Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton

Bacterioplancton ambientales se incuban con un modelo del carbono orgánico disuelto (COD) y un reactivo compuesto de ADN de etiquetado, bromodesoxiuridina (BrdU). Después, DOC-degradantes células se separan de la comunidad a granel en base a su elevada incorporación de BrdU utilizando fluorescencia clasificación de células activadas (FACS). Estas células son identificadas por los posteriores análisis molecular.

Los microbios son los principales agentes de mediación de la degradación de muchos de carbono orgánico disuelto (COD) sustratos en los ambientes acuáticos. Sin embargo, la identificación de los taxones de bacterias que transforman las piscinas específicas de DOC en la naturaleza supone un reto técnico.

A continuación se describe un enfoque que las parejas bromodesoxiuridina (BrdU) incorporación, la fluorescencia de células activadas clasificación (FACS), y 16S ARNr de análisis basados ​​en genes molecular que permite que la cultura independiente de la identificación de bacterioplancton capaces de degradar un compuesto DOC específicas en los ambientes acuáticos. Microcosmos por triplicado bacterioplancton están preparados para recibir tanto BrdU y un compuesto modelo DOC (DOC modificaciones), o sólo BrdU (sin adición de control). Sustitutos de BrdU las posiciones de la timidina en el ADN de nueva síntesis bacteriana y BrdU marcado de ADN puede ser fácilmente immunodetected ^1,2. A través de una de 24 horas de incubación, bacterioplancton que son capaces de utilizar el compuesto añadido DOC se espera que se activan selectivamente, y por lo tanto, tienen mayores niveles de incorporación de BrdU (células HI) que no responde a las células en las enmiendas DOC y las células no- Además de los controles (bajo recuento de incorporación de BrdU, las células LI). Después de inmunodetección de fluorescencia, las células se distinguen HI y separadas físicamente de las células LI por clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) ^3. Ordenado DOC-respuesta (células HI) se extraen de ADN y taxonómicamente identificados a través de 16S rRNA gen posterior análisis basados ​​en PCR como, la construcción de la biblioteca y la secuencia de clon.

1. Procesamiento de las muestras de agua

1. Filtro de 10 litros de agua del medio ambiente a través de un filtro de membrana micras de tamaño de poro para eliminar las partículas grandes y bacteriovores. Recoger el filtrado de agua en una garrafa.
2. Transferencia de 36 ml de filtrado a cada uno en tres tubos estériles Eppendorf (50 ml) contiene 4 ml solución preparada recientemente paraformaldehído (PFA, el 10%). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente para preservar las células. Recoger las células en 0,22 micras de tamaño de poro de filtros de membrana blanco por filtración al vacío. Lave el filtro de paso de 10 ml de buffer fosfato salino (PBS) a través del filtro por filtración al vacío. Etiqueta de los filtros como controles negativos y almacenarlos a -20 ° C.

Pasos 1.3-1.4 son opcionales para el establecimiento de DOC-limitada condiciones.

3. Añadir una mezcla de nitrógeno y fósforo inorgánico (5 mM NH ₄ Cl, 5 M NaNO _3, y 1μM NaH ₂ PO ₄ concentración final) en la bombona.
4. Incubar en la oscuridad a la temperatura in situ durante 48 horas con agitación ocasional.

2. Microcosmos y el establecimiento de incubación

1. Llene cada uno de los seis frascos de vidrio de 1 L con 800 ml de muestra de agua de la bombona de paso de 1,4 a establecer microcosmos. Añadir BrdU (10 mM, concentración final) en cada microcosmos. Mezclar bien.
2. Agregar un modelo DOC ml solución compuesta en tres de los microcosmos, estos servirán como enmiendas DOC. Añadir 1 ml de PBS estéril en los tres restantes microcosmos, estos servirán como controles sin adición.
3. Incubar todos los microcosmos en un agitador incubadora y se incuban en la oscuridad a la temperatura in situ mientras se agita a 100 rpm.
4. Recoger 36 ml de muestra de agua de cada microcosmos y la transferencia en tubos de 50 ml estériles Eppendorf en los puntos de tiempo de 0, 8, 16 y 24 horas. Inmediatamente añadir 4 ml de agua dulce PFA (10%) de los tubos de recolección y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente para preservar las células.
5. Filtro conservan las células a través de 0,22 micras de tamaño de poro de filtros de membrana de policarbonato. Lavar los filtros con 10 ml de PBS. Proceder de inmediato a la etapa siguiente o almacenar los filtros a -20 ° C.

