Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Hareketi sırasında memeli nöronlar in vivo fizyolojik tepki ölçmek ve nöronal morfoloji, nörokimyasal fenotip ve sinaptik mikrodevreler nöron fizyoloji ilişkilendirmek için bir teknik tarif edilir.

Bireysel nöronlarda ve nöron devreleri fonksiyonu rol duyusal ve motor fonksiyonların nöronal mekanizmaları anlamak için esastır. Bir hayvan hareketi sırasında statik ^1,2 veya kayıt ekstrasellüler nöronal aktivitenin ise sensorimotor mekanizmaları çoğu soruşturma nöron veya inceleme güveniyor. ^3,4 sensorimotor fonksiyonu için temel bir arka plan bu çalışmalar varken, onlar da işlevsel bilgi değerlendirmek yok bir hareket sırasında ortaya çıkan ya da nöronun tam anatomi, fizyoloji ve nörokimyasal fenotip karakterize yeteneği sınırlıdır. Bir in vivo hareketi sırasında bireysel nöronların geniş karakterizasyonu olanak veren bir teknik burada gösterilir. Bu teknik, primer afferent nöronların çalışma değil, aynı zamanda motor nöronlar ve sensorimotor internöronlar karakterize etmek için kullanılabilir. Başlangıçta tek bir nöronun yanıt nöron için açık alanın belirlenmesi takip mandibula çeşitli hareketler sırasında elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak kaydedilir. Nöronal tracer sonra intraselüler nöron içine enjekte edilir ve beynin nöron, ışık, elektron veya konfokal mikroskobu (Şekil 1) ile görülebilmesi şekilde işlenir. Nöronal morfoloji, nöron (Şekil 2,3) fizyolojik yanıt ile ilişkili olduğu ve böylece karakterize nöron ayrıntılı morfoloji sonra yeniden. Bu iletişimde, bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması için önemli anahtar detaylar ve ipuçları verilmektedir. Bu yöntem diğer tekniklerle birleştirerek değerli ek bilgiler altında çalışma nöron tespit edilebilir. Retrograd nöronal etiketleme nöronlar belirlemek için kullanılabilir etiketli nöron sinaps; nöron devresi böylece ayrıntılı olarak belirlenmesi. İmmünositokimya etiketli nöron içinde nörotransmitterlerin incelemek ve etiketli nöron sinaps nöronların kimyasal fenotipleri belirlemek için bu yöntem ile kombine edilebilir. Etiketli nöron da etiketli nöron ultrastrüktürel özellikleri ve mikrodevreler belirlemek için elektron mikroskobu için işlenebilir. Genel olarak bu tekniği iyice böylece sensorimotor fonksiyonu nöron rolünü içine önemli fikir izin in vivo hareket sırasında nöronlar karakterize etmek için güçlü bir yöntemdir.

1. Hayvan Hazırlık

1. Pentobarbital sodyum (50mg/kg 'dan IP) ve bir ısıtma yastığı yer sıçan anestezisi. Hayvan kesme makineleri ile arka kafatası örten deri Tıraş. Hayvan ayak parmakları palpebral refleks yokluğu gibi sıkışmak yanı sıra zaman, bir geri çekilme refleksi ve seslendirme olmaması için cerrahi anestezi düzeyi seviyesi testi ile elde edilmiş olduğunu sağlamak için kontrol edin. Anestezi düzeyi her 15 dakikada bir kontrol edin ve sodyum pentobarbital 15mg/kg her 45 dakikada bir enjeksiyonu tarafından anesthetisa cerrahi bir düzeyde tutmak.
2. Aseptik teknik kullanın ve inguinal bölge, karın ve uyluk oluşan kırışık bir kesi hemen distalinde ve femoral vene kanül (1 mm çapında, Clay Adams) ve femoral arterden eklemek. Submandibular bölgede orta hat kesi yapmak, infrahyoid kasları yansıtmaktadır. Trakea küçük bir kesi yapın ve havalandırma sağlamak için bir kanül (2 mm çap) yerleştirin. Place.Monitor sistemik arteryel kanül ile diyastolik ve sistolik kan basıncı sabitlemek için cannual trachael etrafında bir sütür Tye. Şimdi geri çekilme ve palpebral refleks izlemeye ek olarak anestezi düzeyini ölçmek için kan basıncı monitör. Venöz kanül ile gerektiğinde ek anesteziklere.
3. Sıçan stereotaksik bir çerçevenin içine yerleştirin ve beyincik maruz kraniotomi gerçekleştirmek. Kemirgen ventilatör trakeal kanül takın. Nemlendirilmiş hava ile 100/min hızında 2 cm ³ hacmi ile hayvan havalandırınız. Akciğer çökmesini engellemek için 1 cm H ₂ O bir pozitif ekspirasyon sonu basınç sağlanmalıdır. Her 15 dakikada atelektazi önlemek için akciğerlere hyperinflate. Sonra ısıtılmış mineral yağ (30 ° C) ile beynin yüzeyini kaplayan. Doğrudan parietal ve interparietal kemikler arasındaki birleşme altında bulunan büyük venöz sinüs önlemek için dikkatli olun.
4. Elektromanyetik bir vibratör ile birleştiğinde bir çubuk siyanoakrilat tutkal sürün ve çene diastema çubuk eklemek. Vibratör ya da A / D ve bilgisayar çıktılarını ya da sinyal üreteci Mandibula kullanarak komut sinyalleri taşıyın.
5. Kraniotomi bitişik cilt altında bir siliver-gümüş klorür topraklama elektrot yerleştirin.

