Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Çevre bacterioplankton bir model ile çözünmüş organik karbon (DOC) bileşik ve bir DNA etiketleme reaktif bromodeoxyuridine (BrdU) inkübe edilir. Daha sonra floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak kendi yükseltilmiş BrdU dahil dayalı toplu topluluk, DOC-aşağılayıcı hücreleri ayrılır. Bu hücreler daha sonra sonraki moleküler analizleri ile tespit edilir.

Mikroplar sucul ortamlarda pek çok çözünmüş organik karbon (DOC) yüzeylerde bozulması aracılık önemli ajanlardır. Ancak, doğada DOC özel havuzları dönüştürmek bakteri taksonların belirlenmesi teknik bir sorun teşkil etmektedir.

Burada bir yaklaşım tarif çiftler bromodeoxyuridine (BrdU) dahil, floresan aktif hücre sıralama (FACS) ve 16S rRNA gen tabanlı sucul ortamlarda aşağılayıcı belirli bir DOC bileşik yetenekli bacterioplankton kültür-bağımsız bir kimlik sağlar moleküler analizler. Üç kat bacterioplankton microcosms BrdU ve bir model DOC bileşik (DOC değişiklikler), ya da sadece BrdU (no ek kontrol) almak için ayarlanır. Yeni sentezlenmiş bakteriyel DNA ve BrdU-işaretli DNA timidin BrdU yerine pozisyonları kolayca immunodetected ^1,2 olabilir. Katma DOC bileşik seçici aktive olması beklenen ve bu nedenle hiçbir BrdU esas DOC değişiklikler ve hücre dışı duyarlı hücreler daha yüksek seviyelerde (HI hücreleri) vardır kullanabilmek 24 saat inkübasyon, bacterioplankton sayesinde Ayrıca kontroller (düşük BrdU dahil hücreleri LI hücreleri). Floresan İmmuno sonra, HI hücreleri ayırt edilirler ve fiziksel floresan aktive hücre sıralama (FACS) ³ LI hücreleri ayrılır. Sıralama DOC-duyarlı hücreleri (HI hücreleri) DNA ayıklanır ve taksonomik rRNA gen-temelli analiz PCR, klon kütüphane yapım ve sıralama da dahil olmak üzere sonraki 16S ile tanımlanır.

1. Su örneği işleme

1. Filtre 1 mikron gözenek boyutlu membran filtreler aracılığıyla 10L çevre su büyük parçacıklar ve bacteriovores kaldırın. Bir damacana su süzüntü toplayın.
2. Transferi 3 4 ml taze hazırlanmış paraformaldehid çözüm (% 10 PFA) içeren steril Eppendorf tüpleri (50 ml) içine 36 ml süzüntü her. Hücreleri korumak için 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Vakum filtrasyon ile 0.22 mikron-gözenek boyutlu beyaz membran filtreler üzerine hücreleri toplayın. Vakum filtrasyonu filtre üzerinden geçen 10 ml salin (PBS) ve fosfat tamponlu filtre yıkayın. Negatif kontrol olarak filtreleri Etiket ve -20 ° C'de saklayın

Adımlar 1,3-1,4 DOC sınırlı koşullar oluşturulması için isteğe bağlıdır.

3. (5 mcM NH ₄ Cl, 5 mcM NaNO _3, ve 1 mikrona NaH ₂ PO ₄ final konsantrasyon) damacana inorganik azot ve fosfor karışımı ekleyin.
4. Zaman zaman ajitasyon ile 48 saat boyunca yerinde sıcaklığında karanlıkta inkübe edin.

2. Microcosm kurulması ve inkübasyon

1. Her altı 1-L cam şişe, microcosms kurmak için adım 1.4 damacana 800 ml su numunesi ile doldurun. Her mikrokozmosu BrdU (10 mcM, nihai konsantrasyonu) ekleyin. İyice karıştırın.
2. Microcosms üç gruba 1 ml modeli DOC bileşik çözüm, bu DOC değişiklikler olarak görev yapacak. Kalan üç microcosms içine 1 ml steril PBS, bu ek kontrol olarak hizmet verecek.
3. Bir kuluçka çalkalayıcı microcosms inkübe ve 100 rpm'de sallayarak sırasında in situ sıcaklığında karanlıkta inkübe edin .
4. Her mikrokozmosu ve transfer süresi 0 puan, 8, 16, ve 24 saat için 50 ml steril Eppendorf tüpleri içine 36 ml su numunesi toplayın. Hemen taze PFA toplama tüpleri 4 ml (% 10) ve hücreleri korumak için 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
5. 0.22-mikron gözenek boyut polikarbonat membran filtreler aracılığıyla Filtre hücreleri korunmuş. Filtreleri 10 ml PBS ile yıkayın. Hemen bir sonraki adıma geçin veya -20 ° C'de filtreleri saklamak