3. En la inmunodetección situ para la incorporación de BrdU

1. Descongele los filtros (DOC modificado muestras, los controles no-además de controles positivos y negativos) a temperatura ambiente.
2. Aplicar 1 ml de solución de lisozima [10 mg / ml de lisozima de clara de huevo en 100 mM Tris, 50 mM EDTA (pH = 8)] ⁴ para cubrir las células bacterianas en el filtro. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave el filtro pasando 10 ml de PBS a través de ella, bajo succión.
3. Añadir 1 ml de solución de proteinasa K [2 mg / ml de proteinasa K en 100 mM Tris, 50 mM EDTA (pH = 8)] ⁴ para cubrir las células bacterianas en el filtro. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave el filtro pasando 10 ml de PBS a través de ella, bajo succión.
4. Añadir una solución de exonucleasa ml [exonucleasa III (50 U / ml) en 5 mM _de MgCl2 y 50 mM Tris-HCl] ⁵ para cubrir las células bacterianas en el filtro. Se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. Lave el filtro pasando 10 ml de PBS a través de ella, bajo succión.
5. Montar el sello marco cámaras de incubación (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
6. Cortar el filtro en octavos con una cuchilla estéril sobre un alcohol limpiar la superficie seca.
7. Con unas pinzas, coloque una sección octava de un filtro en una cámara montada incubación marco de sellado (sello ocho marco cámaras se necesitan para cada muestra de filtro). El lado de la sección de filtro que contiene las células deben estar hacia arriba. La humedad en la parte posterior del filtro permite filtrar el palo a la diapositiva. Si el filtro se vuelve seca, aplicar una pequeña gota (2 l) del DIH ₂ O en el centro de la cámara antes de colocar la sección de filtro en la diapositiva.

Pasos 3.8-3.20 usar los reactivos del kit de Roche en la proliferación celular in situ, siguiendo los procedimientos Fluos modificado a partir de las instrucciones del fabricante. A excepción de PBS, todos los reactivos se proporcionan en el kit.

8. Aplicar tampón de incubación suficiente (0,5% albúmina de suero bovino, 0,1% de Tween 20 en PBS), para cubrir uniformemente toda la sección de filtro en la cámara de incubación sin causar desbordamiento de una vez que el sello se aplica.
9. Coloque una cubierta de poliéster marco sobre el marco de la cámara de incubación. Presione hacia abajo para sellar herméticamente la cámara de incubación. Evite las burbujas de aire sobre el filtro. Se incuban las cámaras selladas durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
10. Retire el sello de poliéster y abrir las cámaras de incubación. (Nota: la apertura de las cámaras a veces se tire hacia arriba el sello marco de la diapositiva En ese caso, prepare una nueva cámara para los siguientes pasos..)
11. Pipeta el tampón de incubación de una esquina de la cámara. Evite el contacto con el filtro.
12. Lave el filtro con cuidado pipeteando 100 l de PBS yfuera de la cámara de 3 veces.
13. Prepare anti-BrdU-Fluos solución de trabajo siguiendo los pasos recomendados por el fabricante inmediatamente antes del uso.
14. Pipetear 120 l anti-BrdU-Fluos solución de trabajo en el filtro, teniendo cuidado de cubrir uniformemente toda la superficie.
15. Cerrar de nuevo la cámara con una cubierta de poliéster nuevo. Evite las burbujas de aire en la parte superior del filtro. Incubar la cámara en la oscuridad a 37 ° C durante 3 horas. Este paso se etiqueta BrdU incorporado ADN in situ con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
16. Quite la cubierta de poliéster y abrir la cámara de incubación. Pipeta la solución anti-BrdU-Fluos de trabajo. Lave el filtro 3 veces con PBS.
17. Transferir el filtro de la cámara de incubación a una superficie estéril. Cortar la sección de filtro en pequeños trozos con una cuchilla estéril.
18. Transferencia de las piezas de filtro en dos tubos de microcentrífuga ml, conteniendo cada uno 1 ml de PBS. Bien tapar el tubo y sellar con parafilm. Se incuba a 37 ° C y 200 rpm durante 10 minutos.
19. Asegurar los tubos en un vórtice y agitar a la velocidad máxima durante 5 minutos. Pipeta el sobrenadante a un tubo estéril de 15 ml Eppendorf. Repita los pasos de incubación y vortex durante 5 veces más. Combine el sobrenadante en el mismo tubo de 15 ml Eppendorf para cada muestra. Por lo general, el 80% de las células se pueden recuperar en la suspensión.
20. Guardar el sobrenadante con las células se resuspendieron a 4 ° C. Ordenar dentro de 2 días.