2. Elektrot hazırlama

1. Yatay bir mikroelektrot çektirmenin veya kuvars Alüminosilikattan cam kullanarak Mikroelektronlar Üretiyor.
2. 0.25m KCl ile 0,5 M Tris HCl tamponu (pH 7.6) veya serum fizyolojik içinde% 2 tetramethlyrhodamine (pH 6) çözünmüş% 5-10 biotinamide mikroelektrot doldurun. Elektrot empedansı bir elektrot test cihazı ile kontrol edin. 60-80M Ω empedans ile geniş çaplı aksonlar kaydetmek için elektrotlar yapmak, küçük akson ve internöronlar 80-150MΩ empedansı ile elektrotlar.
3. Elektrometre başkanı aşamaya mikroelektrot yerleştirin. , Hayvanın başının arkasında pozisyonda sabit küçük bir teleskop (20X kapalı bir dürbün ağı ile) ile elektrot gözünüzde canlandırın. Elektrotlar stereotaxically büyük bir hassasiyetle yerleştirilmiş sağlar çünkü teleskop kullanarak önemlidir.

3. Elektrofizyolojik kayıt ve hücre içi boyama

1. Pia mater küçük bir açılış yapmak ve elektrot beyin dokunduğunda bir geri besleme sinyali üretilir, böylece kapasitans geribildirim telâfi. Bu beynin yüzeyine doğru konum sağlar.
2. Tekrarlanan mandibular deplasman üretmek ve bir step motor ile beyin içine elektrod ilerlemek.
3. DC potansiyel ani damla nöronal impalements tanır ve devam eden sinaptik aktivite intrasomatic nöronal impalements belirlemek. Kapasitans karşılama elektrot vızıltı ya da nadiren başarılı bir hücreye nüfuz dokunarak. Çünkü elektrotlar yüksek empedans, nöronal yanıtları nadiren penetrasyon için önce gözlenir.
4. Nöronal yanıt rampa basılı tutun ve sinüzoidal çene hareketi ile karakterize bir nöron Impale ve penetrasyon stabil sayılır sonra, ⁵ Harita nöronun alıcı alanında iletken olmayan bir prob ile başının etrafında deri ve intra oral kavite problama tahta bir sopa gibi. Çalışma ile ilgili ise, nöron, kas kasılması ve zararlı uyaranlara gibi diğer işlevsel ilgili uyaranlara yanıt incelemek ^6. Primer afferent nosiseptif nöronal reseptörler nosiseptif uyaranlara cevap. Genel anesthesetics pentobarbital sodyum gibi primer afferent nöronların aksonal iletim engellemek değil, sinaptik iletim deprese yok. Böylece birincil afferent nöron akson aksonal iletim korunur.
5. 15 70nA dakika olmak üzere toplam enjeksiyon süre akımı (DC, 1-4NA) enjekte edilir. Mevcut enjeksiyon sırasında elektrot penetrasyon Monitör ve membran potansiyeli-30mV daha olumlu hale gelirse durdurma.