3 BrdU Ortaklığı yerinde İmmuno

1. Oda sıcaklığında filtreler (DOC değiştirilmiştir numuneleri, herhangi bir ek kontrol ve negatif kontrol) Çözülme.
2. 1 ml lizozim çözümü uygulayın [10 mg / ml lizozim yumurta beyazı 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] filtre bakteri hücreleri kapsayacak şekilde ^4. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Emme altında 10 ml PBS üzerinden geçerek filtre yıkayın.
3. 1 ml proteinaz K çözüm [2 mg / ml proteinaz K 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] filtre bakteri hücreleri kapsayacak şekilde ^4. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Emme altında 10 ml PBS üzerinden geçerek filtre yıkayın.
4. 1 ml eksonükleaz çözüm [eksonükleaz III (50 U / ml) 5 mM MgCl ₂ ve 50 mM Tris-HCl] ⁵ filtre bakteri hücreleri kapsayacak şekilde ekleyin. 37 ° C'de 30 dakika. Emme altında 10 ml PBS üzerinden geçerek filtre yıkayın.
5. Üreticinin talimatlarına göre çerçeve mühür inkübasyon odaları (Bio-Rad) birleştirin.
6. Alkol-kuru temizleme yüzey steril bir bıçak kullanarak sekizde içine filtre dilimleyin.
7. Forseps kullanarak, bir monte çerçeve mühür inkübasyon odası (sekiz çerçeve mühür odaları, her filtre örnek için gerekli olan) bir filtre sekizinci bölümüne yerleştirin. Hücreleri içeren filtre bölümü tarafında yukarıya doğru bakmalıdır. Filtrenin arka kısmında nem filtresi sopa slayt sağlayacaktır. Filtre kuru olursa, slayttaki filtre bölümüne yerleştirmeden önce, odanın merkezinde _dih 2 O küçük bir damla (2 ul) geçerlidir .

Adımlar 3,8-3,20 üreticinin talimatlarına modifiye prosedürler izlenerek, Situ Hücre Çoğalması Kit ROCHE reaktifler FLUOS kullanabilirsiniz. PBS için hariç, tüm reaktifler kit içinde sağlanır.

8. Mühür uygulandıktan sonra taşma neden olmaksızın eşit kuluçka odasının tüm filtre bölümünde karşılamak için yeterli inkübasyon tampon (% 0.5 sığır serum albümin, PBS içinde% 0.1 Tween20,) uygulayın.
9. Kuluçka odasının çerçeve üzerinde polyester çerçeve kapak yerleştirin. Kuluçka odasının mühür için sıkıca bastırın. Filtre üzerindeki hava kabarcıkları kaçının. Kapalı odaları karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
10. Polyester mühür çıkarın ve inkübasyon odaları açmak. (Not: odaları açılması bazen slayt çerçeve mühür yukarı çekin Bu durumda, aşağıdaki adımları için yeni bir oda hazırlamak.)
11. Odanın bir köşesinde, kuluçka tampon dışarı pipetleyin. Filtresi ile temasından kaçının.
12. Hafifçe 100 ul PBS pipetleme filtreyi yıkayın ve3 kez odasından dışarı.
13. Kullanımdan hemen önce, üretici tarafından önerilen adımları izleyerek anti-BrdU-FLUOS çalışma çözeltisi hazırlayın.
14. Pipetleyin 120 ul anti-BrdU-FLUOS, filtre üzerine çözüm eşit olarak tüm yüzeyini kaplayan özen gösterin.
15. Odasına yeni bir polyester kapağını kapatın. Filtrenin üstünde hava kabarcıkları kaçının. 37 karanlık oda ° C'de 3 saat. Bu adım, floresein izotiyosiyanat (FITC) ile in situ BrdU dahil DNA etiket.
16. Polyester kapağını çıkarın ve kuluçka odasının açık. Anti-BrdU-FLUOS çözüm pipetleyin. PBS ile filtre 3 kere yıkayın.
17. Kuluçka odasının steril bir yüzey için filtre aktarın. Steril bir bıçak kullanarak filtre bölümüne küçük parçalar halinde dilimleyin.
18. 2 ml mikrosantrifüj tüpler, 1 ml PBS içeren her filtre parçaları aktarın. Sıkıca parafilm ve mühür ile tüp kap. 37 ° ° C'de ve 10 dakika için 200 rpm.
19. 5 dakika maksimum hızda vortexer ve girdap üzerine tüpleri sabitleyin. 15 ml steril Eppendorf tüp içine pipetleyin süpernatantı. 5 kez daha inkübasyon ve vorteks adımları tekrarlayın. Her numune için aynı 15 ml Eppendorf tüp süpernatant birleştirin. Tipik olarak,% 80 hücre süspansiyonu telafi edilebilir.
20. Süpernatant Mağaza yeniden süspanse hücreleri ile 4 ° C 2 gün içinde sıralayın.

