Retina Ganglion Hücre Survival Eğitim Bir Optik Sinir Crush Yaralanma murin Modeli

Bu protokol, retrograd retina ganglion hücreleri ve sonradan retina ganglion hücre hayatta kalma ve apoptosis analiz etmek için bir optik sinir ezilme yaralanması yapmak nasıl etiket gösterir. Bu glokom da dahil olmak üzere optik nöropati farklı türleri için deneysel bir hastalık modeli.

Optik sinir yaralanması ardından, geri dönüşü olmayan görme kaybı sonuçları retina ganglion hücrelerinin (RGCs), bir yavaş yavaş ölüm, aksonal dejenerasyona yol açabilir. Insan, bu tür hastalıkları örnekler travmatik optik nöropati ve glokom, optik sinir dejenerasyonu içerir. Bu, görme kaybı ve körlük önde gelen optik sinir başı tipik değişimler, progresif optik sinir dejenerasyonu, retina ganglion hücrelerinin kaybı, kontrolsüz, ile karakterizedir.

Optik sinir ezmek (ONC) yaralanma fare modeli Travmatik optik nöropati için önemli bir deneysel hastalık modeli, bu model glokom, vb optik sinir kademeli retina ganglion hücrelerinin apoptozise neden ezilme yaralanması. Bu hastalık modeli nöronal ölüm ve hayatta kalma, terapötik önlemler geliştirilmesi için gerekli olan genel süreçler ve mekanizmalar çalışma kullanılabilir. Buna ek olarak, farmakolojik ve moleküler yaklaşımlar bu modelde farklı tip optik nöropati tedavisinde potansiyel terapötik reaktifler belirlemek ve test etmek için kullanılır.

Burada, 1 gün retina ganglion hücrelerinin Temel retrograd etiketleme (RGCs), (II) 4 gün Optik sinir ezilme yaralanması, (III) retinae Hasat ve gün hayatta kalma RGC analiz (I) tarafından adım adım gösteri 11 ve (IV) Temsilcisi sonucu.

Kullanılan tüm ekipmanların ve reaktifler sterildir. Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve tüm hayvan deneyleri (hayvan çalışması protokol NEI-570) NEI / NIH Komitesi (ACUC) kullanın ve NIH kurallar ve düzenlemelere göre yapılmıştır.

1. Gün 1 Retina Ganglion Hücreleri At Temel Retrograd Etiketleme (RGCs)

Bu prosedürün amacı, optik sinir ezilme yaralanması üç gün önce farelerin üstün colliculus bir sinir tracer boya enjekte edilerek retrograd retina ganglion hücrelerinin etiket. Boya retrograd retina ganglion hücrelerinin tarafından ele alınan ve yaşam RGCs (Şekil 1) için bir belirteç sağlar olacak. Bu yaklaşım, az bir ^değişiklik 1-5 ile yaşayabilir RGCs tekrarlanabilir etiketleme verir .

1. Fareyi derinden uyutmak. Başın tepesinde saç temizleyin. Fare, küçük bir stereotaksik aparat yerleştirin. Koruyucu oinment her iki göze uygulanır. Kafa derisi Dezenfekte iyodofor ve% 70 alkol fırçalayın kullanarak her üç kez.
2. Kafatası açığa çıkarmak için deride bir kesi yapın ve% 3 hidrojen peroksit kullanılarak kuru ve temiz tutmak.
3. Belirlenmesi ve bregma işareti. Bregma arkasında 2.9 mm ve 0.5 mm, her ^{yarımkürenin} 7 orta hatta yan üstün colliculus üzerinde bir delik delin . Sondaj sırasında, ikincil ısı hasarı önlemek için delik delinmiş site için tuzlu su uygulamak.
4. Stereotaksik bir ölçüm cihazı ve Hamilton şırınga kullanarak, beynin kemik yüzeyinden 1.6 mm derinlikte, her yarımkürenin üstün colliculus içine çok yavaş FluoroGold nöral tracer boya enjekte (% 3 1 ul salin içinde Florokrom).
5. Kesi yeri dikin. Analjezi için buprenorfin subkutan enjeksiyon verin.
6. Sıcak ve kuru bir alana taşıyın ve dik bir duruş, bakım ve evde kafes dönmek için mümkün olduğu kadar izlemek. Sistemik analjeziklerin (örneğin, buprenorfin) ve topikal antibiyotikli merhem, etiketleme prosedürü sonra ilk üç gün boyunca, günde iki defa verilir ve fare yakından izlenmelidir.

2. 4. Gün, Optik Sinir Ezilme Yaralanması

Bu yöntemde, optik sinir, retina ganglion hücrelerinin yavaş yavaş bir ölüme neden olacaktır aksonları birincil hasar (Şekil 2), neden bir ezilme yaralanması geçerli olacaktır.

1. Tracer boya uygulaması üç gün sonra, fare derin anestezi. Diseksiyon mikroskop kullanarak, bir gözün konjonktiva bir çift yaylı makas kullanılarak 04:00 konumu hakkında çizi.
2. Yörünge kasları hafifçe saptırmak ve onları bir kenara koymak. Göz küresi çıkışında beyaz optik sinir Açığa. Herhangi bir kan damarlarının zarar vermemek için çok dikkatli olun.
3. Bir çift çapraz eylem forseps yardımı ile yaklaşık 3 saniye boyunca yaklaşık 2 mm göz küresi, optik sinir ezilme yaralanması geçerlidir. Kanamaya neden oftalmik arter zarar vermemek için çok dikkatli olun.
4. Ezilme yaralanması tamamlanmasından sonra, kesi sütüre edilir.
5. Fare anestezi kurtarır önce analjezi için buprenorfin bir subkütan enjeksiyon vermek.
6. Dik bir duruş korumak ve kendi ev kafesine geri gelene kadar, sıcak ve kuru bir alana taşıyın ve izlemek. Sistemik analjeziklerin (örneğin, buprenorfin) ve topikal antibiyotikli merhem, ezilme yaralanması prosedürü sonrası ilk üç gün boyunca, günde iki defa verilir ve fare yakından izlenmelidir.