4. Doku işleme

1. (% 0.9 NaCl 38 durulama vasküler pentobarbital doz aşımı (140mg/kg IV) ve serpmek hayvan Euthanize ° C heparin 500 adet ve 1 ml% 2% 4 0.1M fosfat tamponu (pH 7.4) paraformaldehid takip xylocaine .
2. Ya da frontal, sagittal veya yatay düzlemde bir vibratome kullanarak 50-100μm beyin ve o bölümü çıkarın. Secions 25 ° C PBS içinde serbest dalgalı toplanır.
3. % 1-2 normal keçi serumu kuluçka ve% 1 Triton X 0.01m PBS-100 avidin biotin kompleksi inkübasyon (1:50 Elite Vectastain) tarafından takip DAB için beyin işleyin. H ₂ O ₂ ile nikel-DAB kullanarak bölümleri tepki. Texas Kırmızı, 4 geceleme PBS içinde avidin-biotin kompleksi (1:50) inkübe bölümleri ° C ve 4 ° C gecede PBST% 4 Texas Red avidin DCS kuluçkaya yatmaktadır. Işlemek için 23 ° C'de bir floresan Nissl leke (NeuroTrace) 20min bölümler Counterstain
4. Nöron rodamin enjekte edildi, bir floresan mikroskobu (Ex-545nm) ile doğrudan enjekte nöron görselleştirmek.

5. Retrograd etiketleme, immünhistokimya, konfokal görüntüleme, kantitatif ko analiz yöntemi birleştiren

Bu tekniğin diğer yöntemler ile birleştirerek başarı iyi bir hücre içi etiketleme üzerine büyük ölçüde bağımlı.

1. Bu yöntem kolaylıkla retrograd nöronal etiketleme ile kombine edilebilir görüntülendi. ^7-10 Bunu yapmak için, hayvan anestezi ve aseptik teknik kullanılarak, horseradish peroksidaz (% 20 horseradish peroksidaz Sigma VI, Sigma) gibi nöronal tracer enjekte ve% 1 buğday mikrop gibi masseter kası gibi periferik hedef bölgeye horseradish peroksidaz (Sigma) aggultinated. Bu nöronal tracer periferik aksonları içine alınır ve motonöron somata aksonal taşıma araçları ile taşınan olacaktır. Masseter kası için, izleyicinin 15μl steril 10 mikrolitrelik mikroenjektör kullanarak kas içine enjekte edilir. Hayvanlar daha sonra anestezi kurtarıldı ve daha sonra kurtarma için kafesler yerleştirilir kadar bir ısıtma yastığı yerleştirilir ve takip edilmektedir. 24 saat sonra, hayvanları uyutmak ve nöronlar karakterize fizyolojik ve hücre onlara leke. Sonra HRP olarak tetramethylbenzidine (TMB), kobalt sabitleyici ve yoğun olarak ve tungstat Sodyum siyanür kullanarak varlığı için yukarıda ve süreç doku kesitlerinde anlatıldığı gibi hayvan serpmek. % 1 sodyum Yeri bölümleri 0.1M PBS (pH 6.5) ve 0.0007% 15 mutlak etanol ve aseton içinde çözünmüş TMB çözünmüş tungstat ° C, 20 dk. Ardından 1.0 ml% 0.3, 60 dakika süreyle inkübasyon çözüm 100 ml H ₂ O 2 ekleyerek doku bölümleri tepki . % 0.05 diaminobenzidin (pH 7.4),% 0.02 kobalt, ve% 0.01 0.1M 10 dakika süreyle PBS (pH 7.4) H ₂ O ₂ 0.1M PBS (pH 6.5) yer doku ve durulayın. 37 ° C Açıklandığı gibi biotinamide enjekte nöron görünüm için doku Süreci ve etiketli duyusal nöron ve çeşitli motor nöronlar arasındaki ilişkilerin görselleştirmek.
2. Burada gösterilen tekniği de kolayca immnocytochemistry ile kombine edilebilir. ^6. Bir örnek olarak, immunocytochemically sinaptofizin için doğru etiketli nöronların içinde sinaps (Şekil 3) bulmak için beyin süreci. Bunu yapmak için, 2 gün, 4 ° C ve daha sonra 23 1s için anti-fare FITC (1:400) inkübe ° C için fare anti-sinaptofizin antikor (1:10,000) beyin bölümleri inkübe
3. Floresan işaretleri ile etiketlenmiş veya floresan görüntüleme için işlenmiş Nöronlar konfokal görüntüleme için idealdir. Şekil 3, bir akson bouton aracılığıyla konfokal mikroskobu ile elde edilen optik bölümünde bir örnektir. (Şekil 3). Etiketli nöron (Şekil 4) ile birden fazla optik bölümleri satın alarak etiketli nöronların animasyonlar oluşturun .
4. Bu yöntem ile etiketlenmiş Nöronlar, kantitatif ko analiz için kullanılabilir. Bunu yapmak için, NIH Image ile birlikte kamuya açık bir yazılım makro (http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm bulundu) kullanın. Sinaptofizin immünhistokimya ile hücre içi etiketleme birleştirerek tek bir akson terminalleri içinde sinaptofizin Localize ⁶