4. FACS analizi

BD FACSAria akış sitometresinin ve ilgili yazılım için bir prosedür burada tanımlanmıştır.

1. Üretici tarafından önerilen akış sitometresi aşağıdaki adımları ayarı optimize edin. Bu ısrar ediyor: gerekli kopmasına parametreleri ve tatlı nokta ayarlamak için amplifikasyon kontrolü ayarlayarak; deneme kılıf basınç için lazer gecikme ve alan ölçekleme faktörleri optimize edilmesi ve FSC ve SSC gerilimler, FSC eşik, FSC floresan ölçekleme, floresan kompansasyonunu ayarlarını optimize , vb.
2. FITC ve yan dağılım (SSC) floresan yoğunluğuna göre akış sitometresi (FCM) negatif kontrol örnekleri çalıştırın. FITC eşik negatif kontroller hiçbir hücre FITC SSC satın ekran görüntülenebilmekte kadar artırın.
3. Herhangi bir ek kontrol numunelerinin çalışılabilmesi ve FITC ve SSC satın alma dayalı 10.000 hücrelerinin dağılımı desen inceleyin. Tüm hücrelerin içine ve "düşük yoğunluklu hücreleri" (Lis) olarak belirlemek için bir kapı tanımlayın.
4. DOC-tadil örnekleri çalıştırın ve FITC ve SSC dayalı 10.000 hücrelerinin dağılım paterni incelemek. Bazı hücreler, önceden belirlenmiş LI kapısında belirir. Lis daha yüksek floresan (HIS) hücrelerin içine başka bir kapı tanımlayın. Kapılı hücrelerin göreceli bolluk görüntülemek istatistiklerini edinin.
5. "Arındırır 1 damla" modunda 500 ul PBS içeren toplama tüpleri içine sırala HI hücreleri. Onun sayısı 500.000 sayar ulaştığında sıralama sonlandırın.

5. Filtre PCR 16S rRNA genleri

Filtre PCR işlemleri Kirchman ark değiştirilmiş ⁶

1. Filtre beyaz üzerine sıralanmış hücreleri, 0.22 mikron gözenek boyutu, 25 mm çap, polikarbonat membran filtreden. Steril bir bıçak kullanarak herhangi bir bakteri hücreleri içeren filtre kenarından kesin. Filtre 8 eşit büyüklükte parçalar halinde dilimleyin.
2. Hücreleri tüp içe bakan, bir PCR reaksiyonu tüp içine tek bir filtre parçası yerleştirin. PCR reaksiyonu tüpe 45 ul PCR sınıf su ekleyin. Tamamen su filtre Submerge.
3. 2 ROCHE versiyonu gösterime PuReTaq okuyun-To-Go, PCR reaksiyonu tüpe PCR Boncuk kısaca vorteks ekleyin. PCR reaksiyon tüpleri her birine 2 ul 27F ve 1492R ⁷ olarak ileri ve geri 16S rRNA gen primerleri (0.4 mcM her astar için son konsantrasyon), her ekleyin.
4. (Isteğe bağlı) adsorbe amplifikasyon inhibitörlerinin yardımcı olmak için PCR reaksiyon karışımının 1μl sığır serum albumin solüsyonu (BSA, nihai konsantrasyonu 30μg/100 ul) ekleyin. BSA eklemek seçerse, bunun yerine su 1μl eklemek.
5. Termal cycler PCR gerçekleştirin. PCR programı aşağı bir dokunuş tavsiye edilir, hangi sırayla 62 ve 52 azalan tavlama sıcaklığına sahiptir ° C 1 ° C 11 52 tavlama sıcaklığı 15 döngüleri takip döngüleri, ° C için çevrim başına Tüm döngüleri, denatüre (95 ° C), (62 52 ° C) tavlama ve uzatma (72 ° C'de) 50'li süresi adımlarla içerir. Bir ilk 3 dakika denatürasyon ve son 10 dakikalık uzatma adım PCR programı da dahil.
6. Etidyum bromür lekeli% 1 agaroz jel elektroforezi ile PCR onaylayın. Vergi PCR jel amplikonlarının ve QIAGEN QIAquick jel ekstraksiyon kiti temiz.
7. Her numune için iki ek PCR gerçekleştirin, her zaman yeni bir filtre bölümünü kullanabilirsiniz. PCR jel purificati sonraüzerinde, birlikte aynı örnek amplikonlarının havuzu. Saf 16S rDNA amplikonlarının klon kütüphane yapım ve sıralama olarak taksonomik tanımlama, izin veren bir dizi moleküler analizler için hazır.

6. Temsilcisi sonuçları:

Temsilcisi sonuçlar bir örnek olarak putrescine aşağılayıcı bakteri bir çalışma ile açıklanmıştır. Gürcistan sahil kesiminde yer alan su örnekleri alınan ve yukarıda açıklanan prosedürleri takip işlendi. FACS analizi putrescine Ayrıca yüksek BrdU birleşme oranı (Şekil 1) gösteren, yüksek FITC floresan bir grup bakteri gelişimi neden olduğu saptandı. Bu hücreler yüksek BrdU dahil hücreleri (HIS) olarak belirlenmiş ve çoğunlukla putrescine-aşağılayıcı bakteri içermesi bekleniyor. Onun sadece düşük düzeyde BrdU dahil (LIS) ile hücreler içeren herhangi ek kontroller, eksikti. Lis esas eklendi putrescine kullanmak için koyamadık bacterioplankton içeren bekleniyor. Onun ayrı tüpler içine sıralanır ve sonra membran filtreleri üzerine toplandı. 16S rRNA gen amplikonlarının filtre PCR kullanarak yüksek HI hücreler için elde edilmiştir.

Şekil 1. ek kontrolü ve inkübasyon 24 saat sonra toplanan, (Burada bir örnek olarak putrescine) model bileşik-tadil örnek Akış sitometrik analizi . Hücre dağılımı analizi (1) olumlu BrdU dahil düzeyi ile ilgili FITC etiketleme (x-ekseni), floresan dayalı, ve (2) yan dağılım (SSC, y-ekseni), olumlu bir hücre ile ilgili olduğu boyutu. Kapısı gösterimde BrdU dahil, (LI, düşük BrdU-birleşme HI yüksek BrdU dahil) düzeyi dayanmaktadır. HI ve LI hücrelerin göreli yüzdesi ilgili kapıları gösterilmiştir.

Bizim yaklaşımımız çiftler BrdU bir FACS ve 16S rDNA analiz sucul ortamlarda bireysel DOC bileşenleri metabolize bacterioplankton tür düzeyinde kimlik izin vermek. BrdU dahil tahlil bakteri hücrelerinin metabolik faaliyetleri, sadece aktif bakteri analizi sağlar ve böylece uyuyan hücreleri içermez dayalı etiketler. Bizim yaklaşımımız, BrdU dahil, sonradan görselleştirildiği BrdU esas farklı düzeylerde immunodetected yerinde ve bakteri FACS kullanarak gruplandırılmış ve sıralanmış. BrdU dahil hücrelerin analizi, aynı zamanda moleküler analizlerin ^2,8,9 tarafından takip BrdU-işaretli DNA manyetik boncuk immunocapture kullanarak rapor edilmiştir. İkinci yöntem bir sınırlama farklı aktivite düzeyleri hücreleri ayırt edememesi durumudur. Bu durumda, analiz, sadece biraz daha etkin kalır (Şekil 1, LIS) ve su numuneleri yerli DOC kullanarak hücrelerin yer alacak.

Birleştiğinde yaklaşım dimetilkükürtproponat (DMSP), vanillate, kıyı deniz suyu glisin betain ³ DOC bileşikleri düşmeye bakterilerin taksonomik yapıları tanımlamak için kullanılır olmuştur. Uygulama geniş sucul ortamlarda, diğer tek veya karışık çözünmüş substratları kullanan bakterilerin taksonomisi çalışma çıkarım olabilir. 16S rRNA genleri yanı sıra, fonksiyonel gen göstergeleri de benzer şekilde analiz edilebilir. Sıralanmış hücreleri üzerinde moleküler analizi, tipik olarak daha az 1 milyon hücre sıralanmış hücreleri, küçük bolluğu nedeniyle zordur. Bu nedenle, DNA şablon amplifikasyon genellikle ileri moleküler analizi için gereklidir. Hücre miktarı sınırlı olmasına rağmen, toplum yapısının yeterli çözünürlük elde edilir. Araştırmalar, topluluk parmak 2.000 hücreleri (~ 1 ul deniz suyu) gibi düşük terminal RFLP (T-RFLP) tarafından büyük ^{ölçüde 2x10} 9 10 kıyı deniz suyu hücreleri (~ 1 L deniz suyu) elde edilen benzemektedir oluşturulan baskılar göstermiştir. PCR ile tek gen amplifikasyon ek olarak, sıralanmış hücreler metagenomic analiz dayalı genomik olmayan bir-PCR amplifikasyon tekniği, yani birden fazla deplasman amplifikasyon, MDA ¹¹ ile mümkündür.