3. Retinae Hasat ve Gün 11 yaşında RGC Survival Analiz

Bu prosedürün amacı, retinaeto retina ganglion hücre sağkalım analiz hasat için.

1. 11 (günde 7 ONC sonra) gün, fare, _CO 2 infüzyonu ve servikal dislokasyon tarafından ötenazi .
2. Gözler yörüngesine basınç uygulayarak bir çift forseps yardımı ile enükleasyon.
3. Gözler, iki saat boyunca% 4 paraformaldehid çözüm sabit ve PBS içinde üç kere yıkanır. Retina parçalara ayır. Retina diseksiyon prosedür zaten ⁶ Gustmann, S. ve ark tarafından 2010 yılında vallahi daha önce yayınlanmış olan ve bu nedenle burada açıklanan olmayacaktır .
4. Hayatta retina ganglion hücrelerinin Görüntüler retinanın tanımlanan bölgelerde floresan mikroskop kullanılarak alınır, ve retina ganglion hücre yoğunluğu sayılabilir. Optik sinir ezilme yaralanması ya da floresan etiketli retina ganglion hücrelerinin bir temsilcisi sonucu Şekil 3'te gösterilmiştir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Retina ganglion hücre sağkalım, yedi gün sonra optik sinir ezilme yaralanması analiz etmek retinae, sabit, hasat basık ve monte edildi. Retina görüntüler floresan mikroskop kullanılarak alınmıştır. Yaralanmamış bir şekilde normal r ile karşılaştırıldığındaetina (Normal, sol), yaşayabilir RGCs sayısı (yeşil, retrograd üstün colliculus enjekte FluoroGold nöral tracer boya etiketli) retinae bir optik sinir ezilme yaralanması (sağ, ONC) (Şekil 3) ile anlamlı derecede düşük .

Şekil 1. Retina ganglion hücrelerinin bazal retrograd etiketleme
Optik sinir ezilme yaralanması sonrası farklı zaman noktalarında uygulanabilir retina ganglion hücreleri saymak için, retina ganglion hücrelerinin (optik sinirin beyin üç gün içinde üstün colliculus önce bir sinir tracer boya (yeşil renk) enjekte retrograd etiketli kırmızı) ezilme yaralanması. Retina ganglion hücrelerinin aksonları üstün colliculus ikamet yılından bu yana, izleme boya retrograd RGCs tarafından ele alınması ve yaşam RGCs için bir belirteç olacaktır.

Şekil 2. Optik sinir ezilme yaralanması
Retina ganglion hücrelerinin hayatta kalma durumunu analiz etmek için, bir ezilme yaralanması aksonlar için birincil hasara neden optik sinir (kırmızı) uygulanır. Bu kademeli bir retina ganglion hücrelerinin ölümüne yol açacaktır. Üç gün sonra izleme boya (yeşil) enjeksiyonu, fare anestezi. Bir gözün konjonktiva çizi. Yörünge kasları karsilayin ve onları bir kenara koymak. Göz küresi çıkışında optik sinir Açığa. Ezilme yaralanması göz küresi yaklaşık 2 mm optik sinir bir çift çapraz eylem forseps kullanarak yaklaşık 3 saniye boyunca uygulayın.

Şekil 3. Floresan-etiketli optik sinir ezilme yaralanması ya da retina ganglion hücrelerinin
Retina ganglion hücre sağkalım, yedi gün sonra optik sinir ezilme yaralanması analiz etmek retinae, sabit, hasat basık ve monte edildi. Retina görüntüler floresan mikroskop kullanılarak alınmıştır. Yaralanmamış bir şekilde normal retina (Normal, sol) ile karşılaştırıldığında, canlı RGCs sayısı (yeşil, retrograd üstün colliculus enjekte FluoroGold nöral tracer boya etiketli) bir optik sinir crush yaralanma (sağ, ONC retinae anlamlı olarak daha düşüktü ) (Şekil 3). Ölçek çubuğu: 50 mikron

Optik sinir ezilme yaralanması fare modeli RGC ölüm ve hayatta kalma sürecini incelemek için yararlıdır. Bu model aynı zamanda sık sık farklı reaktifler ve genlerin RGC apoptoz ve sağkalım üzerine etkilerini araştırmak amacıyla kullanılır. Bu modelin bir diğer avantajı da minimal varyasyonları ile yüksek derecede tekrarlanabilirlik olmasıdır.

Ancak bu model birkaç adım, özel bakım gereklidir. İlk olarak, optik sinir ezilme yaralanması yaparken, oftalmik arter ve bu nedenle sonraki retinal iskemi zarar görmesine neden olabilir, çünkü çok fazla güç kullanmak ve çok uzun süre ezmek için çok önemlidir. Buna ek olarak, optik sinir ortaya çıkarmak için çalışırken, bir fare göz çevresindeki kan damarlarının zarar görmemesi için büyük özen gerekir.

Bizim araştırma NIH, Ulusal Göz Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.