溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记和文化独立的鉴定溶解有机随后的荧光激活细胞分选碳有辱人格的浮游细菌

环境浮游细菌培养与溶解有机碳（DOC）的化合物和一个DNA标记试剂，溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的一种模式。随后，商务部降解细胞分离升高BrdU使用荧光激活细胞分选（FACS）纳入散装社会。随后的分子分析这些细胞，然后确定。

微生物介导许多​​溶解的有机碳（DOC）基板在水生环境退化的主要代理商。然而，鉴定，改造大自然的DOC的具体池的细菌类群构成一个技术上的挑战。

在这里，我们描述了一个方法，夫妇溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入，荧光激活细胞分选（FACS），和16S rRNA基因的分子分析功能，使文化有辱人格的特定DOC的化合物在水生环境的浮游细菌能够独立识别。设置为接收BrdU和模型DOC化合物（DOC修订），或只BrdU（不加控制）一式三份浮游细菌的缩影。 BrdU替代品在新合成的细菌的DNA和BrdU标记的DNA的胸苷的位置^可以随时immunodetected 1,2。通过一个24小时孵化，浮游细菌，可以使用添加的DOC复合预计将有选择地激活，因此有较高水平的BrdU掺入比在DOC的修订和细胞非反应细胞（您好细胞）在无除了控制（低BrdU掺入细胞，李细胞）。荧光免疫检测后，您好细胞区分和身体从李细胞分离，荧光激活细胞分选^（FACS）3 。排序DOC - 反应的细胞（您好细胞）的DNA提取和分类学上通过随后的16S rRNA基因为基础的分析，包括PCR，克隆库的建设和测序鉴定。

1。水样加工

1. 通过1微米孔径的过滤膜过​​滤器10L环境用水，以去除大颗粒和bacteriovores。水滤液收集在一个carboy。
2. 转让36毫升滤液每到3无菌Eppendorf管中含有4毫升新鲜配制的多聚甲醛溶液（PFA 10％）（50毫升）。在室温下孵育2小时，以保持细胞。收集到0.22微米孔径的白色膜过滤器真空过滤的细胞。通过真空过滤的过滤器10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗过滤器。标签作为阴性对照的过滤器，并把它们存放在-20 ° C

步骤1.3-1.4建立DOC -有限的条件下是可选的。

3. 添加（5微米的NH ₄ CL，5微米NANO _3，和1μM的NaH ₂ PO ₄决赛中浓度）到carboy无机氮和磷的混合物。
4. 在现场温度孵育偶尔鼓动48小时在黑暗中。

2。建立和孵化缩影

1. 装满800毫升水样从第1.4步建立的缩影carboy每6个1 - L玻璃烧瓶。加入BrdU，终浓度为（10微米），每个缩影。拌匀。
2. 添加1毫升模型DOC复合解决方案分为三个缩影，这些将作为商务部修订。 1毫升无菌PBS添加到剩下的三个缩影，这些将作为无除了控制。
3. 在一个孵化器中孵化的缩影和孵化在现场温度在黑暗中晃动，而在100转。
4. 从每一个缩影和转让到50毫升无菌Eppendorf公司在时间点0，8，16，和24小时的管收集36毫升的水样。立即加入4毫升新鲜煤灰（10％）收集管和孵育2小时在室温下保存的细胞。
5. 通过0.22微米孔径的聚碳酸酯膜过滤器过滤器保存的细胞。用10 ml PBS冲洗过滤器。立即着手下一步或存放于-20 ° C的过滤器

