Method Article
يوصف تقنية لقياس استجابة فسيولوجية الجسم الحي من الخلايا العصبية في الثدييات أثناء التنقل والربط بين علم وظائف الأعضاء من الخلايا العصبية مع مورفولوجيا الخلايا العصبية ، والنمط الظاهري الكيميائية العصبية الدارات الدقيقة متشابك.
دور الخلايا العصبية الفردية وظيفتها في الدوائر العصبية أمر أساسي لفهم الآليات العصبية من الوظائف الحسية والحركية. معظم التحقيقات آليات الحسية تعتمد على الفحص إما من الخلايا العصبية في حين أن الحيوان هو 1،2 ثابتة أو تسجيل نشاط الخلايا العصبية خارج الخلية أثناء الحركة. 3،4 في حين أن هذه الدراسات قد وفرت الخلفية الأساسية لوظيفة الحسية ، لأنها إما لا تقييم المعلومات الفنية والذي يحدث أثناء الحركة أو محدودة في قدرتها على تميز تماما النمط الظاهري التشريح والفيزيولوجيا والكيميائية العصبية من الخلايا العصبية. ويظهر هنا وهناك تقنية التي تسمح توصيف واسعة من الخلايا العصبية الفردية في الحركة خلال الجسم الحي. ويمكن استخدام هذه التقنية ليس فقط لدراسة الخلايا العصبية الأولية وارد ولكن أيضا لتوصيف العصبونات الحركية والحسية interneurons. في البداية يتم تسجيل رد فعل عصبون واحد باستخدام أساليب الكهربية خلال تحركات مختلفة من الفك السفلي يليها تحديد الحقل تقبلا للعصبون. ثم يتم حقن الخلايا العصبية والتتبع intracellularly في الخلايا العصبية ، ومعالجة الدماغ العصبية بحيث يمكن تصور مع المجهر الضوئي ، والإلكترون أو مبائر (الشكل 1). ومن ثم أعيد بناؤها في التشكل مفصل للعصبون تتميز بحيث يمكن ربط مورفولوجيا الخلايا العصبية مع الاستجابة الفسيولوجية للخلية عصبية (الشكلان 2،3). في هذه الاتصالات هي مفتاح تقدم تفاصيل مهمة ونصائح للتنفيذ الناجح لهذه التقنية. ويمكن تحديد قيمة للحصول على معلومات إضافية من الخلايا العصبية قيد الدراسة من خلال الجمع بين هذه الطريقة مع غيرها من التقنيات. ويمكن استخدام العلامات العصبية الوراء لتحديد الخلايا العصبية التي نهايات الخلايا العصبية المسماة ؛ تقرير مفصل وبالتالي السماح للدوائر العصبية. ويمكن الجمع بين كيمياء سيتولوجية مناعية مع هذا الأسلوب لفحص الناقلات العصبية داخل الخلايا العصبية المسماة وتحديد الظواهر الكيميائية من الخلايا العصبية مع نهايات الخلايا العصبية التي وصفت. ويمكن أيضا أن تكون الخلايا العصبية المسماة المجهزة للالمجهر الإلكتروني لتحديد ملامح التركيبية والدارات الدقيقة من الخلايا العصبية المسماة. عموما هذه التقنية هي وسيلة قوية لتوصيف دقيق خلال الخلايا العصبية في الجسم الحي الحركة مما يتيح رؤية جوهرية في دور الخلايا العصبية في الوظيفة الحسية.
1. تحضير الحيوانات
2. إعداد القطب
3. الكهربية تسجيل وتلطيخ الخلايا
4. معالجة الأنسجة
5. الجمع بين الأسلوب مع وضع العلامات الوراء ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، والتصوير مبائر ، التحليل الكمي colocalization
نجاح دمج هذه التقنية مع أساليب أخرى تعتمد بشكل كبير على وضع العلامات الجيدة داخل الخلايا.