4. FACS análisis

Un procedimiento de un citómetro de flujo BD FACSAria y el software correspondiente que se describe aquí.

1. Optimizar el ajuste de los siguientes pasos del citómetro de flujo recomendado por el fabricante. Esto implica: ajustar el control de la amplificación para establecer los parámetros necesarios breakoff y el punto dulce, optimizar el retardo de láser y los factores de escala para la zona de presión de funda experimentar y optimizar la configuración de FSC y SSC tensión, el umbral de FSC, FSC escala de fluorescencia, fluorescencia voltajes PMT , etc
2. Ejecutar las muestras de control negativo en el citómetro de flujo (FCM) en base a la intensidad de fluorescencia de dispersión FITC y lateral (SSC). Aumentar el umbral de FITC hasta que no las células en los controles negativos se pueden visualizar por la pantalla de adquisición de FITC-SSC.
3. Además de ejecutar sin las muestras de control y examinar el patrón de distribución de 10.000 células sobre la base de FITC y la adquisición de cooperación Sur-Sur. Definir una puerta para incluir todas las células y designarlos como "células de baja intensidad" (LI).
4. Ejecutar DOC-modificado muestras y examinar el patrón de distribución de 10.000 células sobre la base de FITC y cooperación Sur-Sur. Algunas células se publicará en el preset puerta LI. Definir otra puerta para encerrar las células que tienen una mayor intensidad de fluorescencia (HIS) de Lis. Adquirir las estadísticas para ver la abundancia relativa de células cerradas.
5. Ordenar HI células en tubos de colección que contiene 500 l de PBS a "purificar una gota" de modo. Terminar la clasificación, cuando el número de su cuenta llega a 500.000.

5. Filtro de amplificación por PCR de los genes ARNr 16S

Filtro de procedimientos de PCR se han modificado desde Kirchman et al ^6.

1. Filtro de células seleccionadas en un fondo blanco, 0,22 m de tamaño de poro, 25 mm de diámetro, filtro de membrana de policarbonato. Recorte el borde del filtro que no contiene células bacterianas usando una cuchilla estéril. Cortar el filtro en 8 trozos de igual tamaño.
2. Lugar de una sola pieza de filtro en un tubo de reacción de PCR, con las células hacia adentro del tubo. Añadir 45 l de agua grado PCR en el tubo de reacción de PCR. Sumergir el filtro en su totalidad en el agua.
3. Añadir 2 ROCHE ilustración PuReTaq Lea-To-Go bolas de PCR en el tubo de reacción de PCR, agitar brevemente. Añadir 2 l cada uno de los de avance y retroceso gen 16S rRNA primers (0,4 mM concentración final de cada cebador), tales como 27F y 1492R ^7, en cada uno de los tubos de reacción de PCR.
4. (Opcional) Agregue 1μl solución de albúmina sérica bovina (BSA, la concentración final es 30μg/100 l) a la mezcla de reacción de PCR para ayudar a absorber los inhibidores de la amplificación. Si se opta por no añadir BSA, añadir 1μl de agua en su lugar.
5. Realizar la amplificación por PCR en un termociclador. Un toque por programa de PCR se recomienda, que tiene la temperatura de hibridación secuencial disminuye 62 a 52 ° C por 1 ° C por ciclo durante 11 ciclos, seguido de 15 ciclos con temperatura de anillamiento de 52 ° C. Todos los ciclos incluyen desnaturalización (95 ° C), hibridación (a los 62 a 52 ° C), y la extensión (a 72 ° C) los pasos de la duración de los años 50. Una inicial de 3 min de desnaturalización y final de 10 min de extensión paso también se incluye en el programa de PCR.
6. Confirmar la amplificación de PCR por electroforesis en un teñido con bromuro de etidio 1% en gel de agarosa. Los impuestos especiales los amplicones de PCR en el gel y la limpieza con el kit de QIAGEN QIAquick extracción de gel.
7. Realizar dos ampliaciones adicionales de PCR para cada muestra, cada vez que utiliza una sección de filtro. Después de PCR en gel Purificatide, la piscina amplificados de la misma muestra en conjunto. Purificada 16S ADNr amplificados ya están listos para una serie de análisis moleculares que permiten la identificación taxonómica, como la construcción de la biblioteca y la secuencia de clon.