在原位免疫检测BrdU掺入3。

1. 在室温下解冻的过滤器（商务部修订的样品，不加控制和阴性对照）。
2. 应用溶菌酶溶液1毫升10毫克/毫升溶菌酶蛋清在100毫米，50纳米EDTA的Tris（PH = 8）] ⁴覆盖过滤器上的细菌细胞。在室温下孵育30分钟。通过下吸10毫升PBS冲洗过滤器。
3. 添加蛋白酶K溶液1毫升[2 mg / ml的蛋白酶K在100毫米，50纳米EDTA的Tris（PH = 8）] ⁴覆盖过滤器上的细菌细胞。在室温下孵育30分钟。通过下吸10毫升PBS冲洗过滤器。
4. 加入1毫升的核酸外切酶的解决方案[核酸外切酶III（50 U / ml）的_氯化镁 2 5毫米和50毫米的Tris - ^{HCl] 5}到过滤器上的细菌细胞。 37 ° 30分钟。通过下吸10毫升PBS冲洗过滤器。
5. 根据制造商的指示组装框架密封孵化室（BIO - RAD）。
6. 酒精清洁干燥的表面上使用无菌刀片切成八分过滤器。
7. 使用镊子，放入一个组装框架密封孵化室（每个过滤器样品需要8帧密封腔）第八部分的过滤器。过滤器部分包含单元格方应朝上。过滤器的背面的水分，将允许过滤棒的幻灯片。如果过滤器变得干燥，适用于DIH ₂澳商会中心在幻灯片上的过滤器部分一个小滴（2μL）。

步骤3.8-3.20使用罗氏原位细胞增殖试剂盒的试剂，FLUOS从制造商的指示修改的程序。 除对PBS，所有的试剂套件内提供。

8. 施加足够的孵育缓冲液（0.5％，0.1％Tween20的PBS，牛血清蛋白），均匀地覆盖整个孵化室的过滤器部分，而不会造成溢出，一旦密封。
9. 聚酯放置在孵化室帧帧盖。按上下紧紧密封的孵化室。以上的过滤器，避免气泡。为在室温下在黑暗中10分钟孵育密封腔。
10. 删除聚酯密封，打开孵化室。 （注：开放的商会，有时会拉起来的帧从幻灯片密封在这种情况下，准备一个新腔以下步骤。）
11. 吸取了孵化室的一个角落缓冲区。避免接触过滤器。
12. 轻轻吹打100μLPBS冲洗过滤器和从会议厅出来的3倍。
13. 准备抗BrdU - FLUOS以下步骤使用前制造商建议的工作解决方案。
14. 吸取120μL抗BrdU FLUOS工作到过滤器的解决方案，照顾到均匀地覆盖整个表面。
15. 与一个新的聚酯盖重新密封腔。避免过滤器顶部的气泡。室在黑暗中在37 ° C为3小时。这一步将在原地异硫氰酸荧光素（FITC）标记BrdU纳入DNA。
16. 删除聚酯盖，打开孵化室。吸取了抗BrdU - FLUOS工作液。用PBS清洗过滤器的3倍。
17. 将过滤器从孵化室，无菌的表面。切片成小块用消毒的刀片的过滤器“部分。
18. 转移到2 ml离心管，每片含1毫升PBS的滤波器件。紧瓶盖的封口膜管和密封。在37 ° C和10分钟200转。
19. 安全和最高速度为5分钟到一个vortexer涡管。吸取上清液到15毫升无菌Eppendorf管。重复5次以上的孵化和涡步骤。结合在同一15 ml Eppendorf管中，每个样品的上清液。通常情况下，80％的细胞可以恢复暂停。
20. 商店取上清液，重悬细胞在4 ° C。 2天之内进行排序。

4。流式细胞仪分析

这里描述的是一个BD FACSAria流式细胞仪和相应的软件程序。

1. 优化制造商所建议的流式细胞仪以下步骤设置。这就要求：调整放大控制，设置所需的片断参数和甜蜜点;优化实验鞘压力的激光延迟和面积换算因子，FSC和SSC，FSC的阈值电压，FSC荧光缩放，荧光光电倍增管电压优化设置等
2. 基于FITC和侧散射（SSC）的荧光强度流式细胞仪（FCM）上运行的阴性对照样品。增加的FITC标记的阈值，直到阴性对照无细胞可以FITC - SSC采集显示的可视化。
3. 运行不加控制样品和研究万细胞FITC和SSC收购的分布格局。定义一个门，附上所有的细胞，并指定为“低强度的细胞”（LIS）。
4. 运行DOC修订的样品和研究基于FITC和SSC万细胞的分布格局。有些细胞会出现在预设的李门。定义另一个门附上的细胞，具有较高的荧光强度比LIS（他）。获得统计数据，以查看门细胞的相对丰度。
5. 排序您好细胞，成集合，其中包含500μLPBS管“净化1滴”模式。终止排序时，他的人数达50万计数。