6. ممثل النتائج :
وتتضح نظرة عامة على نتائج ممثلة التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب في الشكل 1. كانت الاستجابة لهذه الخلايا العصبية (الشكل 1 اليسرى السفلى ، الضوء الأزرق) تم تسجيلها electrophysiologically هذا واحد عصبون الدماغ أثناء حركة الفك السفلي ، وكما يمكن أن نرى بوضوح ، التضمين أثناء الحركة. تم حقن هذه الخلايا العصبية مع biotinamide بعد توصيف الكهربية ومعالجتها في وقت لاحق عن التصور. يمكن للعصبون بناؤها (الشكل 1 المتوسطة ، أخضر) أن يكون حقيقياتيد إلى المعالم التشريحية ، في هذه الحالة المعينة نواة المحرك الثلاثي التوائم (مخطط الحمراء). يمكن أن يستند إلى استجابة الخلايا العصبية أثناء الحركة والتعمير يتم تحديد هذه الخلايا العصبية والخلايا العصبيه المغزل العضلي الثانوية وارد. ويوضح الشكل 2 مثالا ممثل الاستجابة الفسيولوجية للخلية عصبية أثناء النزوح الفك. وتمثل استجابة الخلايا العصبية وتيرة اطلاق النار الفوري. علما أن الاستجابة العصبية يحاكي بشكل وثيق التشريد الفك مشيرا إلى أن هذه الخلايا العصبية الحسية خاص يوفر التغذية الراجعة ذات الصلة لوضع الفك السفلي. الشكل 3 هي صورة تضخم عالية من محور عصبي ملطخة intracellularly جنبا إلى جنب مع تلوين وصمة عار للsynaptophysin a نيسل. لاحظ colocalization من synaptophysin (الصفراء) داخل حبة محوار. الشكل (4) هو الرسوم المتحركة من خلية عصبية واحدة ، تتميز من الناحية الفسيولوجية وصفت intracellularly.
الشكل 1. نظرة عامة على الأسلوب. العلوي الأيسر : النزوح الفك السفلي. بين الخلايا تسجيل الأوسط (الأخضر) واحد من الخلايا العصبية (الصفراء). أعيد بناؤها في التشكل من هذه الخلايا العصبية بعد تسجيل داخل الخلايا وحقن. مخطط الحمراء يشير موقع نواة المحرك الثلاثي التوائم. اليسرى السفلى : الاستجابة الفسيولوجية لهذه الخلايا العصبية أثناء حركة الفك.
الشكل 2. الاستجابة الفسيولوجية ممثل إحدى الخلايا العصبية الحسية عضلة واحدة سجلت في الجسم الحي أثناء حركة الفك السفلي. لاحظ التشابه في استجابة الخلايا العصبية مع التشرد الفك.
الشكل 3. الطرفية تشجر محواري متشابك مع حبات (تورمات حمراء) من خلية عصبية intracellularly الملطخة الحسية التي استجاب بها أثناء التحقيق في العضلات. تجهيز immunocytochemical اللاحقة لتوطين synaptophysin يظهر synaptophysin داخل حبة محواري (الصفراء). الأخضر هو نيسل الفلورسنت وصمة عار.
الشكل 4. رسوم متحركة من العضلات المغزل الابتدائية محوار عصبون وارد الاستجابة الفيزيولوجية التي تم تسجيلها في الجسم الحي أثناء حركة الفك السفلي ، وكان محور عصبي الملون ثم intracellularly ومعالجتها للالتصور.
