (помечены GFP лентивирусов вектор) с встроенной фибробластов в коллагена I матрицы, они мигрируют в эпидермис и дифференцируются в меланоциты (1), (рис. 2). Несколько слоев кератиноцитов в эпидермисе развиваются.

Кожа восстанавливает меланомы опухолей
КЛИНИКО исследования показывают, что прогресс в меланом поэтапно: совместно нажитое невусы, диспластические невусы, РГП (радиальная фаза роста) меланомы, VGP (вертикальной фазы роста) и метастатической меланомы меланомы (7). Различные стадии линии клеток меланомы морфологически похожи друг на друга в 2-D культуре (рис. 3-D), но когда они включены в коже реконструирует, поведение клеток отражает их в естественных характеристик. Местоположения и скорости роста нормальных меланоцитов строго контролируются в кожу восстанавливает (рис. 3Е). РГП первичной меланомы WM35 размножаются преимущественно в эпидермис (рис. 3F), тогда как VGP меланомы WM793 расти invasively в дерму (рис. 3G). Метастатический меланомы 1205Lu агрессивно вторгаться вглубь дермы (рис. 3H).

Рисунок 1. Кожа восстанавливает с нормальным меланоцитов. Валовой внешний вид кожи восстанавливает показан в переменного тока. А. Фибробласты смешанные с коллагеном выращивают в среде DMEM, содержащей 10% FBS и формы кожного отделения. Б. кератиноциты и меланоциты высевают в верхней части дермы и растут в коже реконструировать среду. С. эпидермис подвергается воздействию воздуха днем ​​9. Д. H & E-окрашенных кожи реконструировать представляет эпидермиса состоит вертикально, ориентированных базального слоя, и последовательно дифференцированные стратифицированных слоев клеток. Дерма содержит фибробласты встроенные в коллагена типа I матрицы. Е. S100-положительных меланоцитов (черные стрелки) выравниваются по базальной мембраны и общаться с несколькими кератиноцитов. Ф. коллагена IV-окрашивания указывает на базальной мембране, которая отделяет эпидермис от дермы. Все окрашивания в DF проводились на формалин-фиксированных, парафин разделов.

Рисунок 2. Кожные стволовых клеток в коже реконструирует мигрируют в эпидермис и дифференцируются в меланоциты. На 5-й день после посева кератиноцитов, одного GFP-положительных клеток (зеленые) начинают мигрировать из сфер. Эпидермис до сих пор состоит из одного слоя. На 8-й день достигать нескольких клеток эпидермиса, дермы интерфейс. Днем 10, GFP-положительных клеток тесно выровнены по позиции базальной мембраны. Мигрировали GFP-положительных клеток в эпидермисе выразить меланоцитарных маркер HMB45 (красный, о чем свидетельствуют белые стрелки). Ядра окрашивали DAPI (синий). Эпидермис развивается как несколько слоев. Базальной мембраны обозначается белыми пунктирными линиями.

Рисунок 3. Кожа восстанавливает различных стадиях меланомы: AD. Нормальная меланоцитов и клеток меланомы, выращенные в 2D культур. А. Меланоциты от крайней плоти. Б. РГП WM35 клеток. С. VGP WM793 клеток. Д. метастатических клеток меланомы 1205Lu. Е. Нормальная меланоциты расположены на базальной мембране. Ф. РГП меланомы WM35 клетки растут как сотовые кластеры в эпидермисе. Г. VGP меланомы WM793 клетки вторгнуться в дерму через базальную мембрану. H. метастатической меланомы 1205Lu клетки агрессивно вторгаться вглубь дермы.

Поиск неисправностей

Мы описали генерации 3D кожа восстанавливает с нормальными человеческими меланоцитов, кожных стволовых клеток и клеток меланомы. При выращивании в монослой культуры, меланоцитарных клетки, присутствующие аналогичных морфологии (плоские, шпиндель или более дендритных-образная), независимо от их происхождения клинической стадии. В отличие от 3D кожа восстанавливает резюмировать этапе специфические свойства клеток меланомы. Нормальные человеческие меланоциты находятся на базальной мембраны между эпидермиса и кожные слои, как отдельные клетки. РГП первичных клеток меланомы растут как малых кластеров вдоль базальной мембраны, тогда как более агрессивные клетки меланомы VGP расти, как большие кластеры прорыва базальную мембрану в дерму. Метастатических клеток меланомы растут во всех направлениях и вторгнуться вглубь дермы, как отдельных клеток или групп. Количественный анализ может быть выполнен на этой модели при измерении глубины инвазии и степени распространения. В дополнение к характеристике нормальных и злокачественных меланоцитарных клетки, используя модель мы можем непосредственно вызывать кожные дифференциации стволовых клеток в созрел меланоциты, которые дома базального слоя эпидермиса и установление добросовестных связи с кератиноцитов через регуляция E-кадгерина ( 6).

Использование вирусных векторов, мы можем либо активировать или инактивировать ген функции для лучшего понимания динамики и функционального значения генов, каждый тип клеток в коже реконструирует, который обещает быть эффективной моделью для изучения не только механизмы трансформации меланоцитов , но и прогрессирования меланомы (8). Долгосрочное наблюдение клеточных фенотипов стало возможным благодаря пересадке кожи реконструирует для иммунодефицитных животных. Такой коже человека-мыши химера является отличным инструментом исследований для изучения melanomagenesis и меланомы метастазы.

Кожа восстанавливает также может быть полезной платформой для наркотиков оценки. Многие препараты, которые искоренение раковых клеток в 2D условиях культуры часто имеют небольшой эффект в экспериментальных и клинических приложений. Как видно в естественных условиях опухоль, клетки меланомы в 3D культур часто резистентным к лекарственным препаратам, какие ячейки в 2D культур реагировать на, предполагая, что микроокружение модулирует сигнальных путей в меланомы. Для успешного открытия наркотиков, 3D кожи реконструировать модель является идеальным инструментом для доклинического прогнозирования влияния соединений в естественных условиях (9,10).

Таким образом, кожа реконструировать модели преодоления разрыва между в пробирке и в естественных исследованиях. Они приведут к лучшему пониманию, какие гены участвуют в трансформации и, как стволовые клетки способствуют этой трансформации.

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы благодарим животных Института Вистар фонда, микроскопия фонда, Histotechnology фонда и исследовательский центр питания. Это исследование было частично финансируется за счет грантов от Национального института здоровья CA 076674, Калифорния 098101, 025874 и CA CA 10815.