5。筛选PCR扩增16S rRNA基因

过滤PCR程序修改Kirchman等。

1. 筛选到一个白色的排序细胞，0.22微米孔径，25毫米直径，聚碳酸酯滤膜过滤。剪掉的过滤器，不包含任何使用无菌刀片的细菌细胞的边缘。切成8个同等大小的块过滤器。
2. 到PCR反应管中放置一个单一的过滤片，与细胞面临着外来的管。 PCR反应管中加入45μLPCR级水。淹没的过滤器完全在水中。
3. 2罗氏插图PuReTaq阅读到进入PCR反应管PCR珠，简要旋涡。添加正向和反向的16S rRNA基因的引物（0.4微米每个引物终浓度），如27F和1492R ⁷各2μL，每个PCR反应管中。
4. （可选）添加加入1μl牛血清白蛋白溶液（BSA，终浓度是30μg/100μL）的PCR反应，以帮助吸附放大抑制剂。如果选择不添加牛血清白蛋白，加水加入1μl。
5. 进行PCR扩增热循环仪上一个。一个触摸下来PCR程序的建议，其中的退火温度，比上一季度减少62至52 ° C时为1 ° C，每循环11周期由15个循环，退火温度52 ° C。所有循环包括变性（95℃），退火（62至52℃）和扩展（72℃）50年代的持续时间步骤。 PCR程序也包括在最初的3分钟变性和最后的10分钟延长步骤。
6. 溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增。海关从凝胶中的PCR扩增和凯杰QIAquick凝胶提取试剂盒的清洁。
7. 每个样本执行两个额外的PCR扩增，每次使用一个新的过滤器“部分。经过PCR凝胶purificati上，池同一样品的扩增产物。纯净16S rDNA的扩增产物，现在准备允许分类鉴定，如克隆库的建设和测序，分子生物学分析。

6。代表性的成果：

代表使用为例，腐胺降解菌的研究结果说明。从格鲁吉亚沿海现场采集水样，并按照上述程序进行处理。流式细胞仪分析显示，腐胺除了诱发高FITC荧光强度的细菌集团的发展，说明高BrdU掺入率（图1）。这些细胞被指定为高BrdU掺入细胞（他），预计包含大多为腐胺降解菌。他在不加控制，只包含与下级BrdU掺入（LIS）的细胞缺少。 LIS，预计主要包括浮游细菌，无法使用添加腐胺。他整理成分离的导管，然后到膜过滤器收集。获得高您好使用过滤器PCR细胞16S rRNA基因扩增产物。

图1。流量没有除了控制和孵化24小时后收集的样品模型化合物的修订（腐胺作为一个例子）流式细胞仪分析。细胞分布的分析是基于（1）的FITC标记（X轴），这是正相关，BrdU掺入水平的荧光强度，（2）侧散射（SSC，Y轴），这是正相关的细胞大小。门符号是基于BrdU掺入，（高，高BrdU掺入，李，低BrdU的掺入）的水平。 HI和李细胞相对百分比显示在相应的门。

我们的做法夫妇BrdU掺入，流式细胞仪和16S rDNA序列分析，让物种一级的浮游细菌的代谢水环境中的个人的DOC组件的识别。 BrdU掺入检测标签的细菌细胞的代谢活动，只允许对活性细菌的分析，因此不包括休眠细胞。在我们的方法， 在原位 immunodetected和细菌有不同层次的BrdU掺入BrdU掺入随后可视化，使用流式细胞仪进行分组和排序。的BrdU纳入细胞的分析也有报道使用的BrdU标记的DNA磁珠^{immunocapture} 2,8,9分子分析。后者方法的一个限制是它无法区分不同活动水平的细胞。分析将包括在这种情况下，仍然使用的水样中土著的DOC（图1，LIS）仅略有活跃的细胞。