تحميل الفيديو عالية الدقة من هنا الشكل 4
تحميل الفيديو القرار المتوسطة من هنا الشكل 4
يتضح الأسلوب هنا هو أسلوب القوية التي توفر نظرة متبصرة في وظيفة الخلايا العصبية واحد ، وكيف أن استجابة الخلايا العصبية الفردية يساهم في الدوائر العصبية 9 هذه المعرفة أمر أساسي لفهم الوظيفة الحسية. أعظم قوة هذا الأسلوب هو أن يسمح بتحديد عدد كبير من المعلمات حول الخلايا العصبية بما في ذلك علم وظائف الأعضاء ، والتشكل مورفولوجيا متشابك والتوزيع. عند دمجها مع تقنيات أخرى مثل وضع العلامات العصبية الوراء معلومات إضافية مثل الدارات العصبية يمكن وصفها. 7،8 وهناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو أنه يمكن تعلمها في الخطوات التالية. على سبيل المثال ، يمكن أن تتم داخل الخلايا تسجيل في البداية ، يليه تلطيخ الخلايا مع كيمياء سيتولوجية مناعية أو العلامات العصبية إلى الوراء وأضاف بعد التمكن من الأسلوب الأول. ربما كان أكبر من الحد من هذه التقنية هو أنه يمكن أن توصف سوى عدد قليل من الخلايا العصبية في أية تجربة واحدة. عادة ما وصفت في البداية 2-3 من الخلايا العصبية اكتب فسيولوجية معينة. مرة واحدة وضعت العلاقة المحتملة بين الفيزيولوجيا وعلم التشكل ، وتستخدم مزيد من التجارب للتأكد من هذه العلاقة بدقة في التجارب التي تتم تسمية فقط عصبون واحد.
الخطوة الأكثر أهمية لنجاح هذا الأسلوب هو الحفاظ على الاستقرار تسجيل الكهربية داخل الخلايا. إن الاستقرار تسجيل تختلف اختلافا كبيرا تبعا للموقع داخل الدماغ من الخلايا العصبية قيد الدراسة ولكن يمكن استخدام عدد من المعالجات لزيادة الاستقرار التسجيل. يمكن إجراء استرواح والحيوان التهوية بشكل مصطنع للحد من نبضات الجهاز التنفسي. ويمكن زيادة مزيد من الاستقرار من خلال تطبيق الضغط الايجابي نهاية الزفير من حوالي 1 سم 2 O. H عند الوصول إلى المنطقة ذات الاهتمام داخل الدماغ ، يمكن تعزيز الاستقرار من خلال المتنافسة الحيوان من خلال خفض حجم الجهاز التنفسي وزيادة معدل التنفس. وقد طبقت بعض الدراسات الكهربية آغار دافئة على الدماغ ومقنى المثانة ، وهذه الإجراءات لم تكن فعالة في زيادة الاستقرار تسجيل العصبية في الدماغ. ومن المهم أن نشير إلى أن الحقن مرة لا تحتاج إلى أن تكون طويلة. ويمكن الحصول على نتائج جيدة مع أوقات حقن حوالي 5 دقائق. نظرا لحجم صغير من طرف microelectrodes ، كسر القطب داخل الدماغ عادة لا تنتج بيان كبير من التتبع. ولذلك يمكن الاستعاضة عن القطب والخلايا العصبية بنجاح وسجلت الملون داخل ميكرون عدة مئات من مكان الكسر الكهربائي. إذا كان انسداد القطب أو الحل لا تملأ تسجيل غيض من القطب على نحو كاف ، سيتم زيادة كبيرة في الضوضاء وينبغي الاستعاضة القطب. اختبار مقاومة الكهربائي قبل الإدراج في الدماغ الكهربائي يقلل إلى حد كبير مساحات غير منتجة وتوفير الوقت. إذا كنت تحاول سجل من منطقة صغيرة في الدماغ لتحديد المواقع التجسيمي هو الهدف الأسمى. يمكنني استخدام التلسكوب تعلق على طاولة التسجيل للحفاظ على الصفر الثابتة التجسيمي. التلسكوب مفيد جدا لأنه يمكن أن يوضع القطب الكهربائي في حامل تعلق على طاولة التسجيل ثم ينظر تحت التكبير. يسمح هذا الموضع دقيقة جدا من microelectrode والتصفير من الأقطاب الكهربائية الاستبدال.