6. Los resultados representativos:

Los resultados representativos se describen mediante un estudio de putrescina-bacterias degradantes como un ejemplo. Tomaron muestras de agua de una zona costera de Georgia y procesadas siguiendo los procedimientos descritos anteriormente. FACS análisis reveló que además de putrescina provocados por el desarrollo de un grupo de bacterias con alta intensidad de fluorescencia FITC, lo que indica la alta tasa de incorporación de BrdU (Figura 1). Estas células fueron designados como las células de alta BrdU incorporación (HIS) y se esperaba que contienen en su mayoría putrescina-degradantes bacterias. Su faltaban en los controles además de no-, que sólo contenía células con bajos niveles de incorporación de BrdU (LI). LI se esperaba que contienen principalmente bacterioplancton que no podían utilizar la putrescina añadió. Su fueron ordenados en tubos separados y recogidos en los filtros de membrana. 16S rRNA amplificados del gen se obtuvieron de células de alta HI con filtro de PCR.

Figura 1. Análisis de citometría de flujo sin adición de control y modelo compuesto modificado (putrescina como un ejemplo aquí) las muestras tomadas después de 24 h de incubación. Análisis de las células de distribución se basa en (1) la intensidad de fluorescencia de etiquetado FITC (eje x), que se relaciona positivamente con el nivel de incorporación de BrdU, y (2) dispersión lateral (SSC, eje y), que está positivamente relacionado con la célula tamaño. Puerta de la notación se basa en el nivel de incorporación de BrdU, (HI, de alta BrdU incorporación, LI, bajo BrdU incorporación). El porcentaje relativo de HI y las células LI se muestran en la puerta correspondiente.

Nuestras parejas enfoque BrdU incorporación, FACS y análisis de 16S ADNr para permitir que las especies a nivel de identificación de bacterioplancton que metabolizan los componentes individuales de DOC en los ambientes acuáticos. El ensayo de incorporación de BrdU etiquetas de las células bacterianas sobre la base de las actividades metabólicas, lo que permite el análisis sólo en las bacterias activas y por lo tanto no incluye a las células inactivas. En nuestro enfoque, la incorporación de BrdU se encuentra en bacterias in situ immunodetected y que tienen diferentes niveles de incorporación de BrdU son posteriormente visualizadas, agrupados y ordenados mediante FACS. El análisis de células BrdU incorporado también se ha reportado el uso de cuentas magnéticas inmunocaptura de BrdU marcado de ADN seguido por análisis molecular ^2,8,9. Una de las limitaciones de la metodología de este último es su incapacidad para distinguir las células de los diferentes niveles de actividad. En ese caso, el análisis se incluyen las células que permanecen muy poco activa mediante el uso de DOC indígenas en las muestras de agua (Figura 1, LI).

El enfoque de acoplamiento se ha utilizado para identificar las estructuras taxonómica de bacterias que son capaces de degradar compuestos DOC como dimethylsulfoniopropionate (DMSP), vanillate, la glicina betaína en agua de mar costera ^3. Su aplicación puede ser ampliamente extrapolarse a estudiar la taxonomía de las bacterias que utilizan otros sustratos disueltos solo o mezclado en los ambientes acuáticos. Además de los genes 16S rRNA, marcadores funcionales del gen también puede ser igualmente analizados. El análisis molecular de las células ordenados es un reto debido a la abundancia de pequeñas células seleccionadas, que suele ser inferior a 1 millón de células. Por lo tanto, la amplificación de ADN de la plantilla que normalmente se requiere para el análisis molecular mayor. Aunque limitados en la cantidad de células, una resolución suficiente de la estructura de la comunidad se obtiene normalmente. Los estudios han demostrado que los dedos de la comunidad las impresiones generadas por el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminales (T-RFLP) desde un mínimo de 2.000 células (~ 1 l de agua de mar), en gran medida similares a los generados a partir de 2x10 ⁹ células (~ 1 mar L) en agua de mar costera ^10. Además de la amplificación de un solo gen mediante PCR, análisis de metagenómica de células seleccionadas es posible a través de un no-PCR basada en la amplificación genómica, es decir, la amplificación de desplazamiento múltiple, MDA ^11.