耦合方法已被用于识别细菌能降解如dimethylsulfoniopropionate（DMSP），香草，甘氨酸甜菜碱沿海海水³ DOC化合物的分类结构。它的应用可大致推断，研究细菌在水环境中使用的其他单一或混合溶解基板的分类。除了16S rRNA基因，功能基因标记也可以得到同样的分析。排序细胞的分子分析是由于排序的细胞，通常是小于1万细胞小丰挑战。因此，DNA为模板扩增，通常需要作进一步的分子分析。虽然在细胞数量有限，社会结构的足够高的分辨率通常是获得。有研究表明，社区的指纹终端限制性片段长度多态性（T - RFLP）从2000细胞（约1μL海水），在很大程度上^类似于 2X10 9细胞（约1升海水^）在10个沿海海水产生的。除了 ​​单用PCR基因扩增，排序细胞的宏基因组的分析是可能的，通过一个基于非PCR基因扩增技术，即多重置换^扩增 ，丙二醛11。

关键步骤

为了保持接近自然，除了过量的外部DOC化合物的缩影和应避免长时间的潜伏期的条件。初步实验，强烈建议，以确定模型DOC化合物诱导您好细胞的发展，在较短的时间内（<72小时）所需的最低金额。潜伏期较长时间，可能会提高发展的缩影瓶效应的关注。预培养与无机氮和磷是可选的，但可能有助于缩短孵化时间的长度，是商务部您好细胞的发展需要修订的缩影。

细胞BrdU荧光免疫检测前固定的条件是极为重要的。固定不足将导致细胞的损失（溶菌酶和蛋白酶K处理）在细胞壁通透性步骤。另一方面，超过保存完好的细胞往往过于僵化，以溶解和释放过滤器- PCR扩增DNA模板。防腐剂，防腐剂浓度和保存时间长短的选择应为研究细菌群落进行了优化。在本议定书中所列的保护程序进行了优化，为沿海海洋浮游细菌的社会，在很大程度上是由变形菌为主的α-和^γ-下属10。

膜过滤器上执行多个步骤的BrdU免疫检测。时应注意避免过度干燥过滤器。脱水细胞过度干燥过滤器可能会强烈地附着于滤膜，然后将很难重悬，后来FACS分析。 BrdU免疫检测前，后的细菌细胞计数应始终测量，以确定细菌细胞的回收率。

在进行过滤器- PCR检测^6，PCR试 ​​剂的量应该是足够的过滤片完全淹没。一个优化的热启动和触摸式PCR总体规划，将有助于产生良好的基因扩增。可以进行进一步的PCR技术的优化使用的PCR优化套件（如震中故障安全PCR系统）或操纵浓度^的Mg 2 +，BSA和其他成分 ​​。

方法的局限性

这种耦合方法允许收集细菌，可以潜在地降低一个特定的基板和文化自主确定详细的分类级别，这些功能的细胞。然而，几方面的考虑，应考虑到AC解释结果时计数。这种方法启动与特定的化合物，通常是在非示踪水平玻璃瓶，自然浮游细菌的潜伏期。确定为功能组合的细胞可能不同于那些过程中的化合物（S）在原位条件下。 BrdU掺入已发现一些细菌^1,2检测不到的。这些细菌，因此，使用这种方法是不可访问的。不直接参与化合物降解，但添加化合物（S）的降解产物的细菌可能会是无法区分真正降解菌的假阳性信号。

没有利益冲突的声明。

这个项目的经费是由国家科学基金会资助OCE1029607（XM）和MCB0702125（MAM），戈登和贝蒂摩尔基金会（MAM）的。