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu yöntemi kullanarak elde edilebilir temsilcisi sonuçları genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu tek beyin sapı nöron elektrofizyolojik açıkça görülebileceği gibi, alt çenenin hareketi sırasında kaydedilen ve hareketi sırasında, bu nöronun yanıt (Şekil 1 sola, açık mavi alt) modüle oldu. Bu nöron elektrofizyolojik karakterizasyonu sonra biotinamide ile enjekte edilir ve daha sonra görünüm için işlendi. Yeniden inşa nöron (Şekil 1 orta, yeşil) gerçek olabiliranatomik bir dönüm noktası Ted, bu durumda trigeminal motor çekirdeğinin (kırmızı anahat) atanmış. Nöron ve yeniden yapılanma hareketi sırasında nöronal yanıt dayanarak bu ikincil kas mili afferent nöron olarak tanımlanabilir. Şekil 2 çene yer değiştirme sırasında bir nöronun fizyolojik yanıt temsili bir örnek göstermektedir. Nöronun tepkisi ani ateş frekans olarak temsil edilmektedir. Nöronal yanıt mandibular yerinden bu özel nöron mandibular konumu ile ilgili duyusal feedback sağlar belirten yakından taklit eder. Şekil 3 Not sinaptofizin için boyama ve Nissl bir leke ile birlikte bir intraselüler lekeli akson yüksek bir büyütme görüntü. Akson bouton içinde sinaptofizin (sarı) ko unutmayın. Şekil 4 fizyolojik karakterize ve intraselüler etiketli, tek bir nöronun bir animasyon.

Şekil 1 Genel Bakış yöntemi. Üst sol: mandibular deplasman. Tek nöron (sarı) Orta Hücre içi kayıt (yeşil). Bu nöron morfolojisi, hücre içi kayıt ve enjeksiyondan sonra yeniden inşa edildi. Kırmızı anahat trigeminal motor çekirdeğinin yeri gösterir. Sol alt çene hareketi sırasında, bu nöronun fizyolojik yanıt.

Şekil 2 çenenin hareketi sırasında in vivo olarak kaydedilen tek bir kas duyusal nöron Temsilcisi fizyolojik yanıt. Çene deplasman nöronal yanıt benzerliği dikkat edin.

Şekil 3 problama kas sırasında yanıt intraselüler lekeli duyusal nöronun sinaptik BOUTONS (kırmızı şişlikler) Terminal aksonal arborization. Sinaptofizin için sonraki immünositokimyasal işleme aksonal bouton içinde sinaptofizin lokalizasyonu (sarı) gösterir. Yeşil floresan Nissl leke.

Şekil 4, akson fizyolojik yanıt mandibuler hareketi sırasında in vivo kaydedildi kas mili primer afferent nöron akson Animasyon sonra intraselüler boyanmış ve görselleştirme için işlenmiş.
Şekil 4 yüksek çözünürlüklü video
Şekil 4 orta çözünürlüklü video

Burada gösterilen yöntem tek nöron fonksiyonu ile ilgili önemli bilgi sağlar ve nasıl bireysel nöronların yanıt nöronal devreleri katkıda güçlü bir tekniktir. ⁹ Bu bilgi sensorimotor fonksiyon anlamak için esastır. Bu tekniğin en büyük gücü, çok sayıda fizyoloji, morfoloji ve sinaptik morfolojisi ve dağıtım da dahil olmak üzere bir nöron ile ilgili parametrelerin belirlenmesi sağlar. Retrograd nöronal etiketleme nöronal devreleri gibi ek bilgi gibi diğer teknikleri ile kombine edildiğinde bu yöntemin karakterize edilebilir. ^7,8 diğer bir avantajı, bu adımları öğrenmiş olmasıdır . Örneğin, hücre içi kayıt immünsitokimya veya ilk yöntemi ustalık sonra eklenen retrograd nöronal etiketleme ile hücre içi boyama ile başlangıçta yapılan olabilir. Belki de bu tekniğin en büyük sınırlama, herhangi bir deneyde sadece çok az sayıda nöron sokulabileceği. Genelde belirli bir fizyolojik türü 02:58 nöronlar ilk olarak etiketlenir. Fizyolojisi ve morfolojisi arasındaki olası ilişkiyi formüle sonra, ek deneyler, tek bir nöron etiketli olduğu deneylerde bu ilişkinin dikkatle kontrol etmek için kullanılır.