Los pasos críticos

Para mantener las condiciones de contacto con la naturaleza, además de cantidades excesivas de compuestos externos DOC para microcosmos y la incubación prolongada debe ser evitada. Los experimentos preliminares son muy recomendables para determinar las cantidades más bajas de compuestos modelo DOC que son necesarios para inducir el desarrollo de las células de HI en un tiempo relativamente corto (<72 horas). Ya los tiempos de incubación puede aumentar el interés del desarrollo de la botella-efecto en el microcosmos. Pre-incubación con N y P inorgánico es opcional, pero puede ayudar a acortar la duración del tiempo de incubación que se requiere para el desarrollo de las células de HI en el Departamento de Comercio modificado microcosmos.

Condiciones para la fijación de células BrdU antes de inmunodetección de fluorescencia son de importancia crítica. Una fijación insuficiente causará la pérdida de las células durante la permeabilización de la pared celular pasos (lisozima y proteinasa K tratamientos). Por otro lado, las células en estado de conservación tienden a ser demasiado rígido para la lisis y la liberación de ADN molde para la amplificación del filtro-PCR. Selección de los conservadores, la concentración de conservantes y la longitud de tiempo de conservación deben ser optimizados para la comunidad bacteriana estudiada. Procedimientos de conservación que figuran en este protocolo ha sido optimizado para una comunidad marina bacterioplancton costera que está ampliamente dominado por Proteobacteria en el alfa y gamma-subdivisiones ^10.

Varios pasos de inmunodetección BrdU se llevan a cabo en los filtros de membrana. Se debe tener precaución para evitar la sequedad excesiva de los filtros. Células deshidratadas en el exceso de secado filtros pueden tener una gran unen a las membranas de filtro y luego será difícil volver a suspender para el análisis de FACS después. Los recuentos de células de las bacterias antes y después de inmunodetección BrdU debe ser siempre medidos para determinar la tasa de recuperación de las células bacterianas.

Al realizar filtro-PCR ^6, el volumen de reactivos PCR debería ser suficiente para sumergir la pieza del filtro del todo. Un programa optimizado PCR hot-start y abajo al tacto en general ayudan a producir la amplificación del gen bueno. Más la optimización de PCR se puede realizar mediante el uso de un kit de PCR de optimización (como el Sistema de EPICENTRO FailSafe de PCR) o la manipulación de las concentraciones de Mg ^{2 +} ingredientes, BSA y otras.

Método de la limitación

Este enfoque permite, junto colección de bacterias que potencialmente puede degradar un sustrato específico y la cultura de forma independiente puede identificar estas células funcionales a niveles taxonómicos detallados. Sin embargo, varias consideraciones deben ser tenido en cuentacuenta a la hora de interpretar los resultados. El enfoque se inicia mediante la incubación de bacterioplancton naturales con compuestos específicos, por lo general en los niveles no trazadores en botellas de vidrio. Las células identificadas como conjuntos funcionales pueden diferir de los que el proceso de compuesto dado (s) en condiciones in situ. Incorporación de BrdU se ha encontrado para ser indetectable para los ^{1,2 y} bacterias. Estas bacterias, por lo tanto, no son accesibles con este método. Las bacterias que no están directamente involucrados en la degradación del compuesto, sino tomar los productos de degradación del compuesto añadido (s) pueden dar falsos positivos señales que son indistinguibles de los degradadores de verdad.

No hay conflictos de interés declarado.

La financiación de este proyecto fue proporcionado por la National Science subvenciones OCE1029607 Foundation (XM) y MCB0702125 (de MAM) y Gordon y Betty Moore Foundation (de MAM).