Kritik adımlar

Doğa, aşırı miktarda microcosms ve uzun süreli inkübasyon kaçınılmalıdır dış DOC bileşiklerin yanı sıra yakın koşullarda korumak için. İlk deneyler, yüksek model DOC bileşikler nispeten kısa bir süre (<72 saat), HI hücrelerinin gelişimini ikna etmek için gerekli en düşük miktarlarını belirlemek için tavsiye edilir. Uzun inkübasyon süreleri microcosms şişe etkisi gelişme endişe doğurabilir. Ön kuluçka inorganik N ve P ile isteğe bağlıdır, ancak microcosms değiştirilmiştir DOC HI hücrelerinin gelişimi için gerekli olan inkübasyon süresi süresini kısaltmaya yardımcı olabilir.

BrdU floresan İmmuno önce hücre fiksasyonu için koşullar önem taşımaktadır. Yetersiz fiksasyon (lizozim ve proteinaz K tedaviler) hücre duvarı permeabilization adımları sırasında hücre kaybına neden olacaktır. Diğer taraftan, aşırı korunmuş hücrelerin filtre-PCR için DNA şablonu lyse ve serbest bırakmak için çok katı olma eğilimindedir. Koruyucu, koruyucu madde konsantrasyonu ve muhafaza süresi uzunluğu seçimi çalışılan bakteri topluluğu için optimize edilmelidir. Bu protokol listelenen Koruma usulleri, alfa-ve gama-alt ^bölümleri 10 proteobakteride tarafından büyük ölçüde hakim olduğu bir kıyı deniz bacterioplankton toplum için optimize edilmiştir .

BrdU İmmuno Çoklu adımları membran filtreler yapılmaktadır. Dikkat filtreler kurutma üzerinden önlemek için alınmalıdır. Susuz hücrelerin aşırı kuru filtreler, filtre membranlar güçlü eklemek ve, sonra, daha sonra FACS analiz için tekrar süspansiyon zor olacaktır. BrdU İmmuno öncesi ve sonrası bakteri hücre sayımı, bakteri hücrelerinin kurtarma oranını belirlemek için her zaman ölçülmelidir.

Filtresi-PCR ⁶ yaparken, PCR hacmi tamamen daldırın filtre parça için yeterli olmalıdır. Genel olarak optimize edilmiş bir hot-start ve touch-down PCR programı iyi bir gen amplifikasyonu üretmek için yardımcı olacaktır. Ayrıca PCR optimizasyonu ^+, BSA ve diğer malzemelerle bir PCR optimizasyonu kiti (Epicentre FailSafe PCR Sistemi) kullanarak veya Mg ² konsantrasyonları manipüle yapılabilir.

Yöntem sınırlama

Bu birleştiğinde bir yaklaşım, potansiyel olarak belirli bir substrat düşürebilir ve kültür-bağımsız detaylı taksonomik seviyelere bu fonksiyonel hücreleri tespit bakterilerin toplama sağlar. Ancak, bazı noktalar ac dikkate alınmalıdırsayımı sonuçları yorumlama. Bu yaklaşım, özel bileşikler, genellikle cam şişeler olmayan tracer düzeyde doğal bacterioplankton inkübasyon başlatır. Fonksiyonel topluluğu olarak tanımlanan hücreler yerinde koşulları altında verilen bileşik (ler) süreci bu farklı olabilir. BrdU dahil saptanamayan bazı bakteriler ^1,2 olarak tespit edilmiştir. Bu bakteriler, bu nedenle bu yöntem kullanılarak erişilemez. Doğrudan bileşik bozulması karışmış ancak bileşik (ler) yıkım ürünleri değildir Bakteriler gerçek degraders ayırt edilemeyen sahte olumlu sinyaller verebilir.

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu projenin finansmanı Ulusal Bilim Vakfı hibe OCE1029607 (XM) ve MCB0702125 (MAM) ve Gordon ve Betty Moore Vakfı (MAM) tarafından sağlandı.