Bu yöntemin başarısı için en önemli adım, hücre içi elektrofizyolojik kayıt istikrarı korumak. Kayıt istikrar çalışma altında nöronun beynin içinde yer ancak bir takım manipülasyonlar kayıt istikrarı arttırmak için kullanılabilir bağlı olarak büyük ölçüde değişecektir. Pnömotoraks ve hayvan yapay solunum pulsasyonu azaltmak için havalandırmalı olabilir. İstikrar, yaklaşık 1 cm _H 2 O. pozitif ekspirasyon sonu basınç uygulayarak daha da artabilir Beyin içinde ilgi bölgeye ulaşıldığında, istikrar solunum hacmi azalan ve artan solunum hızı hyperventilating hayvan tarafından geliştirilmiş. Bazı elektrofizyolojik çalışmalar, beyin üzerinde sıcak agar uygulanan ve mesane kanüle; bu işlemler beyin sapı nöronal kayıt kararlılığının artmasında etkili olmamıştır. Enjeksiyon kat daha uzun olması gerekmez işaret etmek önemlidir. Yaklaşık 5 dakika enjeksiyon süreleri iyi sonuçlar elde edilebilir. Mikroelektronlar küçük uç boyutu nedeniyle, beynin içinde elektrot kırılması genellikle izleyicinin büyük bir sürümü üretmek değildir. Bu nedenle elektrot değiştirilebilir ve nöronlar başarıyla kaydedildi ve elektrot kırılması yerin birkaç yüz mikron içinde boyanmış. Elektrot tıkalı veya kayıt çözümü yeterince elektrot ucu doldurmak değilse, gürültü büyük bir artış olacak ve elektrot değiştirilmesi gerekir. Beynin içine yerleştirilmesi için önce elektrot empedansı Test verimsiz elektrot yolları büyük ölçüde azaltır ve zaman kazandırır. Beyin stereotaksik konumlandırma küçük bir bölgenin kayıt çalışıyorsanız çok önemlidir. Sabit bir stereotaksik sıfır korumak için kayıt tabloya bağlı bir teleskop kullanın. Teleskop, elektrot, elektrot tutucu kayıt tabloya eklenen ve daha sonra büyütme altında izlenenler yerleştirilir, çünkü çok yararlıdır. Bu yedek elektrot mikroelektrot ve sıfırlama çok doğru yerleştirilmesini sağlar.

Juxtacellular nöronal etiketleme, son yıllarda yapılan çalışmalarda bir dizi var. Nöronal kayıt ve nöronal tracer özellikleri dayalı bir nöron için yakın bir elektrot yerleştirilir Bu yöntem ^ile 11,12 atılır . Tracer elektrot çevresindeki diğer nöronların dendrit ve aksonlar dahil olabilir çünkü bu yöntemle belirgin bir potansiyel sorun sahte etiketleme. Ekstraselüler kaydedilen aksiyon potansiyelleri sadece nöronun sinaptik girdi ama nöronun içsel özelliklerine göre oluşturulabilir Bunun yanı sıra, nöron girdi-çıktı ilişkileri belirlenir. Burada bildirilen yöntem ile mikroelektrot nöron içinde aslında ve böylece nöronal aktivitenin lekeli nöron atıf ile ilgili herhangi bir belirsizlik varken, nöronların sadece etiketlenir. Aksonlar etiketleme, bu özellikle önemlidir, çünkü sahte etiketleme birkaç mikron sonuçları mikroelektrot hareketi. Ayrıca, sinaptik potansiyeller eşik altı olaylar da dahil olmak üzere kazığa nöron kaydedilebilir.

Gelecek çalışmalar uyarılmış hareketleri ile bu yöntemi birleştirmek. Örneğin, uyarılmış bu hareketleri sırasında nöronların hücre içi kayıt ve boyama izin vermelidir kortikal stimülasyon, beyin içinde çiğneme hareketleri ve kayıt istikrar uyandırmak. Bu teknikte minimal cerrahi müdahale ile yapılabilir bu yana, bu aynı zamanda poss olabilirin vivo gen ekspresyonu değiştiren maddeler enjekte etmek için bu yöntemi kullanmak için ible.

Anthony Taş, in vivo hücre içi kayıt ve hücre içi boyama tekniği ilk geliştirme ile ilgili yardım için Brown ve David Maxwell yılında ilk eğitim için teşekkür ederim . M. Gümüş Ben collocalization makro yardım için teşekkür ederim. Birçok bilim adamı kiminle, R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar dahil olmak üzere, bu tekniğin gelişimi sağlanan anlayış işbirliği var. Bu teknik, NIH hibe DE10132 DE15386 ve RR017971 önemli desteği ile geliştirildi.