وقد استخدم عدد من الدراسات الحديثة العلامات العصبية juxtacellular. إخراج 11،12 بهذه الطريقة يتم وضع قطب كهربائي في القرب من إحدى الخلايا العصبية على أساس خصائص تسجيل العصبية والتتبع العصبية. مشكلة محتملة واضحة مع هذا الأسلوب هو وضع العلامات الزائفة منذ يمكن إدراجها في التتبع والتشعبات المحاور الأخرى من الخلايا العصبية في المناطق القريبة من القطب. بالإضافة ، لا يمكن أن العلاقات بين المدخلات والمخرجات من الخلايا العصبية يمكن تحديدها بسبب يمكن توليد إمكانات العمل المسجلة خارج الخلية ليس فقط عن طريق إدخال متشابك إلى الخلايا العصبية ولكن عن طريق خصائص ذاتية في الخلايا العصبية. مع أسلوب ذكرت هنا ، وصفت الخلايا العصبية فقط بينما هو في الواقع microelectrode داخل الخلايا العصبية ، وبالتالي ليس هناك أي غموض بشأن إسناد نشاط الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية الملون. هذا مهم بشكل خاص عند وضع العلامات المحاوير لأن حركة microelectrode من النتائج ميكرون قليلة في وضع العلامات الزائفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تسجيل الأحداث دون العتبي بما في ذلك إمكانات متشابك من الخلايا العصبية مخوزق.
ويمكن الجمع بين الدراسات المستقبلية مع هذا الأسلوب أثار حركات. على سبيل المثال يمكن تحفيز حركات المضغ تستثير القشرية والاستقرار داخل الدماغ تسجيل يجب السماح تسجيل داخل الخلايا والخلايا العصبية من خلال تلطيخ هذه الحركات أثار. منذ يمكن القيام به هذه التقنية مع الحد الأدنى من التدخل الجراحي ، قد يكون أيضا possible لاستخدام هذه الطريقة لإدخال المواد التي تغير الجينات في الجسم الحي.
أشكر انتوني تايلور لتدريب أولي في داخل الخلايا الحية في تسجيل وماكسويل وبراون وديفيد للمساعدة في التطوير الأولي للتقنية تلوين داخل الخلايا. أشكر السيد فضة للمساعدة في الماكرو collocalization. كثير من العلماء الذين تعاونت أنا قدمت رؤية في تطوير هذه التقنية بما في ذلك دونجا R. ، Moritani M. ، P. لوه ، Ambalavanar ر. وقد تم تطوير هذه التقنية مع دعم كبير من المعاهد الوطنية للصحة DE10132 المنح ، وDE15386 RR017971.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف أو المعدات | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
---|---|---|---|
الكهرومغناطيسية هزاز | لينغ الديناميكية نظم | V101 | |
إشارة مولد | نظم التغذية المرتدة | PFG605 | قادرة على انتاج رباعي إشارة الخرج |
زجاج كهربائي | سوتر الآلات | AF100 - 68-10 | مع خيوط |
القطب مجتذب | سوتر الآلات | طراز P - 2000 أو P - 80 | |
biotinamide | ناقلات مختبرات | SP - 1120 | المخزنة في 4 درجات مئوية |
تكساس الأحمر أفيدين DCS | ناقلات مختبرات | A - 2016 | |
tetramethlyrhodamine | المسابر الجزيئية | D - 3308 | 3000 الوزن الجزيئي ، ليسين يمكن حلها |
الماوس المضادة للأجسام المضادة synaptophysin | Chemicon | MAB5258 | |
الفلورسنت وصمة عار نيسل | Neurotrace ، المسابر الجزيئية | N - 21480 | |
فاحص كهربائي | ونستون إلكترونيات | BL - 1000 - B | لقياس المعاوقة الكهربائي |
المكهار أداة | محوار الآلات | Axoprobe 1A ، 2B Axoclamp |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved